Microfluidic Bioprinting voor Engineering gevacuoliseerd weefsels en Organoids

Het algemene doel van deze methodologie voor bioprinting met microfluïdica is om een vaatgevormd weefselconstruct te genereren. Deze methode kan sleutelvragen oplossen in de biofabricage van vaatgevormd weefsel. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze veelzijdig is in het genereren van een driedimensionale vorm gecontroleerde vaat voor het engineeren van vaatgevormd weefsel door middel van een secundair celzaaiproces.

Hoewel dit protocol inzicht biedt in het engineeren van vaatgevormd hartweefsel, kan het ook worden toegepast op veel andere weefselsoorten zoals lever, huid en zelfs kankers. Personen die nieuw zijn in deze methode kunnen worstelen omdat het instellen van de bioprinter misschien niet eenvoudig is. Om deze procedure te starten, moet je een dubbellaagse concentrische microfluïdische printkop construeren door een kleinere stompe naald, die als kern dient, in het centrum van de grotere stompe naald in te voegen, die als omhulsel dient.

Zorg ervoor dat de kernnaald ongeveer één millimeter uit de buitenste schaal steekt. Plaats vervolgens een 23 gauge naald in de loop van de centrale naald in de omgekeerde richting. Maak een gat aan de zijkant van de loop van de buitenste naald en plaats een metalen connector van passende grootte.

Verzegeld met epoxylijm. Monteer de extruder op het hoofd van een bioprinter, met behulp van een polymethylmethacrylaat of PMMA houder. Verbind vervolgens de inlaten van de printkop met een dubbelkanaals spuitpomp voor de injectie van de bioink en de verknopingsoplossing via twee PVC buizen afzonderlijk.

Maak de bioink met een mengsel van alginaat, gelMA en foto-initiator. Opgelost in 25 millimolair HEPES-buffer, bevattende 10% foetaal bovien serum of FBS. Maak vervolgens een oplossing van 0,3 molair calciumchloride in HEPES-buffer bevattende 10%FBS om als verknopingsdragervloeistof te dienen.

Vlak voor het bioprinting, trypsiniseer menselijke navelstrengveneuze endotheelcellen of HUVECs gedurende vijf tot 10 minuten. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 800 RPM in een buis van 15 milliliter. Resuspendeer de cellen in de bioink met een concentratie van vijf tot 10 keer 10 tot de zes cellen per milliliter door langzaam vijf tot 10 keer te pipetteren.

Gebruik vervolgens een dubbelkanaals spuitpomp om de injectie van de HUVECs beladen bioink door één en de verknopingsvloeistof door het andere kanaal te starten bij een stroomsnelheid van vijf microliter per minuut. Laat de stromen gedurende maximaal één minuut continu lopen totdat ze stabiliseren. Start vervolgens de beweging van de printkop door de snelheid van de bioprinterdeposities van ongeveer vier millimeter per seconde te handhaven.

Dit bioprinting zou moeten resulteren in een snelle ionische gelering van de alginaatcomponent en deposition van een microvezelscaffold. Nadat het scaffold is gedrukt, moet de gelMA component worden gephoto-verknoopt met vijf tot 10 milliwatt per vierkante centimeter UV-licht gedurende 20 tot 30 seconden om chemische gelering te bereiken. Verwijder vervolgens het overtollige calciumchloride uit het scaffold door het voorzichtig te spoelen met 37 graden Celsius warm PBS.

Kweek dit scaffold in endotheelcelgroeimedium bij 37 graden Celsius in vijf volumeprocent CO2, gedurende maximaal 16 dagen. Ververs het medium minimaal om de twee dagen. Tijdens de kweekperiode moet u de HUVECs onder een microscoop monitoren totdat ze migreren naar de periferieën van de scaffoldmicrovezels en lumenachtige structuren vormen.

Verwijder vervolgens het volledige medium uit de interstitiële ruimte van het scaffold met capillaire kracht met behulp van een stuk steriele filterpapier. Voeg onmiddellijk een druppel suspensie van een secundair celtype zoals cardiomyocyten toe bovenop het scaffold, waardoor de cellen het volledige interstitiële gebied kunnen infiltreren. Incubeer vervolgens dit scaffold in een incubator gedurende 30 minuten tot twee uur, waardoor de cellen kunnen hechten aan de individuele microvezels.

Verwijder niet-aderente cellen door het scaffold voorzichtig te wassen met PBS. Kweek dit scaffold in een geschikt medium totdat het gewenste vaatgevormde weefsel is gevormd. Microfluïdisch bioprinting zoals hier beschreven, maakt direct bioprinting van microvezelscaffolds mogelijk met behulp van bioinks met lage viscositeit.

Een scaffold die zes bij zes bij zes vierkante millimeter groot is

Na microfluïdische extrusie van de bioink, ionische verknoping en foto-verknoping, behielden HUVECs een relatief hoge levensvatbaarheid. De cellen prolifereerden en migreerden van de aanvankelijk willekeurige verdeling op dag nul naar de periferieën van de microvezels op dag 16. Neonatale rat cardiomyocyten die op het scaffold zijn gezaaid, rijpen en bevolken het scaffold.

Ze vertoonden een sterke expressie van functionele cardiale biomarkers. Zoals sarcomeeralfa-actinine en connexine 43. Confocale microscopie van een gebioprint s microvezelscaffold, gevuld met cardiomyocyten, onthulde het naast elkaar bestaan van zowel HUVECs als cardiomyocyten.

HUVECs zijn voornamelijk aanwezig in de grenzen van de microvezels, terwijl de cardiomyocyten de buitenkant van de microvezels omringen. De cellen waren in staat om hun spontane en gesynchroniseerde kloppen te behouden gedurende maximaal negen tot 28 dagen. Afhankelijk van de celbron en configuratie van de scaffolds.

Na het bekijken van deze video zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je vaatgevormd weefsel kunt produceren met behulp van de microfluïdische bioprintingtechniek, evenals de fabricage van de printkop en de bediening van de bioprinter. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de fabricage van de printkop en de bediening van de bioprinter lastig kunnen zijn voor mensen die er nog nooit een hebben gebruikt. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de twee naalden concentrisch in de printkop te maken en de stroom te laten stabiliseren voordat u begint met het bioprinting.

Met de ontwik