Bepaling van de optimale chromosomale locatie (s) voor een DNA Element in Escherichia coli met behulp van een nieuwe benadering van Transposon-gemedieerde

Het algemene doel van dit experiment is om de optimale chromosomale positie van elk gegeven DNA-element te bepalen door middel van transposon-gemedieerde willekeurige insertie, concurrentie-experimenten en volledige genoomsequencing. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van DNA-replicatie, zoals de belangrijkheid van een chromosomale locatie van een genetisch element. Het voordeel van deze techniek is dat het transposon-gebaseerde willekeurige insertie koppelt met de selectie van de fittste kloon door groeivoordeel.

Hier, het wordt vereenvoudigd door de E.coli DARS2-regio. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de chromosomale organisatie van Escherichia coli, kan het ook worden toegepast op andere bacteriën. Na het voorbereiden van elektrocompetente cellen zoals MG1655 delta DARS2 volgens het tekstprotocol, voeg je een microgram van pNKBOR DARS2 toe aan 40 microliter cel en breng de mengsel over naar een voorgekoelde steriele 0,2 centimeter-spleet cuvette.

Plaats de cuvette in de elektroporatiekamer. Vervolgens, elektroporeer de cellen bij 18 kilovolt, 500 ohm en 25 microfarad. De tijdconstante zou ongeveer vijf milliseconden moeten zijn en er mag geen boogvorming optreden.

Herstel snel de bacteriële suspensie door deze op te schorsen in één milliliter voorverwarmd LB-bouillon en breng over naar een 15-milliliter testbuis. Incuber de cellen onder aërate groeicondities bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten zonder antibiotica-selectie. Vervolgens, plateer de bacteriën op de LB-agar platen aangevuld met 50 microgram per milliliter kanamycine en incubeer de platen bij 37 graden Celsius overnacht.

De volgende dag, tel de kolonies van de elektroporatie. Eén kolonie wordt beschouwd als gelijk aan één chromosomale transposon-insertie. Voeg één milliliter LB-bouillon toe aan elke plaat en was alle kolonies weg.

Hergebruik dezelfde één milliliter LB-bouillon om de bacterieconcentratie te verhogen. Vervolgens, pool alle kolonies in dezelfde 50-milliliter buis. Vortex de buis om het startmateriaal te bevriezen en meng één milliliter celsuspensie met één milliliter van 50% glycerol op ijs.

Breng de buizen over naar droog ijs gedurende 10 minuten. Zodra de culturen bevroren zijn, breng ze over naar een vriezer van min 80 graden Celsius. Ontdooi de transposonbibliotheek van min 80 graden Celsius op ijs.

Meng door pipetteren, vervolgens breng 100 microliter van de transposonbibliotheek over naar 10 milliliter LB in een 15-milliliter testbuis. Laat de cellen groeien met continu schudden bij 37 graden Celsius gedurende acht uur tot stationaire fase. Pas de parameters aan naar wens aan verschillende groeicondities.

Om de bacteriële populatie ongeveer elke 10 generaties te propageren, breng 10 microliter van de eerder stationaire fase over naar 10 milliliter vers voorverwarmd medium en laat de cultuur groeien voor nog eens acht uur tot stationaire fase. Na elke 100 generaties concurrentie, bewaar vijf een-milliliter monsters en bewaar ze in min 80 graden Celsius. Bereid de sonde voor de Southern blot tegen een een-kilobyte sectie van de NKBOR voor door PCR-amplificatie met behulp van specifieke primers zoals hier vermeld.

Voer de monsters uit met behulp van het volgende programma. Label het resulterende PCR-fragment met P32-gelabelde dATP met behulp van het willekeurige primer systeem volgens Smith en bereid totaal cellulair DNA voor volgens het tekstprotocol. Digest het totale cellulaire DNA met Pvul dat NKBOR bevat die de regio van belang buiten een regio dekt die door de sonde wordt bedekt.

Voer een Southern blot uit met behulp van 0,7% agarosegel volgens Loebner-Olsen en von Freiesleben. Om eenvoudige genwandeling te gebruiken om DARS2-insertieplaatsen van enkele klonen te identificeren, isoleer na 700 geschatte generaties concurrentie genomisch DNA voor de PCR-sjabloon door eerst bacteriën op een LB-agarplaat te verspreiden en een nacht bij 37 graden Celsius te incuberen. Inoculeer LB-bouillon met enkele kolonies en laat ze een nacht bij 37 graden Celsius groeien.

Breng vervolgens 20 microliter over naar 200 microliter geautoclaveerd gedestilleerd water. Vortex de kolonies in oplossing, vervolgens verwarm de mengsel bij 100 graden Celsius gedurende 10 minuten. Centrifugeer de monsters bij maximale snelheid gedurende vijf minuten, vervolgens bewaar de cellysaat bij min 20 graden Celsius voor toekomstig gebruik.

Ontwerp vervolgens drie geneste primers om binnen de transposon van keuze te anneler zoals hier getoond. Gebruik 200 nanogram genomisch DNA, geneste primer een en een willekeurige primer om een 20-microliter PCR-reactie voor te bereiden. Vervolgens, voer de monsters uit met behulp van het volgende programma.

Voor de tweede amplificatie, gebruik één microliter van de eerste reactie als sjabloon en gebruik geneste primer twee en dezelfde willekeurige primer. Voer een derde reactie op een vergelijkbare manier uit met geneste primer drie, dezelfde willekeurige primer en één microliter van de tweede reactie als sjabloon. Voer de producten van de laatste PCR-reactie uit op een 1,5% agarosegel en statin met ethidiumbromide.

Snij een band uit in het bereik van 100 tot 800 basenparen en isoleer het DNA met behulp van elke commerciële DNA-gelextractiekit volgens de richtlijnen van de fabrikant. Om flowcytometrie uit te voeren, balanceer elke bacteriecultuur door het in de exponentiële groeifase te houden gedurende minimaal 10 generaties. Meet de OD600 en zorg ervoor dat deze nooit 0,3 overschrijdt.

Om rifampicine run-out uit te voeren volgens het tekstprotocol, breng één milliliter cultuur over naar een 15-milliliter buis met 30 microliter RIF-CEF. Incuber de buis bij 37 graden Celsius met schudden gedurende minimaal vier uur. Voor het EXP-monster, breng één milliliter van exponentieel groeiende cultuur over naar een 1,5 milliliter buis op ijs.

Vervolgens, oogst de cellen door centrifugatie bij 15.000 keer G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Hersuspensieer het pellet in 100 microliter ijskou