Een methode voor het karakteriseren van de embryogenese Arabidopsis

Het algemene doel van deze methode is om de patroonvorming van embryo's tijdens plantenembryogenese te karakteriseren met behulp van het modelorganisme. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van planten, zoals embryogenese in Arabidopsis. Het grote voordeel van deze techniek is dat de embryopatroonvorming in de modelplant Arabidopsis kan worden gekenmerkt door de aanbevolen werkwijze.

Jinlin Feng, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium, demonstreert de procedure. Om deze procedure te beginnen, voeg je 100 zaden toe aan een buis van 1,5 milliliter. Voeg een milliliter natriumhypochloriet toe om de zaden te steriliseren.

Keer de buis meerdere keren om om ervoor te zorgen dat de zaden en oplossing goed gemengd zijn. Centrifugeer de buis na vijf minuten gedurende 30 seconden bij 1200 Gs. Verwijder het supernatant en was de zaden vier keer met steriel water om eventueel resterend natriumhypochloriet te verwijderen.

Voeg vervolgens 4,4 gram MS-basiszoutroerder en 10 gram sucrose toe aan een liter ultrapuur water. Roer om het zout en de sucrose op te lossen. Pas de pH van de oplossing aan met één mol kaliumhydroxide op 5,8.

Voeg vervolgens drie gram gelmiddel toe en steriliseer de oplossing gedurende 15 minuten op 121 graden Celsius. Giet 30 milliliter van het resulterende MS-medium in een kweekschaal van 12 centimeter. Plaats de gesteriliseerde zaden op de MS-plaat.

Breng de plaat over naar een koelkast en bewaar deze drie dagen op vier graden Celsius in het donker om de zaden te stratificeren. Houd de plaat vervolgens acht dagen in een groeikamer onder langedagcondities. Breng de planten vervolgens over naar aarde in een bakje.

Bedek de bak met een doorzichtige witte deksel om waterverlies te voorkomen. Laat een kleine opening over om glasvorming van de planten te voorkomen. Verwijder na vijf dagen het deksel en kweek de planten in een loopkas onder langedagcondities.

Gebruik na ongeveer 20 dagen groei een draad om 10 tot 15 bloemknoppen op de positie van de zaadsteel en de bloeiwijze om 20:00 uur te markeren. Definieer het begin van de bestuiving van de eicel wanneer de gemarkeerde knoppen om 08:00 uur de volgende ochtend openbloeien. Om te beginnen met het bereiden van de Hoyer-oplossing, voeg je 24 gram chlorhydraat toe aan een buis van 50 milliliter. Wikkel de buis volledig in aluminiumfolie en zorg ervoor dat de folie alle licht afsluit.

Voeg negen milliliter ultrapuur water en drie milliliter glycerol toe. Schud de buis om het chlorhydraat op te lossen. Laat de bereide Hoyer-oplossing vervolgens een nacht staan bij kamertemperatuur om eventuele luchtbellen te elimineren.

Bevestig om te beginnen een stuk dubbelzijdig plakband op een microscoopglasplaat. Plaats een silique, die gedurende het gewenste aantal dagen na bestuiving is gekweekt, op de kant met het pseudoseptum loodrecht op het oppervlak. Splits met een spuitnaald de carpels aan beide kanten van het pseudoseptum.

Bevestig vervolgens de twee gedissekteerde carpels aan de plaat zodat de eicellen en de silique onder een stereoscoop zichtbaar zijn. Geef 70 microliter Hoyer-oplossing op de glasplaat. Doop vervolgens een paar fijne pincetten in de oplossing om het punt te bevochtigen.

Gebruik de stereoscoop en de pincetten om de eicellen in de Hoyer-oplossing te verplaatsen om de embryo's te reinigen. Breng vervolgens voorzichtig een dekglas aan op de plaat en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Plaats de voltooide plaat twee tot 12 uur in een donkere kamer bij kamertemperatuur.

Gebruik na de benodigde tijd de DIC-functie van de microscoop om de doorzichtige eicellen te onderzoeken. Lokaliseer de embryo's onder een laag vermogen en verander vervolgens naar een hoog vermogen om het cellulaire patroon in de ontwikkelde embryo's te observeren. Onderzoek vervolgens de embryo's in verschillende ontwikkelingsstadia.

Bereid om te beginnen het DR5 GFP-plasmide voor en introduceer het in de wildtype-planten door agrobacterium om methassians gemedieerde transformatie te bemiddelen, zoals beschreven in het tekstprotocol. Selecteer de T1-planten met behulp van MS-mediumplaten die hydrolysine bevatten. Breng vervolgens de planten over en kweek ze zoals beschreven in het tekstprotocol om T3-planten te verkrijgen.

Markeer met een draad de bloemknoppen van de homozygote T3-plant op de positie van de zaadsteel bij de bloeiwijze om 20:00 uur. Meng vervolgens drie milliliter glycerol met 47 milliliter ultrapuur water om een 6% glyceroloplossing te maken. Bevestig vervolgens een stuk dubbelzijdig plakband op een microscoopglasplaat. Plaats een silique van een T3-plant op de plaat met het pseudoseptum loodrecht op het oppervlak.

Splits met een spuitnaald de carpels aan beide kanten van het pseudoseptum. Bevestig de twee gedissekteerde carpels aan de plaat zodat de eicellen en de silique onder een stereoscoop zichtbaar zijn. Geef vervolgens 30 microliter 6% glycerol op de plaat.

Doop een paar fijne pincetten in de oplossing om het punt te bevochtigen. Gebruik de stereoscoop en de pincetten om de eicellen in de glyceroloplossing te verplaatsen. Plaats voorzichtig een dekglas op de plaat.

Tik vervolgens snel en voorzichtig op de plaat om het embryo uit de eicel te drukken. Gebruik vervolgens confocale laserscanningmicroscopie om de plaat te onderzoeken op groen fluorescerend eiwitfluorescentie. Zoek de geïsoleerde embryo's onder een laag vermogen en noteer hun locatie.

Verander naar een hoog vermogen en stel de excitatielichtbron in op 488 nanometer om GR5 GFP-expressie in de embryo's te observeren. Detecteer vervolgens de GFP-expressie en ken het embryopatroonvormingsproces aan zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze studie wordt embryogenese in Arabidopsis waargenomen via ovuleklärung, zoals te zien is.

Na ovuleklärung zijn de embryo's in verschillende ontwikkelingsstadia te onder