EEN

Het algemene doel van deze op voedingsstatus gebaseerde koperaversietest is om nematoden te evalueren die reageren op een aversieve chemische stof en een voedselbron gedurende een periode van vier uur. Dit maakt een gelijktijdige evaluatie van de voedingsstatus mogelijk. Deze methode kan het veld van de gedragsneurowetenschap helpen door mutanten te identificeren die falen in het moduleren van locomotorische patronen en reacties op een aversieve chemische stof ondanks hongercondities.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gedurende een langere periode kan worden uitgevoerd, wat voedingsstatusanalyse mogelijk maakt naarmate wormen gedurende vier uur steeds meer uitgehongerd raken. Om experimentele organismen voor de test voor te bereiden, pluk 10 L4-stadium nematoden per stroom, 24 uur voordat de test begint, om ervoor te zorgen dat de organismen jonge volwassenen zijn wanneer ze worden getest. Voor elke geteste mutante of controle-nematode, pluk 10 L4's.

Houd L4-organismen gedurende 24 uur op standaard agarplaten gezaaid met OP50 E.Coli. 24 uur voor de test, gebruik een liniaal en een dikke permanente marker om een lijn te trekken op de onderkant van een eerder voorbereide nematode groeimedia of NGM-plaat langs de buitenrand. Markeer een middellijnbarrière op gelijke afstand van elke rand van de plaat.

Bedek de plaat met 50 microliters OP50 E.Coli aan slechts één kant van de koperbescherming om een uniform gazon te creëren. Gebruik de gemarkeerde lijnen op de onderkant van de plaat om ervoor te zorgen dat de bacteriën de koperbelasting niet raken. Zorg ervoor dat de koperbelasting de rand van de plaat bedekt en een middenlijnbarrière vormt en breng de bacteriën over zodat de koperbelasting de voedselbron niet raakt.

Markeer een tweede set platen zonder OP50 E.Coli om als negatieve controle te dienen. Laat de bacteriën drogen en incubeer de platen vervolgens een nacht bij 37 graden Celsius. Zorg ervoor dat de bacterieplekken niet worden verstoord bij het overbrengen van de nematoden naar een 37 graden Celsius incubatiekast.

Overmatige verstoring kan de locatie of vorm van de voedselplek veranderen. Na overnachting, verwijder de platen uit de incubatiekast en gebruik de gemarkeerde onderkant van de plaat als gids, pipet 100 microliters vers bereide 0,5 molaire koper(II)sulfaatoplossing op de rand van de agar om een buitenste koperbescherming te creëren. Pipet 25 microliters van de koper(II)sulfaatoplossing om een middellijnbarrière te creëren.

Zorg ervoor dat de koper(II)sulfaatoplossing de bacterieplek niet raakt en laat de koperbelasting opdrogen op de plaat. Controleer elke vijf minuten na overdracht op droogheid, met een laboratoriumdoekje door de oplossing lichtjes te deppen bij de rand van de plaat om te onderscheiden. Direct voorafgaand aan de test, breng de experimentele organismen over naar een bacterievrije agarplaat en laat de nematoden een minuut vrij bewegen om overtollig bacteriën te verwijderen.

Pipet vervolgens een milliliter M9 op de plaat met jonge volwassenen, die 24 uur eerder werden overgebracht om wormen in een microcentrifugebuis te wassen. Centrifugeer de nematoden gedurende één minuut bij 3.000 x G. Wormen moeten een pellet vormen op de bodem van de buis.

Zuig de M9-oplossing af zonder de wormpellet te verstoren. Voeg een milliliter M9-oplossing toe aan de wormpellet. Draai de buis om om wormen met de oplossing te mengen.

Als er aanvankelijk overtollig bacteriën met de wormen zijn overgebracht, herhaal dit in totaal vijf keer. Na de laatste wasbeurt, zuig de supernatant af tot er 100 microliters M9-oplossing en de wormpellet overblijft. Breng wormen onmiddellijk van de oplossing over zodra het wassen is voltooid.

Pipet 20 microliters van de wormpellet van de bodem van de buis op de bacterievrije helft van de testplaat, zorg ervoor dat 10 wormen worden overgebracht naar de testplaat en dat er geen besmettend voedsel aanwezig is. Er mogen geen bacteriën worden overgebracht naar de kopervoedselraceplaten. Verwijder overtollig M9-oplossing van de nematoden met een laboratoriumdoekje binnen een minuut.

Zorg ervoor dat de M9-oplossing de koperbelasting niet raakt en dat de wormen en agaroppervlak intact blijven. Gooi wormen weg die per ongeluk met het laboratoriumdoekje zijn verwijderd. Zodra de M9-oplossing is verwijderd en alle wormen zijn begonnen met niet-vloeibare locomotorische patronen, dwz wanneer ze zijn gestopt met rondslingeren.

Start de teststopwatch, als er per ongeluk extra wormen zijn opgenomen, verwijder ze door ze te plukken met halocarbonolie om ervoor te zorgen dat er geen bacteriën aan de plaat worden toegevoegd. Controleer de testplaten elke 30 minuten. Voor de testplaten met bacterieplekken, scoor organismen positief als ze de voedselplek bereiken gedurende een periode van vier uur.

Voor de negatieve controleplaten, scoor organismen positief als ze de barrière hebben overgestoken. We gebruikten de N2 en npr-9 verlies van functie mutant en een npr-9 overexpressiestrain, aangeduid als npr-9 functiewinst, om de reacties op honger en koperaversie te evalueren. Aan het einde van de test, verplaatste 100% van de wildtype organismen zich naar de voedselbron, terwijl de npr-9 overexpressie-organismen geen locomotorische patronen moduleerden als reactie op voedsel en de aversieve barrière bleven oversteken, zelfs na contact met de voedselbron.

Op een voedselvrije plaat, n2 of npr9 verlies van functie organismen staken zelden de koperbescherming over, terwijl de npr-9 overexpressie nematoden herhaaldelijk de barrière heen en weer staken. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om de koperbescherming niet te verstoren bij het overbrengen van nematoden en M9 en om consistente omstandigheden voor elke stam te handhaven om verwarrende factoren te voorkomen.