Synaptische plasticiteit opnemen in Acute Hippocampal plakjes onderhouden in een kleine volumes Recycling-, perfusie-, en onderdompeling-type kamer systeem

Het algemene doel van deze procedure is om een methode te bieden om vereenvoudigde middelen te garanderen voor de carbogenatie van kleine volumerecycling ACSF en om langdurige opnames van veldpotentiaal te bereiken met behulp van een opnamekamer gemonteerd op een fluorescentiemicroscoop. Deze methode kan ons helpen de belangrijkste vragen te beantwoorden op het gebied van neuroplasticiteit met betrekking tot de onderliggende ligninepaden die de synaptische transmissie en de vorming van geheugen in een cellulaire modus van leren en herinneringen reguleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het helpt om het zuurstofniveau van een kleine bio reservoir te stabiliseren om de kostenefficiëntie van de experimenten met specifieke antagonisten of agonisten te verbeteren.

De voorbereiding van de acute hippocampusslices wordt gedemonstreerd door de promovendi, Xia en Weiguang van ons laboratorium. Om deze procedure te beginnen, gebruikt u een koude chirurgische kling om een stuk van de dorsale cortex te dissecteren in een hoek van 70 graden langs de dorsale rand van elke hemisfeer. Met een koude tandheelkundige cementspatel, brengt u elk hemisfeer over naar een stuk filterpapier om het oppervlak kort te drogen.

Monteer de twee hemisferen met vers gesneden oppervlakken op de ijskoude snijvlakken met behulp van sneldrogende lijm, zodat het caudale uiteinde van de hemisferen naar de scheermesjes gericht is. Plaats vervolgens de snijvlakken in de koelkamer van een vibratoom. Vul de kamer met de snijvlakkenbuffer bij twee tot vier graden Celsius en carbogeneer deze.

Snijd daarna 350 micrometerslices met behulp van geschikte vibratoominstellingen. Isoleer de hippocampusformatie van het subiculum en de entorhinale cortex met behulp van twee injectiekanules als schaar. Verwijder de luchtbellen van het slice-houdende gaas van de eerder bereide incubatiekamer met behulp van een Pasteurpipet.

Breng vervolgens de slices die enige transparantie vertonen bij de stratum pyramidale van de snijplatform op het gaas van de incubatiekamer met een Pasteurpipet met een grote mond. Voeg in deze stap een driewegsbuisconnector toe aan de uitstroom van het recyclagesysteem. Verbind de middelste arm van de driewegsbuisconnector met een carbogentoevoerbuis en regeleer de stromingssnelheid met een luchtstroomsmeter.

Voeg daarna een tweede driewegsbuisconnector toe aan de instroom van het recyclagesysteem. Verbind de middelste arm met de buis die naar de inline-verwarming gericht is, de bovenarm met een dunne siliconenbuis en de onderarm met de instroombuis van het reservoir. Plaats vervolgens een buisklemmer op een dunne siliconenbuis op een positie langs de buis waar de pulsatie van de ACSF in de slicekamer gegenereerd door de peristolische pomp op zijn minimum is.

Druk nu een klein stukje lensreinigingspapier en een nylongaas vastgemaakt aan een U-vormige platinadraad een paar minuten in de onderdompelingslicekamer. Verwijder vervolgens de U-vormige platinadraad. Schakel de recyclage uit en plaats een slice op het lensreinigingspapier.

Plaats vervolgens onmiddellijk het slice-houdende gaas bovenop de slice. Schakel de pomp in en laat de slice gedurende 30 minuten gelijkmatig verdelen zonder het objectief in ACSF te dompelen. Vul ondertussen de opname-elektrode met ACSF en monteer deze in de pijphouder.

Controleer de isolatie van de metalen stimulatie-elektrode door deze in natriumbicarbonaat-oplossing te plaatsen. Verbind de elektrode met de negatieve pool van een DC-spanningsgenerator en observeer de vorming van bubbels aan de punt onder een dissectiemicroscoop. Plaats vervolgens de geteste apoxi-geïsoleerde wolfraamstimulatie-elektrode in de manipulatorhouder en de referentiedraden in de slicekamer.

Voeg een tweede referentie-elektrode toe aan de kamer en verbind deze met de referentie-aansluiting van de hoofdtrap van de opname-elektrode. Klik in de versterkercontrolesoftware op de nulklampmodusbox en dubbelklik vervolgens op de uitgangsversterkingslijstbox. Kies een versterking van 100, dubbelklik op de hoge doorslaaffilterboxvat, kies drie kilohertz en dubbelklik op de lage doorslaaffilterlijstbox AC om 0,1 hertz te kiezen.

In de opnamesoftware klikt u op verkrijgen, protocol openen. Kies een protocol dat de instellingen toestaat voor episodische stimulaties en de digitalisering van versterkte potentiaal bij 10 tot 20 kilohertz gedurende 50 tot 100 milliseconden en dat automatisch een stimulusisolator 10 milliseconden na het begin van een episodische opname activeert. Plaats de stimulatie- en opname-elektroden in lijn en parallel aan het stratum pyramidale.

Klik vervolgens op verkrijgen, bewerk protocol en kies het triggertabblad in het pop-upvenster. Klik op het triggerbronvak en kies spatiebalk als de triggerbron. Klik vervolgens op de ok-knop en klik op de opnameknop om de opname te starten.

In de stimulusisolatorsoftware klikt u op het spanningscontrolevak en voert u nul in. Klik op de downloadknop. Klik vervolgens op het venster van de opnamesoftware en druk op de spatiebalk.

Herhaal deze cyclus door opeenvolgende waarden in te voeren van 1000 tot 8000. Correleer de stimulatiesterkte met FEPSP-hellingswaarden en bepaal de stimulatiesterkte die nodig is om 40% van de FEPSP-hellingsmaximum te bereiken. Klik op het spanningscontrolevak en voer de bepaalde waarde in.

Klik vervolgens op de downloadknop. Klik in de opnamesoftware op de stopknop en vervolgens op het verkrijgmenu. Klik op bewerk protocol en kies het triggertabblad in het pop-upvenster.

Klik vervolgens op het triggerbronvak en kies de interne timer als de triggerbron. Klik op de ok-knop, gevolgd door de opnameknop die de automatische opname van veldpotentiaal om de 60 seconden start. Klik op de stopknop na 30 tot 60 minuten.

In de opnamesoftware klikt u op verkrijgen, opent u het protocol en kiest u hetzelfde protocol als de baseline-opname. Klik op de ok-knop en klik vervolgens op opname. Houd de veldpotentialopnames automatisch twee tot vier uur lang draaiend.

Wanneer het klaar is, klikt u op de stopknop om de opname te beëindigen. Deze figuur toont de representatieve opnames van activiteitsafhankelijke potentiëring van synaptische