Name: Een methode voor het karakteriseren van de embryogenese Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-04T10:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Leer een methode voor het karakteriseren van embryogenese in Arabidopsis met DIC-microscopie en GFP-markering. Dit protocol maakt gedetailleerde observatie van embryo-morfologie en genexpressiepatronen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Jessica Habashi voor het kritisch lezen van het manuscript. Wij danken Dr. Xianyong Sheng van het Imaging Center, College van de biowetenschappen, hoofdstad Normal University (Peking, China), voor het uitvoeren van de lokalisatie van DR5-GFP assay. Dit werk werd gesteund door subsidies van de Beijing Municipal regering Science Foundation (CIT &#38; TCD20150102) en van de nationale Natural Science Foundation van China (31600248).

Opmerking: Dit protocol bestaat uit drie delen: 1) observeren de patroonformatie in wild-type Arabidopsis embryo's met behulp van DIC microscopie; 2) karakteriseren de embryo patroon vorming via de waarneming van marker eiwit expressie met behulp van confocale laser scanning microscopie; en 3) bepaling van de rol van een specifiek gen in embryogenese (met behulp van de mutant naa10 als voorbeeld).
1. ovule Clearing
<ol>
	<li>Plant materiaal voorbereiding Opmerking: Het protocol beschreven hier is een voorbeeld over hoe om te groeien van gezonde planten; andere manieren om gezonde planten groeien ook werken.<ol>
		<li>Voegt toe 100 zaden tot een 1,5 mL koker, en vervolgens 1 mL van 1,5% natriumhypochloriet (mix 15 mL 10% chloor met 85 mL water) om te steriliseren de zaden voor 5 min. omkeren de buis meerdere malen om ervoor te zorgen dat de zaden en de oplossing goed gemengd aan de oppervlakte zaden volledig te steriliseren.</li>
		<li>De zaden omzetten in de onderkant van de buis door centrifugeren voor 30 s bij 1.200 x g, verwijder het supernatant en de zaden met steriel water viermaal wassen bij een bank te verwijderen van de resterende natriumhypochloriet.</li>
		<li>4.4 g van Murashige en Skoog (MS) basale zout mengsel en 10 g van sacharose aan 1 L ultrazuiver water toevoegen. Roer het mengsel te ontbinden en de zouten en sacharose. 3 g Geleermiddel, zoals Phytagel, de oplossing voor pH 5,8 met 1 M KOH, aanpassen toevoegen aan de MS-sacharoseoplossing en steriliseren van de oplossing bij 121 ° C gedurende 15 minuten staan om MS medium.</li>
		<li>Giet 30 mL van de MS-medium in een schotel 12 cm cultuur voor het genereren van MS middellange platen.</li>
		<li>Plaats de gesteriliseerde zaden op de MS-plaat. De plaat overbrengen in een kamer van de groei en het houden van de plaat onder de voorwaarden van de lange dagen (22 ° C gedurende 16 uur in het licht en 18 ° C voor 8u in het donker) na zaad stratificatie (3 dagen bij 4 ° C in het donker).</li>
		<li>Na 8 dagen van de groei, de planten overbrengen naar bodem (mix voedselrijke bodem en vermiculiet bij een verhouding van 1:1) in een lade, het dienblad met een wit, transparant deksel voor 5 dagen om te voorkomen dat het waterverlies te dekken, en laat een gat om te voorkomen dat verglazing van de planten.</li>
		<li>Neem het deksel uit de lade en het kweken van de planten in een walk-in kamer onder de voorwaarden van de lange-dag (zie 1.1.5). Zet het licht op 6:00 am en off om 10:00 uur. Na ongeveer 20 dagen van de groei in de walk-in zaal, hebben de planten gebloeid en siliques geproduceerd.</li>
		<li>Mark de bloemknoppen met een draad op de positie van het zaad stengels in de bloeiwijze om 8:00 pm (gebruik niet de eerste naar de derde bloemknoppen; de siliques gegenereerd op basis van deze bloemknoppen meestal een paar afgebroken zaden ontwikkelen, en dit kan het aandeel van normaal tot abnormale zaadknoppen wijzigen). Definieert het begin van de bestuiving van de zaadknop als wanneer de gemarkeerde kiem opent tot bloem bij 8:00 am de volgende ochtend.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bereiding van de Hoyer-oplossing
	<ol>
		<li>Voeg 24 g Chloraalhydraat voor een tube van 50 mL en wikkel de buis volledig met aluminiumfolie (oplossingen van Chloraalhydraat zijn niet stabiel onder licht).</li>
		<li>Vervolgens 9 mL ultrazuiver water en 3 mL glycerol toevoegen aan de bovenstaande oplossing en schudden van de buis te ontbinden de Chloraalhydraat. Hoyer van om oplossing te maken, laat de buis rusten bij kamertemperatuur te elimineren alle bubbels.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaadknop scheiding en ruimen van bouwterreinen
	<ol>
		<li>Bevestig een stuk dubbelzijdige plakband aan een Microscoop glasplaatje. Plaats een Hauw gekweekt voor het gewenste aantal dagen na bestuiving (DAP) op de dia met de pseudoseptum die loodrecht op het oppervlak; Dit maakt het gemakkelijk te splitsen van de carpellen (figuren 1A en 1B).</li>
		<li>Splitsen van de carpellen aan beide zijden van de pseudoseptum met een spuit-naald en bevestig de twee ontleed carpellen aan de dia zodat de zaadknoppen in de Hauw zichtbaar onder een stereoscoop (cijfers 1 c en 1 D zijn).</li>
		<li>Afzien van 70 µL van Hoyer de oplossing op het glasplaatje en Bevochtig dan het puntje van een paar schone-tipped pincet met Hoyer de oplossing door dompelen. Met behulp van de stereoscoop, gaan de zaadknoppen van de Hoyer-oplossing op de dia met de pincet te reinigen van de embryo's. Breng een dekglaasje aan naar de dia voorzichtig om te voorkomen dat het genereren van alle bubbels.</li>
		<li>Zet de voltooide dia in een doos in een donkere kamer voor 2 tot 12 h (de meer volwassen een zaadknop is, hoe meer tijd nodig zal zijn) bij kamertemperatuur. Embryo's in de 2/4-cel stadium (1-2 DAP) kunnen worden waargenomen microscopisch na 2U, terwijl embryo's tussen de octant en bolvormige beginfase (3 DAP) kunnen worden waargenomen na 4 uur. Rijpere embryo's (4-8 DAP) kunnen worden waargenomen na 12 h.</li>
		<li>Onderzoeken de gewiste zaadknoppen DIC de functie van een microscoop. Zoek de embryo's onder een spaarstand veld (10 X) en vervolgens omzetten in een high-power veld (100 X olie onderdompeling lens) te observeren het cellulaire patroon in de ontwikkelde embryo's.</li>
		<li>Het onderzoeken van de embryo's op verschillende ontwikkelingsstadia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. karakterisering van Embryo patronen en cel identiteit via de waarneming van Marker eiwit expressie
<ol>
	<li>Voorbereiding van plantaardig materiaal
	<ol>
		<li>Kloon van de promotor en de codering van de opeenvolging van de marker-gen of hormoon respons-element en vervolgens zekering het met een fluorescente proteïne (zoals GFP); Steek vervolgens de constructie in de binaire vector (zoals pCambia1300). Hier, de auxine respons-element DR5 wordt gepresenteerd als een voorbeeld10.</li>
		<li>De resulterende DR5-GFP plasmide introduceren in het wild-type planten door Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie11. Selecteer de T1-planten met behulp van MS middellange platen met hygromycin (moeder drank, 50 mg/mL verdund 1:1, 000). De transgene planten zal vertonen lange wortels en twee rozet bladeren na 8 dagen van de groei onder de voorwaarden beschreven in 1.1.5 te genereren.</li>
		<li>Breng de transgene planten voor de bodem en kweken zoals aangegeven in 1.1.6 en 1.1.7.</li>
		<li>De T2 zaden verzamelen van de onafhankelijke T1-lijnen. Zaaien op MS-hygromycin platen, selecteer de planten uitvoering van één exemplaar van de DR5-GFP -invoeging (de verhouding van resistente planten gevoelige planten zullen ongeveer 3:1) en deze overbrengen naar de bodem.</li>
		<li>De T2 planten cultiveren zoals aangegeven in 1.1.6 en 1.1.7.</li>
		<li>De T3 zaden van de T2 planten verzamelen. Zaaien op MS-hygromycin platen, selecteer de homozygoot transgene planten (alle van de planten uit een enkele lijn zal vertonen hygromycin weerstand) en deze overbrengen naar de bodem.</li>
		<li>Mark de bloemknoppen van de homozygoot T3 planten zoals aangegeven in 1.1.8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GFP signaal observatie
	<ol>
		<li>Meng 3 mL van glycerol met 47 mL ultrazuiver water voor het genereren van een 6% glycerol-oplossing.</li>
		<li>Bevestig een stuk dubbelzijdige plakband aan een glasplaatje Microscoop en monteren van een Hauw, zoals aangegeven in punt 1.3.1.</li>
		<li>Splitsen van de carpellen aan beide zijden van de pseudoseptum met een spuit-naald en bevestig de twee ontleed carpellen aan de dia onder een stereoscoop zoals aangegeven in 1.3.2.</li>
		<li>Afzien van 30 µL 6% glycerol op het glasplaatje en alle van de zaadknoppen uit de ontleed carpellen plaatsen in de oplossing met behulp van fine-tipped pincet. Plaats een dekglaasje aan op de dia voorzichtig.</li>
		<li>Als het zaad jas en endosperm in elke zaadknop voorkomen de waarneming van GFP signalen in het embryo dat kunnen, pak het embryo uit de zaadknop. Tik op de dia snel en zachtjes te extruderen van het embryo van de zaadknop (de meer volwassen een zaadknop is, de minder kracht moet worden toegepast op de dia).</li>
		<li>Onderzoeken van de dia voor GFP fluorescentie met behulp van confocale laser scanning microscopie. De geïsoleerde embryo's vinden onder een spaarstand veld (10 X) en hun locatie opnemen, dan overstappen op een high-power veld (100 X olie onderdompeling lens) te observeren van DR5-GFP expressie in de embryo's door de excitatie-lichtbron op 488 nm voor de detectie van het GFP-signaal.</li>
		<li>Bemerk de GFP-expressie in de embryo's om te kiezen van de geschikte T3 lijn voor verdere analyse.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. karakterisering van Embryo patroonformatie in een Embryo-dodelijke Mutant via Ovule mijnen en Marker eiwit observatie: Naa10 als voorbeeld
<ol>
	<li>Embryo patronen in naa10 mutant planten
	<ol>
		<li>Bereid het plantaardig materiaal zoals aangegeven in 1.1.1-1.1.7.</li>
		<li>Identificeren van de naa10+/ − planten door PCR met behulp van gen-specifieke primers5, en dan merk de bloemknoppen van de naa10+/ − planten zoals aangegeven in 1.1.8.</li>
		<li>Uitvoeren van de zaadknop mijnen en het microscopisch onderzoek van naa10+/ − embryo's zoals aangegeven in de 1.2 en 1.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Marker eiwit analyse met behulp van naa10 embryo 's
	<ol>
		<li>Verkrijgen van geschikte DR5-GFP transgene lijnen met behulp van de procedure die wordt beschreven in de 2.1-2.2.</li>
		<li>Een homozygoot transgene DR5-GFP -lijn met een naa10 Kruis+/ − plant te verkrijgen naa10+/ − planten die homozygoot voor het GFP fluorescentie markeerteken op de F2-generatie (geïdentificeerd door gen-specifieke PCR zijn) te karakteriseren naa10+/ −5 en observeren van het GFP-signaal onder een microscoop met behulp van een homozygoot DR5-GFP -lijn.</li>
		<li>Mark van de bloemknoppen van naa10+/ − planten die homozygoot voor DR5-GFP zijn zoals aangegeven in 2.1.7.</li>
		<li>Zoeken naar het GFP-signaal in naa10 embryo's die homozygoot voor DR5-GFP zijn zoals aangegeven in punt 2.2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).</li>
<li>Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryogenesis+in+flowering+plants%3A+setting+up+the+basic+body+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).</li>
<li>Wendrich, J. R., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+embryo+as+a+miniature+morphogenesis+model%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model.</a> New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).</li>
<li>ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+plant%3A+cell+fate+specification+in+the+early+Arabidopsis+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo.</a> Development. 142 (3), 420-430 (2015).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+N-terminal+acetylation+is+required+for+embryogenesis+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis.</a> J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).</li>
<li>Berleth, T., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/trends/genetics/abstract/0168-9525(93)90246-E">The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo.</a> Development. 118, 575-587 (1993).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D-myo-inositol-3-phosphate+affects+phosphatidylinositol-mediated+endomembrane+function+in+Arabidopsis+and+is+essential+for+auxin-regulated+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis.</a> Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).</li>
<li>Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPK1+and+TOAD2+are+two+receptor-like+kinases+redundantly+required+for+Arabidopsis+embryonic+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation.</a> Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).</li>
<li>Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aux%2FIAA+proteins+repress+expression+of+reporter+genes+containing+natural+and+highly+active+synthetic+auxin+response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements.</a> Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).</li>
<li>Friml, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efflux-dependent+auxin+gradients+establish+the+apical-basal+axis+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis.</a> Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).</li>
<li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+dip%3A+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).</li>
<li>Fiume, E., Fletcher, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Arabidopsis+embryo+and+endosperm+development+by+the+polypeptide+signaling+molecule+CLE8%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8.</a> Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).</li>
<li>Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+the+apical+domain+of+the+Arabidopsis+embryo+requires+the+BOBBER1+NudC+domain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein.</a> Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Zaadknop klaring is een handige methode voor het opsporen van de celdeling en morfologie beoordelen tijdens de embryogenese Arabidopsis; met behulp van deze techniek, kunnen direct onder DIC microscopie5,12embryo's worden waargenomen. De kritieke stap voor zaadknop goedkeuring is stap 1.3.4. De tijd die nodig is voor de zaadknop mijnen in stap 1.3.4 is variabel. Embryo's in het stadium van 2/4-cel duidelijk waarneembaar na 2U in van de Hoyer oplossing, t...

Embryogenese is de vroegste gebeurtenis in de ontwikkeling van hogere planten. Een volwassen embryo vormt van een zygote door celdeling- en differentiatie onder strenge controle van de genetische1,2. Arabidopsis embryo's zijn een nuttig model voor de controle op de voedselproductie studeren omdat de volgorde van de celdelingen tijdens de embryogenese een verwachte patroon3,4 volgt. Een embryo van Arabidopsis met één tot meerdere cellen is echter te klein om te worden waargenomen en geanalyseerd. Bovendien kan de mutatie van bepaalde genen embryo letaliteit5, met vermelding van de sleutelrol van die genen in embryogenese veroorzaken. De karakterisering van patroonformatie in de embryo-dodelijke mutanten biedt een basis voor het begrijpen van het moleculaire mechanisme waarbij essentiële genen embryo-ontwikkeling reguleren.
Een gedetailleerde methode wordt hier beschreven voor de karakterisatie van embryo patroonformatie in de model plant Arabidopsis met directe microscopische observatie. Bij deze methode wordt de zaadknop goedkeuring, gevolgd door de microscopische observatie van een embryo. De karakterisering van een embryo-dodelijke mutant wordt ook beschreven.
De morfologie van de embryo's op verschillende ontwikkelingsstadia kan direct door microscopie met behulp van de zaadknoppen die zijn gewist met7-Hoyer van oplossing6,worden bepaald. Dergelijke zaadknoppen vertonen een hoge brekingsindex; Deze zaadknop clearing methode is dus vooral voordelig voor specimens die moeten worden nageleefd door differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie.
Daarnaast is de genen die worden uitgedrukt in een bepaalde cel of een beperkt aantal cellen tijdens de embryogenese inzetbaar als markeringen te identificeren van de cellen in het embryo. Daarom kan de cel identiteit specificatie tijdens de embryogenese geannoteerde worden door het toezicht op de expressie van marker GFP-gelabelde proteïnen met behulp van confocale laser scanning microscopie. Omgekeerd, observeren het expressiepatroon van een onbekende functioneel gen -GFP fusion tijdens de embryogenese kan beschikken over een koppeling tussen embryo patronen en de uitdrukking van dit gen, en vergemakkelijken de identificatie van nieuwe genen die vereist voor embryogenese Arabidopsis zijn.
De hier beschreven methode kan ook worden gebruikt om karakteriseren het fenotype van een embryo-dodelijke mutant, te bepalen en het effect van het betrokken gen op embryogenese op cellulair niveau. Bovendien kan de methode in combinatie met een vergelijking van het expressiepatroon van markers tijdens de embryogenese tussen wild-type en mutant planten, aanwijzingen over de moleculaire mechanismen en signaalroutes betrokken bij embryogenese8,9opleveren. Inderdaad, de methode werd toegepast op naa10 planten, en het bleek dat de abnormale verdeling van de hypophysis in de mutant kan worden veroorzaakt door een wijziging in de verdeling van de auxine tijdens de embryogenese5.

<table><tbody><tr><td>Chloral Hydrate</td><td>Sigma</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Medium</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Roche</td><td>10843555001</td><td></td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>Percival</td><td>CU36L5</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Zeiss Image M2</td><td>camera: AxioCam 506 color</td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscopy</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Zeiss LSM 5</td><td>filters: BP 495 - 555 nm</td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Axio Zoom V16</td><td>camera: AxioCam MRc5</td></tr><tr><td>nutrient-rich soil</td><td>KLASMANN, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50-mL tube</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5-mL tube</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% sodium hypochlorite solution</td><td></td><td></td><td>Huishoudelijke analytische reagens</td></tr><tr><td>sucrose</td><td></td><td></td><td>Huishoudelijke analytische reagens</td></tr><tr><td>KOH</td><td></td><td></td><td>Huishoudelijke analytische reagens</td></tr><tr><td>glycerol</td><td></td><td></td><td>Huishoudelijke analytische reagens</td></tr><tr><td>culture dish</td><td></td><td></td><td>Huishoudelijke benodigdheden</td></tr><tr><td>vermiculite</td><td></td><td></td><td>Huishoudelijke benodigdheden</td></tr><tr><td>glass slide</td><td></td><td></td><td>Huishoudelijke benodigdheden</td></tr><tr><td>syringe needle</td><td></td><td></td><td>Huishoudelijke benodigdheden</td></tr><tr><td>fine-tipped tweezers</td><td></td><td></td><td>Huishoudelijke benodigdheden</td></tr><tr><td>super clean bench</td><td></td><td></td><td>Huishoudelijke apparatuur</td></tr></tbody></table>

een methode voor het karakteriseren van de embryogenese arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Gezien het zeer voorspelbare karakter van hun ontwikkeling, zijn Arabidopsis embryo's gebruikt als een model voor studies van genuitdrukking in planten. Echter vroeg stadium plant embryo's zijn klein en bevatten weinig cellen, waardoor ze moeilijk te observeren en te analyseren. Een methode is hier beschreven voor het karakteriseren van patroonformatie in plant embryo's onder een microscoop met behulp van de model-organisme Arabidopsis. Na de goedkeuring van de verse zaadknoppen met behulp van Hoyer de oplossing, het mobiele nummer in en morfologie van embryo's kon worden waargenomen en hun ontwikkelingsstadium door differentiële interferentie contrast microscopie met behulp van een 100 X olie-immersie objectief kan worden vastgesteld. Bovendien was de expressie van specifieke marker eiwitten gelabeld met Green Fluorescent Protein (GFP) gecontroleerd om te annoteren cel identiteit specificatie tijdens embryo patronen door confocale laser scanning microscopie. Dus, deze methode kan worden gebruikt om te observeren patroonformatie in wild-type plant embryo's de cellulaire en moleculaire niveau, en te karakteriseren van de rol van specifieke genen in embryonale patronen door het vergelijken van patroonformatie in embryo's van wild-type planten en embryo-dodelijke mutanten. Daarom kan de methode worden gebruikt om te karakteriseren embryogenese Arabidopsis.

De methode in dit artikel wordt beschreven kan worden gebruikt om te observeren embryogenese direct onder een Microscoop, de cel identiteit specificatie tijdens de embryogenese annoteren met specifieke markers en karakteriseren van de rol van een bepaald gen tijdens de embryogenese.
Representatieve resultaten van de analyse van embryo patronen (vanaf de fase van verlengde zygote naar de volwassen walking-stick-fase) in het wild-...

Dit protocol beschrijft een methode voor de waarneming van de embryogenese Arabidopsis via zaadknop goedkeuring, gevolgd door de inspectie van embryo patroonformatie onder een microscoop.

Een methode voor het karakteriseren van de embryogenese Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Het algemene doel van deze methode is om de patroonvorming van embryo's tijdens de plantembryogenese te karakteriseren met behulp van het modelorganisme. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van plantenzaken, zoals de embryogenese in Arabidopsis. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de patroonvorming van embryo's in de modelplant Arabidopsis gekarakteriseerd kan worden door de aanbevolen procedure.De procedure wordt gedemonstreerd door Jinlin Feng, een promovendus uit mijn laboratorium. Om deze procedure te starten, voegt u 100 zaden toe aan een buisje van 1,5 milliliter. Voeg één milliliter natriumhypochloriet toe om de zaden te steriliseren.Keer de buis meerdere malen om om er zeker van te zijn dat de zaden en de oplossing goed gemengd zijn. Centrifugeer de buis na vijf minuten 30 seconden bij 1200 Gs. Verwijder het supernatant en was de zaden vier keer met steriel water om eventueel resterend natriumhypochloriet te verwijderen.Voeg vervolgens 4,4 gram MS-basissaltmengsel en 10 gram sucrose toe aan één liter ultrapuur water. Roer tot het zout en de sucrose zijn opgelost. Gebruik kaliumhydroxide van één mol om de pH van de oplossing aan te passen naar 5,8.Voeg vervolgens drie gram gelling agent toe en steriliseer de oplossing bij 121 °C gedurende 15 minuten. Giet 30 ml van het resulterende MS-medium in een kweekschaal van 12 cm. Plaats de gesteriliseerde zaden op de MS-plaat.Plaats de plaat in een koelkast en bewaar deze gedurende drie dagen bij vier graden Celsius in het donker om de zaden te stratificeren. Bewaar de plaat vervolgens gedurende acht dagen in een groeikamer onder langdagecondities. Verplaats de planten daarna naar potgrond in een tray.Dek de tray af met een transparant wit deksel om waterverlies te voorkomen. Laat een kleine opening over om vitrificatie van de planten te vermijden. Verwijder na vijf dagen het deksel en kweek de planten in een klimaatkamer onder langdagcondities.Na ongeveer 20 dagen groei markeert u om 20:00 uur 10 tot 15 bloemknopjes op de positie van de zaadstengels en de bloeiwijze met een draad. Definieer het begin van de bestuiving van het ovulum als 08:00 uur de volgende ochtend, wanneer de gemarkeerde knoppen uitbloeien. Om de Hoyer-oplossing voor te bereiden, voegt u 24 gram chlorhydraat toe aan een buis van 50 milliliter. Wikkel de buis volledig in aluminiumfolie en zorg ervoor dat de folie al het licht buitensluit.Voeg negen milliliters ultrapuur water en drie milliliters glycerol toe. Schud de buis om het chlorhydraat op te lossen. Laat de bereide Hoyer-oplossing vervolgens een nacht bij kamertemperatuur staan om eventuele luchtbellen te verwijderen.Begin met het bevestigen van een stuk dubbelzijdige plakband aan een objectglas. Plaats een silique, die het gewenste aantal dagen na bestuiving is gegroeid, met de zijde met het pseudoseptum loodrecht op het oppervlak. Splits met een injectienaald de carpellen aan beide zijden van het pseudoseptum.Bevestig vervolgens de twee gedissecteerde carpellen aan het objectglas, zodat de zaadknopjes en de silique zichtbaar zijn onder een stereoscoop. Breng 70 µL Hoyer-oplossing aan op het objectglas. Doop vervolgens een fijne pincet in de oplossing om de punt te bevochtigen.Verplaats de zaadknopjes met behulp van het stereomicroscoop en een pincet naar de Hoyer-oplossing om de embryo's te reinigen. Breng daarna voorzichtig een dekglas aan op het preparaat, waarbij u erop let dat er geen luchtbellen ontstaan. Plaats het voltooide preparaat gedurende twee tot 12 uur bij kamertemperatuur in een doos in een donkere ruimte.Nadat de benodigde tijd is verstreken, wordt de DIC-functie van de microscoop gebruikt om de geklaarde zaadknoppen te onderzoeken. Lokaliseer de embryo's onder een laag vermogensveld en schakel vervolgens over naar een hoog vermogensveld om het cellulaire patroon in de ontwikkelde embryo's waar te nemen. Onderzoek vervolgens de embryo's in verschillende ontwikkelingsstadia.Begin met het voorbereiden van het DR5 GFP-plasmide en introduceer dit in de wild-type planten via agrobacterium-gemedieerde transformatie, zoals beschreven in het tekstprotocol. Selecteer de T1-planten met behulp van MS-mediumplaten die hydrolysine bevatten. Transfer en kweek vervolgens de planten zoals beschreven in het tekstprotocol om T3-planten te verkrijgen.Markeer met een draad de bloemknoppen van de homozygote T3-plant op de positie van de zaadstelen bij de bloeiwijze om 20:00 uur. Meng daarna drie milliliter glycerol met 47 milliliter ultrapuur water om een 6% glyceroloplossing te maken. Bevestig vervolgens een stukje dubbelzijdige plakband aan een microscoopglasplaatje. Plaats een silique van een T3-plant op het glaasje met het pseudoseptum loodrecht op het oppervlak.Splits met een injectienaald de carpellen aan beide zijden van het pseudoseptum. Bevestig de twee gedissecteerde carpellen aan het objectglas zodat de zaadjes en de silique zichtbaar zijn onder een stereoscoop. Breng vervolgens 30 µL 6% glycerol aan op het objectglas.Dompel een pincet met fijne punten in de oplossing om de punt te bevochtigen. Verplaats de ovula met behulp van het stereomicroscoop en het pincet naar de glyceroloplossing. Plaats voorzichtig een dekglas op het preparaatglas.Tik vervolgens snel en voorzichtig op het objectglas om het embryo uit het zaadknopje te drukken. Gebruik daarna confocale laserscanmicroscopie om het objectglas te onderzoeken op fluorescentie van het groen fluorescerende eiwit. Lokaliseer de geïsoleerde embryo's bij een lage vergroting en noteer hun positie.Schakel over naar een sterk vergrotend objectief en stel de excitatielichtbron in op 488 nanometer om de GR5 GFP-expressie in de embryo's te observeren. Detecteer vervolgens de GFP-expressie en karakteriseer de patroonvorming van het embryo zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze studie wordt de embryogenese bij Arabidopsis geobserveerd via ovulestrijming, zoals te zien is.Na het verwijderen van de zaadknopjes zijn de embryo's in verschillende ontwikkelingsstadia te onderscheiden met behulp van differentieel interferentiecontrastmicroscopie. Het expressiepatroon van GR5 GFP tijdens de embryogenese wordt vervolgens vastgelegd met confocale laser scanning microscopie. DR5 blijkt tot expressie te komen in de wortelpool van de globulaire en hartvormige embryo's van het wildtype.DR5 wordt tot expressie gebracht in de uiteinden van de embryonale kiemblaadjes en in de vasculatuur van volwassen wild-type embryo's. Vervolgens wordt de rol van naa10 in Arabidopsis tijdens de embryogenese onderzocht. De hypothese is dat de deling abnormaal verloopt, met scheve en verticale delingen in naa10 in vergelijking met de transversale asymmetrische deling in wild-type planten.Zoals hier te zien is, vertoont oxen een nagenoeg uniforme distributie in de meeste naa10-embryo's in het globulaire stadium, en behoudt het een breder signaal in de hypothesen vergeleken met wild-type embryo's. Deze resultaten geven aan dat naa10 vereist is voor embryogenese, en dat het in Arabidopsis via de oxen-signaleringsroute betrokken kan zijn. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden hoe Arabidopsis als plantmateriaal gekweekt moet worden.Na deze procedure kunnen andere maatregelen, zoals in-situ hybridisatie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de expressie van celspecifieke genen. Na de ontwikkeling hiervan maakt deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van embryogenese om het moleculaire mechanisme te verkennen waarmee specifieke genen de embryogenese in Arabidopsis mediëren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe embryogenese in Arabidopsis kan worden gekenmerkt.

a-method-for-characterizing-embryogenesis-in-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We beschrijven een protocol met behulp van dia's kamer en de media te planten zaadlobben voor confocale beeldvorming van de opperhuid te immobiliseren over meerdere dagen van de ontwikkeling, het documenteren van stomata differentiatie. Fluorofoor-gemerkte eiwitten kan dynamisch worden gevolgd door expressie en subcellulaire lokalisatie, het verhogen van het inzicht in de mogelijke rollen tijdens de celdeling en cel-type differentiatie.

Lange termijn, hoge resolutie Confocale Time Lapse Imaging van<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis Bij het ontkiemen

Wij rapporteren een efficiënte en eenvoudige methode om embryo's te isoleren in een vroeg stadium van de ontwikkeling...

Efficiënte en snelle isolatie van een vroeg stadium embryo&#39;s van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Zaden

We presenteren de procedure om een zaadhuid beddengoed assay (SCBA) monteren van Arabidopsis thaliana zaden. De MKBA bleek een krachtig instrument genetisch en in vitro onderzoeken worden hoe het endosperm controles zaadkieming slapende zaden en in reactie op licht signalen. De MKBA is in beginsel van toepassing onder elke situatie waar het endosperm wordt vermoed dat de embryonale groei beïnvloeden.

Een zaadhuid Bedding Assay om Genetisch Explore<em&gt; In Vitro</em&gt; Hoe de Endosperm Controls zaadontkieming in<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

Wij bieden hier een efficiënt en betrouwbaar protocol voor immunokleuringen, fluorescentie in situ hybridisatie, DNA kleuring gevolgd door kwantitatieve, hoge-resolutie beeldvorming in whole-mount Arabidopsis thaliana eitjes. Deze methode is succesvol gebruikt om chromatine modificaties en nucleaire architectuur te analyseren.

Een efficiënte methode voor kwantitatieve, single-cell analyse van chromatine modificatie en Nucleaire Architectuur in zijn geheel-mount Ovules in<em&gt; Arabidopsis</em

Het doel is om te illustreren dat het model-legume Medicago truncatula gemakkelijk kan worden gebruikt om de regulatie van vroege plantenembryogenese te onderzoeken als aanvulling op het niet-legume Arabidopsis-model. De morfologie van peulen is gekoppeld aan stadia van zygotische embryogenese en er wordt ook een protocol gegeven om embryo's te verzamelen met behulp van weefselkweek.

Protocollen voor het verkrijgen Zygotic en somatische embryo&#39;s voor het bestuderen van de verordening van de vroege embryo ontwikkeling in de Model Legume<em&gt; Medicago truncatula</em

Live confocale imaging biedt biologen met een krachtig hulpmiddel om de ontwikkeling te bestuderen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de live confocale beeldvorming van de ontwikkeling van Arabidopsis bloemen.

Live confocale Imaging van de ontwikkelingslanden Arabidopsis Flowers

Dit manuscript beschrijft een in vitro zaadknop cultivatiemethode die het mogelijk live-cel beeldvorming van Arabidopsis zygoten en embryo's maakt. Deze methode wordt gebruikt om te visualiseren de intracellulaire dynamiek tijdens de zygote polarisatie en de cel lot specificatie bij de ontwikkeling van de embryo's.

In Vitro Zaadknop teelt voor Live-cel Imaging van Zygote polarisatie en Embryo patronen in Arabidopsis thaliana

We demonstreren een methode om de succesvolle of mislukte bevruchting te bepalen op basis van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting met behulp van een epifluorescentie Microscoop.

Evaluatie van de bemesting staat door het traceren van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

Dit artikel beschrijft twee fenotyperingsmethoden zonder het gebruik van epidermale peelings om de genen te karakteriseren die de stomatale ontwikkeling regelen. De eerste methode demonstreert hoe een stomataal fenotype kan worden geanalyseerd met behulp van een toluidineblauwe O-gekleurde plantenepidermis. De tweede methode beschrijft hoe stomatale liganden te identificeren en hun biologische activiteiten te volgen.

Identificatie van de genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van stomato via epidermale fenotypescores

Hier beschrijven we een geavanceerd hulpmiddel dat is ontworpen voor het monitoren van de biosynthese van chlorofyl tijdens de vroege stadia van de de-etiolatie van Arabidopsis-zaailingen . De nieuwe methodologie biedt niet-invasieve real-time chlorofylfluorescentiebeeldvorming met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

Niet-invasieve test voor bepaling van de kinetiek van chlorofylbiosynthese tijdens vroege stadia van de-etiolatie van Arabidopsis

Leer een methode voor het karakteriseren van embryogenese in Arabidopsis met DIC-microscopie en GFP-markering. Dit protocol maakt gedetailleerde observatie van embryo-morfologie en genexpressiepatronen mogelijk.

Een methode voor het karakteriseren van de embryogenese Arabidopsis

Meer video's verkennen