Een hydroponisch co-cultuursysteem voor gelijktijdige en systematische analyse van plant- / microbe moleculaire interacties en signalering

Het algemene doel van dit systeem is om de wederzijdse signaalwisseling en reacties tussen plant en micropartners of plantreacties op chemicaliën of abiotische factoren te bestuderen in een eenvoudige experimentele opstelling die het natuurlijke milieu nauwgezet nabootst. Deze video toont co-cultivatie van planten met de Agrobacterium tumefaciens-bacterie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in microbiële interacties van planten, stressreacties van microben of planten, en bij moleculaire signalering, inclusief complexe signaaloverdracht zelfs in een vroeg stadium van microbiële interacties van een plant.

Het grootste voordeel van deze techniek is dat het helpt om de aard van signaaloverdracht en reactie van microbiële interacties van planten te begrijpen, in een eenvoudige set-up die de nabootsing van het natuurlijke milieu omvat. Hoewel deze methode kan worden gebruikt om inzicht te krijgen in plantinteracties met een enkele microbiële soort, kan het ook worden gebruikt om plantinteracties met meerdere microbiële soorten of met abiotische factoren te bestuderen. We hadden het idee voor deze methode tijdens het zoeken naar celsignaleringshomeostase tijdens plantmicrobe-interacties die natuurlijke situaties nauwgezet nabootsen.

Om het experiment te beginnen, moeten de zaden worden gesteriliseerd. Voor Arabidopsis thaliana, combineer ongeveer 200 zaden met 500 microliter gedeïoniseerd water in een microcentrifugebuis en vortex de buis op hoge snelheid. Centrifugeer de buis gedurende 30 seconden bij 9000 x g in een tafelmicrocentrifuge.

Verwijder met een pipet het watersupernatant. Voeg vervolgens 300 microliter 2% natriumhypochloriet toe aan de zaden en vortex ze. Laat het mengsel op kamertemperatuur bezinken.

Na één minuut centrifugeert u de zaden. Verwijder met de pipet de natriumhypochlorietoplossing. Voeg vervolgens 500 microliter steriele, gedeïoniseerde water toe aan de zaden en vortex het mengsel.

Na het centrifugeren van de buis, verwijdert u het water. Voeg 500 microliter 70% ethanol toe aan de zaden en vortex het mengsel. Laat de zaden een minuut bezinken en centrifugeer vervolgens de buis.

Verwijder de 70% ethanol met een pipet. Was de zaden vijf keer met 500 microliter steriele, gedeïoniseerde water. Suspensieer vervolgens de gesteriliseerde zaden in 500 microliter steriele, ultrazuivere water.

Pour 25 milliliter half sterk Murashige en Skoog of MS-medium met 04% fytoagar in elke steriele, diepe petrischaal. Snijd voor elke petrischaal een 90 millimeter bij 90 millimeter vierkant van roestvrij staal gaas. Buig de hoeken van elk gaasvierkant net genoeg zodat het gaas past in de petrischaal.

Buiig de hoeken in een hoek van 90 graden naar de bulk van het gaas om het gaas te laten steunen door de hoeken, waardoor er voldoende ruimte onder is voor wortelontwikkeling. Leg de gesneden gaasvierkanten in een beker en bedek ze met aluminiumfolie. Steriliseer de gaasvierkanten door autoclaaf te gebruiken met een droge cyclus van 30 minuten.

Zodra het medium is gestold in de petrischalen en het gaas steriel is, plaatst u elk gaasvierkant op het vaste medium met de gebogen hoeken naar beneden. Duw het gaas zodat de hoeken het medium penetreren en de bulk van het gaas de bovenkant van het medium raakt. Gebruik vervolgens een steriele 200 microliter pipet om de individueel oppervlakte-gesteriliseerde A thaliana zaden te trekken en breng elke zaad voorzichtig op het gaas over.

Plaats de zaden zodat ze zijn uitgerust volgens de plantensoort en experimentele behoeften. Sluit de petrischalen met deksels en plaats poreus chirurgisch plakband rond de randen van de platen. Wikkel de zaden in aluminiumfolie.

Stratificeer de zaden door de hele petrischaal te plaatsen. Na twee dagen, cultiveer de zaden in de petrischaal bij 22 tot 24 graden Celsius met een fotoperiode van 16 uur gedurende 10 tot 14 dagen. In een gesteriliseerde flowhood, giet 18 milliliter autoclaveerbaar vloeibaar MS-medium in steriele cilindrische glazen tanks met steriele deksels.

Gebruik vervolgens steriele pincetten om voorzichtig elke gaasvierkant met 10 tot 14 dagen oude zaailingen van de petrischaal van semi-vast medium over te brengen naar een hydroponische cilindrische tank. De zaailingen die hier getoond worden zijn luzerne. Sluit de deksels op de tanks met behulp van poreus chirurgisch plakband.

Vervolgens cultiveert u de zaailingen bij 22 tot 24 graden Celsius met een fotoperiode van 16 uur en schudden bij 50 rpm. Voorafgaand aan de inoculatie, onderzoekt u de tank met zaailingen zorgvuldig op eventuele potentiële besmetting. Het medium in de onbesmette tanks moet helder en transparant zijn.

Als de tanks bewolkt zijn met besmetting, gooi ze weg en nummer de rest van de tanks. Bemonster 20 microliter hydroponisch medium uit elke genummerde tank en zet het op een petrischaal met Luria bouillon of LB-agar. Incubeer de schaal gedurende 28 uur bij 28 graden Celsius.

Inoculeer onmiddellijk elke genummerde hydroponische tank met 50 microliter van de agrobacterium tumefacians suspensie in elke genummerde hydroponische tank. Co-cultiveer de zaailingen en A tumefacians-bacterie bij 22 tot 24 graden Celsius met een fotoperiode van 16 uur en schudden bij 50 rpm. Onderzoek de gespotte LB-plaat na 12 en 28 uur incubatie om de steriliteit van het hydroponische groeimedium te verifiëren.

Als er sprake is van enige besmetting, gebruikt u de bijbehorende genummerde tank geïnoculeerd met bacteriën niet voor verdere downstream-assays. Scheid vervolgens de wortels van de bacteriesuspensie door de gaasplaat op te tillen. Als u wortels gebruikt voor verdere analyses, snijdt u de wortels, spoelt u ze snel in dubbel gedestilleerd water af en droogt u ze op gesterileerd filterpapier.

Als u blad of ander weefsel gebruikt, snijdt u het weefsel af. Voor planttranscriptanalyse moeten de wortels of scheuten onmiddellijk in vloeibare stikstof worden gedeponeerd