Verbetering van de toepassing van ultrahoog moleculair gewicht biotinyleerd Dextran Amine voor Thalamocortical projectie traceren in de Rat

Het algemene doel van deze video is om een verfijnd protocol te demonstreren voor de toepassing van BDA met hoog molecuulgewicht voor het bestuderen van de optimale neurale markering in het centrale zenuwstelsel. Deze maatregel kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van neurale netwerken te beantwoorden. Door de framestructuur van neurale markering te visualiseren via neurale circuits.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de mogelijkheid biedt om lokale neurale circuits en hun chemische kenmerken te starten. Bereid een microliter microsyringe voor, uitgerust met een glazen micropipet, en test het door vloeibare paraffine op te trekken. Nadat de rat is geanesthetiseerd volgens een goedgekeurd protocol, bevestig diepe anesthesie door de afwezigheid van reactie op een staartprik.

Scheer vervolgens de bovenkant van het hoofd van het dier met een elektrische scheerapparaat en schrob de operatieplaats met 10% povidone jodium, gevolgd door 70% ethanol. Bevestig de rat in het stereotactische apparaat door stompe oorbalken in de oren te steken en de bovenste snijtanden van de rat in de mukhouder te plaatsen. Breng een oftalmische zalf aan op de ogen.

Gebruik steriele chirurgische handschoenen en kleed om steriele omstandigheden te handhaven. Reinig de hoofdhuid van de operatieplaats opnieuw met 70% ethanol. Nadat een sagittale incisie in de huid met een scalpel is gemaakt, langs de sagittale sutuur, gebruik steriele wattenstaafjes om de spier en periosteum van de schedel te schrapen.

Gebruik vooraf gedefinieerde coördinaten uit een atlas om de locatie voor de craniotomie te bepalen. Voer een craniotomie uit met een boormachine met een ronde bits om tot ongeveer een millimeter diepte te boren tot de hersenvliezen zichtbaar zijn. Verwijder de dura mater met micro forceps om de cerebrale cortex boven de injectieplaats bloot te leggen.

Verwijder de vloeibare paraffine uit de microsyringe en trek vervolgens 10% BDA-oplossing op. Monteer de spuit in het micro-injectieapparaat en sluit de micropomp aan. Onder een stereomicroscoop manipuleer het micro-injectieapparaat.

Breng de gevulde glazen micropipet door het corticale oppervlak van de hersenen in de VPM, tot een diepte van 5,8 millimeter. Gebruik vervolgens de micropomp om 100 nanoliter van 10% BDA onder druk in de VPM te injecteren gedurende een periode van drie minuten. Trek na vijf minuten langzaam de pipet terug.

Naai de wond met steriele draad dicht, plaats vervolgens de rat in een warm herstelgebied, totdat het bewustzijn terugkeert en volledig hersteld is. Na het euthanaseren van de rat, gebruik schaar en tang om de borstholte van de rat te openen en toegang tot het hart te krijgen. Breng een intraveneuze katheter in in de linker ventrikel, richting de aorta, en open vervolgens het rechter oortje.

Perfuseer eerst met 0,9% zoutoplossing bij fysiologische temperatuur, gedurende ongeveer één tot twee minuten, totdat het bloed dat uit het hart komt helder is. En ga vervolgens verder met 250 tot 300 milliliter 4% paraformaldehyde, in 0,1 molaire fosfaatbuffer. Post-fixeer de gedissekteerde hersenen in 4% paraformaldehyde gedurende twee uur bij kamertemperatuur.

Breng vervolgens de hersenen over naar 30% sucrose in 0,1 molaire PBS en cryoprotecteer gedurende drie dagen bij vier graden Celsius. Na drie dagen, wanneer de hersenen in de oplossing zijn gezonken, verdeel de hersenen in drie blokken in de coronale richting met behulp van een hersenmatrix. Het centrale blok bevat de ventrale posteromediale kern van de thalamus in de primaire somatosensorische cortex.

Monteer het centrale blok van de hersenen op de vriesfase van de glijdende microtoom voor secties in de coronale vlak en snijd bij 40 micron wanneer bevroren. Verzamel de secties in een zes-putjes plaat, bevattende 0,1 molaire PBS. Begin met kleuring door de secties ongeveer een minuut in 0,1 molaire PBS te spoelen met wiebelen.

Breng vervolgens de secties over naar een gemengde oplossing van streptavidin-AF594 in AF500/525 groen fluorescerende Nissl-kleurstof in 0,1 molaire PBS bevattende 0,3% Triton X-100, en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Na het kleuren, was de secties drie keer in 0,1 molaire PB met wiebelen. Monteer de secties op de microscoopglazen met behulp van standaard histochemische technieken.

Laat de secties ongeveer een uur luchtdrogen. Breng 50% glycerine in gedistilleerd water aan op de thoreescente secties en bedek ze met een dekglas voordat de dia's worden afgebeeld. Deze representatieve fotomicrograaf toont de injectieplaats van BDA in rood van de ventrale posteromediale kern van de thalamus op de achtergrond van groene Nissl-kleuring.

Thorescente BDA-kleuring wordt hier getoond, inclusief thalamyl corticol axonen in laag vier en corticale thalamus neuronen in lagen vijf en zes. Ter vergelijking, toont deze fotomicrograaf dat conventionele BDA-kleuring met een standaard avidine-biotine peroxidase procedure een vergelijkbaar patroon van neurale markering onthult als thoreescente BDA-kleuring. Deze hogere vergrotingsweergave van een thoreescente BDA-gelabelde sectie toont de anterograad gelabelde axonale arbors in detail, in rood.

De retrogradelijk gelabelde neuronale cellichaam, dendrieten en dendritische stekels worden hier in detail getoond. Eenmaal beheerst, kunnen craniotomie en stereotactische injectie in 20 tot 30 minuten worden uitgevoerd, als het goed wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u BDA met hoog molecuulgewicht kunt toepassen om neuronale verbindingen en gedetailleerde structuur van neurale markering te herstellen.