Microfluidic Bioprinting voor Engineering gevacuoliseerd weefsels en Organoids
11 augustus 2017
Wij bieden een veralgemeende protocol gebaseerd op een strategie van de bioprinting microfluidic voor een vezelige vasculaire bed, waar een secundaire celtype verder zou kunnen worden uitgezaaid in de interstitiële ruimte van deze vezelige structuur voor het genereren van gevacuoliseerd weefsels en organoids engineering.
Het algemene doel van deze methodologie voor bioprinting met microfluïdica is om een vaatgevormd weefselconstruct te genereren. Deze methode kan sleutelvragen oplossen in de biofabricage van vaatgevormd weefsel. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze veelzijdig is in het genereren van een driedimensionale vorm gecontroleerde vaat voor het engineeren van vaatgevormd weefsel door middel van een secundair celzaaiproces.
Hoewel dit protocol inzicht biedt in het engineeren van vaatgevormd hartweefsel, kan het ook worden toegepast op veel andere weefselsoorten zoals lever, huid en zelfs kankers. Personen die nieuw zijn in deze methode kunnen worstelen omdat het instellen van de bioprinter misschien niet eenvoudig is. Om deze procedure te starten, moet je een dubbellaagse concentrische microfluïdische printkop construeren door een kleinere stompe naald, die als kern dient, in het centrum van de grotere stompe naald in te voegen, die als omhulsel dient.
Zorg ervoor dat de kernnaald ongeveer één millimeter uit de buitenste schaal steekt. Plaats vervolgens een 23 gauge naald in de loop van de centrale naald in de omgekeerde richting. Maak een gat aan de zijkant van de loop van de buitenste naald en plaats een metalen connector van passende grootte.
Verzegeld met epoxylijm. Monteer de extruder op het hoofd van een bioprinter, met behulp van een polymethylmethacrylaat of PMMA houder. Verbind vervolgens de inlaten van de printkop met een dubbelkanaals spuitpomp voor de injectie van de bioink en de verknopingsoplossing via twee PVC buizen afzonderlijk.
Maak de bioink met een mengsel van alginaat, gelMA en foto-initiator. Opgelost in 25 millimolair HEPES-buffer, bevattende 10% foetaal bovien serum of FBS. Maak vervolgens een oplossing van 0,3 molair calciumchloride in HEPES-buffer bevattende 10%FBS om als verknopingsdragervloeistof te dienen.
Vlak voor het bioprinting, trypsiniseer menselijke navelstrengveneuze endotheelcellen of HUVECs gedurende vijf tot 10 minuten. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 800 RPM in een buis van 15 milliliter. Resuspendeer de cellen in de bioink met een concentratie van vijf tot 10 keer 10 tot de zes cellen per milliliter door langzaam vijf tot 10 keer te pipetteren.
Gebruik vervolgens een dubbelkanaals spuitpomp om de injectie van de HUVECs beladen bioink door één en de verknopingsvloeistof door het andere kanaal te starten bij een stroomsnelheid van vijf microliter per minuut. Laat de stromen gedurende maximaal één minuut continu lopen totdat ze stabiliseren. Start vervolgens de beweging van de printkop door de snelheid van de bioprinterdeposities van ongeveer vier millimeter per seconde te handhaven.
Dit bioprinting zou moeten resulteren in een snelle ionische gelering van de alginaatcomponent en deposition van een microvezelscaffold. Nadat het scaffold is gedrukt, moet de gelMA component worden gephoto-verknoopt met vijf tot 10 milliwatt per vierkante centimeter UV-licht gedurende 20 tot 30 seconden om chemische gelering te bereiken. Verwijder vervolgens het overtollige calciumchloride uit het scaffold door het voorzichtig te spoelen met 37 graden Celsius warm PBS.
Kweek dit scaffold in endotheelcelgroeimedium bij 37 graden Celsius in vijf volumeprocent CO2, gedurende maximaal 16 dagen. Ververs het medium minimaal om de twee dagen. Tijdens de kweekperiode moet u de HUVECs onder een microscoop monitoren totdat ze migreren naar de periferieën van de scaffoldmicrovezels en lumenachtige structuren vormen.
Verwijder vervolgens het volledige medium uit de interstitiële ruimte van het scaffold met capillaire kracht met behulp van een stuk steriele filterpapier. Voeg onmiddellijk een druppel suspensie van een secundair celtype zoals cardiomyocyten toe bovenop het scaffold, waardoor de cellen het volledige interstitiële gebied kunnen infiltreren. Incubeer vervolgens dit scaffold in een incubator gedurende 30 minuten tot twee uur, waardoor de cellen kunnen hechten aan de individuele microvezels.
Verwijder niet-aderente cellen door het scaffold voorzichtig te wassen met PBS. Kweek dit scaffold in een geschikt medium totdat het gewenste vaatgevormde weefsel is gevormd. Microfluïdisch bioprinting zoals hier beschreven, maakt direct bioprinting van microvezelscaffolds mogelijk met behulp van bioinks met lage viscositeit.
Een scaffold die zes bij zes bij zes vierkante millimeter groot is
Na microfluïdische extrusie van de bioink, ionische verknoping en foto-verknoping, behielden HUVECs een relatief hoge levensvatbaarheid. De cellen prolifereerden en migreerden van de aanvankelijk willekeurige verdeling op dag nul naar de periferieën van de microvezels op dag 16. Neonatale rat cardiomyocyten die op het scaffold zijn gezaaid, rijpen en bevolken het scaffold.
Ze vertoonden een sterke expressie van functionele cardiale biomarkers. Zoals sarcomeeralfa-actinine en connexine 43. Confocale microscopie van een gebioprint s microvezelscaffold, gevuld met cardiomyocyten, onthulde het naast elkaar bestaan van zowel HUVECs als cardiomyocyten.
HUVECs zijn voornamelijk aanwezig in de grenzen van de microvezels, terwijl de cardiomyocyten de buitenkant van de microvezels omringen. De cellen waren in staat om hun spontane en gesynchroniseerde kloppen te behouden gedurende maximaal negen tot 28 dagen. Afhankelijk van de celbron en configuratie van de scaffolds.
Na het bekijken van deze video zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je vaatgevormd weefsel kunt produceren met behulp van de microfluïdische bioprintingtechniek, evenals de fabricage van de printkop en de bediening van de bioprinter. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de fabricage van de printkop en de bediening van de bioprinter lastig kunnen zijn voor mensen die er nog nooit een hebben gebruikt. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de twee naalden concentrisch in de printkop te maken en de stroom te laten stabiliseren voordat u begint met het bioprinting.
Met de ontwik
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een microfluïdische bioprintmethode gericht op het genereren van gevasculariseerde weefselconstructen. De techniek pakt uitdagingen in de biofabricage aan door de creatie mogelijk te maken van een driedimensionaal vasculair bed dat kan worden bevolkt met secundaire celtypen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Biofabricatie
- Microfluidica
- Tissue Engineering
Achtergrond
- Het engineeren van gevasculariseerde weefsels is cruciaal voor de ontwikkeling van organoïden.
- Huidige methoden kennen beperkingen bij het creëren van complexe weefselstructuren.
- Microfluïdische bioprinting biedt een veelzijdige aanpak om deze uitdagingen te overwinnen.
- Deze techniek kan worden aangepast voor diverse weefseltypen, waaronder hart-, lever- en huidweefsels.
Doel van de studie
- Om een protocol te ontwikkelen voor het creëren van gevasculariseerde weefselconstructen.
- Om het begrip van biofabricatietechnieken te vergroten.
- Om een basis te leggen voor toekomstige toepassingen in weefselengineering.
Gebruikte methoden
- Constructie van een dubbellaagse concentrische microfluïdische printkop.
- Gebruik van een kleinere stompe naald als kern binnen een grotere stompe naald.
- Het zaaien van secundaire celtypen in de microvezelige structuur.
- Toepassing van de methode op diverse weefseltypen buiten hartweefsels.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol genereert met succes een gevasculariseerd weefselconstruct.
- Aangetoonde veelzijdigheid bij het creëren van verschillende weefseltypen.
- Bood inzichten in het engineeren van complexe weefselstructuren.
- Identificeerde potentiële uitdagingen voor nieuwkomers in het bioprintproces.
Conclusies
- De microfluïdische bioprintmethode is effectief voor het weefselkweekproces van gevasculariseerd weefsel.
- Deze benadering kan bijdragen aan vorderingen in het organoïdonderzoek.
- Toekomstige studies kunnen de toepassing ervan uitbreiden naar andere weefseltypen en condities.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Microfluïdische bioprinting maakt de engineering van gevasculariseerde weefselconstructen met een hoge structurele getrouwheid mogelijk, waarmee een kritiek knelpunt in de ontwikkeling van preklinische modellen wordt aangepakt. Door perfuseerbare microvasculaire netwerken binnen hydrogel-steigers te genereren, ondersteunt deze methode de creatie van fysiologisch relevantere weefselmodellen voor drugscreening en mechanistische studies. De aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door een instelbaar platform te bieden om cel-celinteracties, weefselrijping en functionele responsen onder gecontroleerde omstandigheden te bestuderen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om interacties tussen endotheelcellen en pericyten of stromale cellen binnen een gedefinieerde vasculaire niche te onderzoeken om therapeutische doelwitten betrokken bij angiogenese of vasculaire permeabiliteit te valideren.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar, microfluïdisch gecontroleerd systeem voor het genereren van gevasculariseerde scaffolds met een consistente microvezelarchitectuur en lumenvorming.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de beoordeling van de effecten van verbindingen op de vasculaire integriteit en celmigratie in een mens-relevante 3D-micro-omgeving.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde microvezelige scaffolds met ingekapselde endotheelcellen die lumen-achtige structuren vormen, waardoor kwantitatieve beoordeling van de vorming van vasculaire netwerken in de loop van de tijd mogelijk is.
- Operationele waarde: Compatibel met bioprinten via een syringe pump met dubbel kanaal, wat een nauwkeurige controle over de toediening van bio-inkt en crosslinking-vloeistof mogelijk maakt voor high-throughput fabricage van scaffolds.
- Assay-gereedheid: Produceert scaffolds met >30 microvezels in een volume van 6x6x6 mm binnen 10 minuten, wat schaalbare preparatie ondersteunt voor daaropvolgende secundaire celzaaiing en compound-screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt secundaire zaaiing van cardiomyocyten of andere parenchymale cellen in de interstitiële ruimte mogelijk, wat de studie naar de rijping van gevasculariseerd weefsel en gesynchroniseerde contractiele functie faciliteert.
- Translationele continuïteit: Ondersteunt langetermijncultuur (>16 dagen) met monitoring van celmigratie, lumenvorming en biomarkerexpressie (bijv. sarcomerisch alfa-actinine, connexine 43) om responsen op weefselniveau te modelleren.
- Risicobeperking: Maakt evaluatie van celviabiliteit, proliferatie en functionele rijping onder perfusie-achtige condities mogelijk, waardoor uitval door gebrekkige vasculaire ingroei in latere stadia wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadoptimalisatie en biedt een gevasculariseerd platform dat de kloof overbrugt tussen eenvoudige monocultures en complexe in vivo-modellen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen van vasculair-afhankelijke pathways door gecontroleerde co-cultuur van endotheliale en parenchymale cellen in een gedefinieerde 3D-geometrie mogelijk te maken.
- Screening: Levert assay-klare scaffolds met een reproduceerbare microstructuur en endothelialisatie, geschikt voor het evalueren van effecten van verbindingen op vasculaire stabiliteit en weefselorganisatie.
- Analytics: Maakt kwantitatieve read-outs mogelijk via confocale microscopie van celdistributie, lumenvorming en co-lokalisatie van biomarkers om de weefselkwaliteit en functionele rijping te beoordelen.
- Translationeel Onderzoek: Modelleert de ontwikkeling van gevasculariseerd weefsel, van vroege vorming van het endotheliale netwerk tot integratie van secundaire cellen, ter ondersteuning van de preklinische validatie van vasculair-gerichte of regeneratieve kandidaten.
- Enterprise Reuse: Het ontwerp van de microfluïdische printkop en het bio-inktsysteem (GelMA-alginaat met ionische/fotocrosslinking) vormen een herbruikbaar platform dat aanpasbaar is aan meerdere weefseltypen (cardiaal, lever, huid) en secundaire celtypen.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door gevasculariseerd weefsel te genereren met perfuseerbare lumen-achtige structuren en aanhoudende cellulaire functie (bijv. gesynchroniseerd kloppen tot 28 dagen).
- Operationele waarde: Maakt standaardisatie van de fabricage van scaffolds mogelijk via microfluïdische stroomcontrole, waardoor variabiliteit in microvezeldiameter, crosslinking-efficiëntie en celdistributie wordt verminderd.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming door vroege inzichten te bieden in vasculaire compatibiliteit en responsen op weefselniveau, waardoor falen in een laat stadium door inadequate vascularisatie wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten op basis van hun effecten in een mens-relevant, gevasculariseerd weefselmodel dat belangrijke structurele en functionele kenmerken nabootst.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de fabricage van microfluïdische apparaten, inclusief de assemblage van concentrische naalden en epoxy-afdichting om lekkage te voorkomen.
- Afhankelijk van dual-channel spuitpompsystemen en UV-fotocrosslinking-apparatuur voor een nauwkeurige toediening van de bio-inkt en stabilisatie van GelMA.
- Maakt optimalisatie van de celconcentratie (5–10×10⁶ HUVECs/mL) en stroomsnelheden (5 µL/min) noodzakelijk om de cellevensvatbaarheid en uniforme inkapseling tijdens het printen te waarborgen.
- Vereist aseptische handelingen en steriel filterpapier voor het verwijderen van medium tijdens de secundaire celzaaiing om contaminatie te vermijden en een juiste infiltratie te garanderen.
- Beperkt door de noodzaak van spoelen na het printen om overtollig calciumchloride te verwijderen, wat een handmatige stap toevoegt die over verschillende batches gestandaardiseerd moet worden.
