ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd ondersteund door het Canadese Instituut voor Gezondheidsonderzoek PG # 20R47867.

1. Bepalen van relatieve celoppervlakteproteïnexpressie in astrocyten door biotinylering OPMERKING: Hier illustreren we de toepassing van deze biotinyleringstechniek op de studie van de effecten van het extracellulaire matrixmolecuul laminine op de celoppervlak lokalisatie van het waterdoorlaatbare kanaal aquaporin-4 (AQP4). Gespecialiseerde materialen die nodig zijn voor deze test omvatten sulfo-NHS-LC-biotine en streptavidine-agarosehars (zie tabel van materialen ). <ol><li> Met behulp van de methode beschreven in Noel et al. 12 , bereiden culturen van corticale astrocyten ongeveer 2 weken voorafgaand aan de test, en groeien ze in 75 cm2 geventileerde kweekflessen. Wanneer astrocyten 80 tot 90% samenvloeien, los ze los van het kweekoppervlak met 0,05% trypsine en ga dan 1: 3 door. </li><li> Bij 48 uur voorafgaand aan de test, wanneer cellen opnieuw 80-90% samenvloeien, worden de astrocyten 1: 3 vergeleken (rekening houdend met de cHangen in het cultuurformaat) op 60 mm celcultuurschotels, zodat ze&gt; 70% samenvloeien op de dag waarop het experiment plaatsvindt. Zorg ervoor dat cellen gelijkmatig verdeeld zijn. </li><li> Om 16 uur voorafgaand aan de analyse, pipette laminine in kweekmedium tot een uiteindelijke concentratie van 24 nM en incubeer bij 37 ° C. </li><li> Onmiddellijk voorafgaand aan de test bereiden het volgende op en plaats dan op ijs of in koelkast: CM-PBS (100 mg / L MgCl 2 × 6H 2 O en 100 mg / L CaCl 2 in 1X PBS, pH 7,4), biotine buffer Mg / ml sulfo-NHS-LC-biotine in CM-PBS), blusbuffer (50 mM NH4Cl in CM-PBS), lysisbuffer (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM glycine, 150 mM NaCl en 5 mM EDTA, 1% triton X-100, 1X proteaseremmercocktail), 3X laadbuffer (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% glycerol, 300 mM DTT en 0,01% bromfenolblauw) en wasbuffer Tris (pH 7,4), 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1X proteaseremmercocktail). </li><li> RemOve schotels die de astrocyte culturen van de incubator houden en het medium weggooien. </li><li> Was cellen driemaal met 4 ml gekoelde CM-PBS, en plaats de afwas op gebroken ijs. </li><li> Pipet 2 ml biotinebuffer in elke putje, en wijs voorzichtig een paar keer schotels heen en weer om volledige dekking te garanderen. Laat 30 minuten op ijs staan. </li><li> Verwijder de biotine buffer met behulp van een aspirator, en vervang met 4 mL quenching buffer. Laat 10 minuten op ijs staan. </li><li> Aspireer de quenching buffer, en vervang met een equivalent volume van hetzelfde. Nogmaals, laat 10 minuten op ijs. </li><li> Gooi de blusbuffer weg en was de cellen driemaal met 4 ml gekoelde CM-PBS. </li><li> Schraap cellen in 1 ml gekoelde CM-PBS met behulp van een cellift, en draag de suspensie over naar de microcentrifugebuis. </li><li> Pelletcellen door centrifugeren bij 100 xg gedurende 3 minuten. Gooi de supernatant weg en verwijder cellen opnieuw in 500 μl lysisbuffer. </li><li> Laat monsters op ijs voor 30 minuten, vortexen elke 5 minuten, of plDoe ze op een rotatie-end-end bij 4 ° C. </li><li> Centrifugeer het lysaat bij 14.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C om eventuele wasoplosbare materialen te pelletiseren. Breng de supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis. <ol><li> Sla 50 μL van deze lysaat op en voeg de laadbuffer eraan toe. Denatureer dan door verhitting bij 95 ° C in een droogbad; Dit is de &quot;input&quot; fractie, die zowel biotinyleerde celoppervlakte-eiwitten bevat als niet-biotinyleerde cytosolische eiwitten. </li></ol></li><li> Vergroot de opening van een pipettip door ongeveer 0,5 cm materiaal vanaf het uiteinde af te snijden met een paar scherpe scharen. Gebruik deze pipettip door 75 μL streptavidine-agarosepillen (normaal opgeslagen bij 4 ° C) op het lysaat te plaatsen en gedurende 3 uur bij 4 ° C op shaker / rocker te incuberen. <ol><li> Aangezien streptavidine-agarose vaak wordt verkocht als een suspensie die 50% kralen bevat, gesuspendeerd in een antimicrobiële oplossing, tritureren de suspensie om ervoor te zorgen dat de kralenWorden gelijkmatig opgeschort, en pipet vervolgens 150 μl van de suspensie in elk monster. </li></ol></li><li> Pellet streptavidine-agarose kralen door centrifugeren bij 1500 xg gedurende 30 s bij 4 ° C. <ol><li> Bespaar 50 μL van de supernatant (voeg laadbuffer toe en ontkal het bij 95 ° C in een waterbad of verwarmingsblok); Dit vertegenwoordigt de &quot;intracellulaire&quot; fractie, en bestaat voornamelijk uit niet-biotinyleerde cytosolische eiwitten. </li></ol></li><li> Resulteer de gepelleteerde kralen in 1 ml wasbuffer en roer dit gedurende 3 minuten bij 4 ° C. Pelletkralen (zoals in stap 1.16), en weggooien de supernatant. Herhaal dit proces 4x om de nonspecifieke binding van niet-biotinyleerde cytosolische eiwitten te minimaliseren. </li><li> Pellet de kralen door centrifugeren (1500 xg gedurende 30 s bij 4 ° C) en gooi de overliggende wasbuffer weg. Voeg 50 μl 1X laadbuffer toe (verdund met behulp van lysisbuffer). Laat biotine en streptavidine los van kralen door deze bij 95 ° C te denatureren; Deze fractie shoUld bevatten alleen biotinyleerde celoppervlakte-eiwitten (&quot;celoppervlak&quot; fractie). <ol><li> Afzonderlijke invoer, celoppervlak en intracellulaire fracties door SDS-PAGE 13 , en analyseren door western blotting 14 . OPMERKING: Terwijl we in onze experimenten een 4 - 20% precastgradiëntgel gebruikt hebben, zou een 12 - 14% scheidingsgel met een 4% stapellaag (elk 0,1% SDS) voldoende moeten zijn voor de eiwitten die van belang zijn voor deze studie. Een molecuulgewichtstandaard van het passende afmetingsbereik zou ook moeten worden gebruikt. Merk op dat er soms een waarneembare upshift in de schijnbare moleculaire massa&#39;s van biotinyleerde eiwitten kan zijn. </li></ol></li></ol> 2. Bepalen van de internaliseringssnelheid van celoppervlakteproteïnen in astrocyten door biotinylering OPMERKING: In het volgende beschrijven we een typisch pulse-chase biotinylatie experiment dat in dit geval gebruikt wordt om de endocytose van AQP4 bij astrocyten te volgen. DezeMethode is gebaseerd op die van Madrid et al. 15 . Specifieke materialen benodigd zijn onder meer sulfo-NHS-SS-biotine, streptavidine-agarosehars, verminderde glutathion en jodacetamide (zie de Tabel van Materialen ). <ol><li> Bereid cultures van muizencorticale astrocyten in 60 mm schotels aan met behulp van de methoden die in het vorige gedeelte zijn beschreven. Zorg ervoor dat de cellen ongeveer 70% confluent zijn op de dag van de test, en dat elke schotel een equivalent aantal cellen bevat. </li><li> Onmiddellijk voorafgaand aan de test bereiden het volgende op en plaats op ijs of in koelkast: CM-PBS (100 mg / L MgCl 2 × 6H 2 O en 100 mg / L CaCl 2 in 1X PBS, pH 7,4), biotine buffer (0,5 Mg / ml sulfo-NHS-SS-biotine in CM-PBS), reducerende buffer (50 mM gereduceerd glutathion, 75 mM NaCl en 75 mM NaOH), blusbuffer (50 mM iodoacetamide, 1% BSA, in CM-PBS) Lysisbuffer (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM glycine, 150 mM NaCl en 5 mM EDTA, 1% triton X-100, 1X-proteaseremmerscocktail), 3X laadbuffer (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% glycerol, 300 mM DTT en 0,01% broomfenolblauw) en wasbuffer (10 mM Tris, pH 7,4, 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% triton X-100, 1X proteaseremmercocktail). </li><li> Bereid het frisse celcultuurmedium op (DMEM aangevuld met 10% Fetale Bovine Serum (FBS), 1% Penicilline / Streptomycine en 1% L-Glutamine) en plaats het in een 37 ° C waterbad. </li><li> Verwijder astrocyte culturen uit de incubator en aspireren het medium met behulp van een aspirator. </li><li> Was cellen driemaal met 4 ml gekoelde CM-PBS, en plaats de afwas op gebroken ijs. </li><li> Pipet 3 ml biotinebuffer in elk gerecht, kantel gereedschap heen en weer een paar keer om ervoor te zorgen dat de buffer goed verdeeld is en laat dit 30 minuten op ijs staan. </li><li> Aspiratie biotine buffer, en vervang het met 5 ml warm medium. Incubeer een kweekschotel bij 37 ° C gedurende 15 minuten en een tweede schotel bij dezelfde temperatuur gedurende 30 minuten. Laat een andere schotel op 46; C als de 0 min monster. </li><li> Aan het einde van de incubatieperiode, weggooi medium en wascellen driemaal met 4 ml gekoelde CM-PBS. Pipet 6 ml reducerende buffer over cellen, en laat 15 minuten op ijs. </li><li> Verwijder de reducerende buffer, en vervang dan met 6 ml verse reductieruimte. Plaats op ijs voor nog eens 15 minuten. </li><li> Verwijder de reducerende oplossing en vervang met 6 mL quenching buffer. Verlaat op ijs voor 15 minuten. </li><li> Herhaal de quenching stap nogmaals. </li><li> Gooi de blusbuffer weg en was de cellen driemaal met 4 ml gekoelde PBS. </li><li> Schraap cellen in 1 ml gekoelde PBS met behulp van een cellift, en verplaats de suspensie in een microcentrifugebuis. </li><li> Pelletcellen door centrifugeren bij 100 xg gedurende 3 minuten. Gooi de supernatant weg en verwijder cellen in 500 μl lysisbuffer. </li><li> Laat dit 30 minuten per ijs en vortex elke 5 minuten. Als alternatief plaatst u de monsters op een eind-over-end rotator bij 4 ° C gedurende deze duur. </li><li> Centrifugeer de lyZat bij 14.000 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C om de detergent-onoplosbare materialen te pelletiseren en vervolgens supernatant over te brengen naar een nieuwe microcentrifugebuis. Sla 50 μL van dit lysaat op, voeg de laadbuffer er toe en denatureer bij 95 ° C in een droogbad; Dit is de &quot;input&quot; fractie, die zowel biotinyleerde endocytose-eiwitten bevat als niet-biotinyleerde eiwitten. </li><li> Met een snijpipettaart voeg 150 μL van de streptavidine-agarose-slurry toe aan het lysaat en incubeer gedurende 3 uur bij 4 ° C op shaker / rocker. Zie 1.15 voor meer informatie over deze stap. </li><li> Pellet streptavidine-agarose kralen door centrifugeren bij 1500 xg gedurende 30 s bij 4 ° C. </li><li> Resulteer kralen in 1 ml wasbuffer en roer 3 min bij 4 ° C. Pelletkralen (zoals in stap 2.18), en weggooien de supernatant. Herhaal dit proces 4x om de nonspecifieke binding van niet-biotinyleerde cytosolische eiwitten te minimaliseren. </li><li> Pelletkralen door centrifugeren bij 1500 xg gedurende 30 s bij 4 ° C en weggooienWassen buffer. Voeg 50 μl 1X laadbuffer toe (verdund met behulp van lysisbuffer). Laat biotine en streptavidine los van kralen door denatureren bij 95 ° C; Deze fractie zou alleen geïndividualiseerde cel-oppervlakte eiwitten moeten bevatten (&quot;endocytose&quot; fractie). </li><li> Afzonderlijke invoer, celoppervlak en ongebonden fracties door SDS-PAGE 13 , en analyseren door western blotting 14 . OPMERKING: Terwijl we in onze experimenten een 4 - 20% precastgradiëntgel gebruikt hebben, zou een 12 - 14% scheidingsgel met een 4% stapellaag (elk 0,1% SDS) voldoende moeten zijn voor de eiwitten die van belang zijn voor deze studie. Een molecuulgewichtstandaard van het passende afmetingsbereik zou ook moeten worden gebruikt. Merk op dat er soms een waarneembare upshift in de schijnbare moleculaire massa&#39;s van biotinyleerde eiwitten kan zijn. </li></ol>

<ol><li>Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+1+inhibits+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis+and+down-regulation+in+cultured+fetal+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes.</a> J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).</li>
<li>Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+internalization+of+fluorescent+gonadotropin-releasing+hormone+by+pituitary+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).</li>
<li>Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+uptake+and+release+by+reticulocytes+treated+with+proteolytic+enzymes+and+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase.</a> Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).</li>
<li>Katsura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+and+regulated+membrane+expression+of+aquaporin+1+and+aquaporin+2+water+channels+in+stably+transfected+LLC-PK1+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).</li>
<li>Li, Y., Cam, J., Bu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+receptor+family%3A+endocytosis+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction.</a> Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).</li>
<li>Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+possible+identity+of+vitamin+H+with+biotin+and+coenzyme+R%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R.</a> Science. 91 (2358), 243-245 (1940).</li>
<li>Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation%3A+an+alternative+to+radioiodination+for+the+identification+of+cell+surface+antigens+in+immunoprecipitates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates.</a> Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin+1.+the+use+of+%5B14-C%5Dbiotin+for+kinetic+studies+and+for+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay.</a> Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).</li>
<li>Korpela, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin%2C+a+high+affinity+biotin-binding+protein%2C+as+a+tool+and+subject+of+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research.</a> Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pHluorin-tagged+receptor+insertion+to+the+plasma+membrane+in+primary+cultured+mouse+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons.</a> J Vis Exp. (69), e4450(2012).</li>
<li>Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+clathrin-mediated+endocytosis+of+G+protein-coupled+receptors+at+single-event+resolution+via+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy.</a> J Vis Exp. (92), e51805(2014).</li>
<li>Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdependence+of+laminin-mediated+clustering+of+lipid+rafts+and+the+dystrophin+complex+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes.</a> J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Madrid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+trafficking+and+surface+expression+of+the+AQP4+water+channel+are+coordinated+by+serial+and+regulated+interactions+with+different+clathrin-adaptor+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes.</a> EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).</li>
<li>Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+Cell-Surface+Expression+and+Turnover+Are+Regulated+by+Dystroglycan%2C+Dynamin%2C+and+the+Extracellular+Matrix+in+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes.</a> PLoS One. 11 (10), 0165439(2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

wijzigingen: Aangezien deze methoden zijn ontworpen voor gebruik met hechtende cellen, hebben we het gebruik van PBS die 100 mg / L MgCl 2 × 6H 2 O bevat en 100 mg / l CaCl2 (CM-PBS) voor de wasstappen en als basis van bepaalde buffers om ervoor te zorgen dat de cellen vast blijven aan het kweekoppervlak en dat celcelverbindingen niet verstoord raken. De protocollen kunnen echter ook toegepast worden op niet-adherente celtypes als de cellen tusse...

Proteïnen op het celoppervlak spelen een verscheidenheid aan rollen die centraal zijn om de celfunctie te behouden. In talrijke gevallen is hun activiteit afhankelijk van of gemoduleerd door endocytische processen die hen tijdelijk in intracellulaire plaatsen sequesteren, of die hen leiden tot afbrekende wegen 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Hier worden 2 biotinylatiegebaseerde benaderingen benadrukt die zijn ontworpen om de gebruiker in staat te stellen specifiek te taggen en isoleren van eiwitten die uitgedrukt zijn in het plasmamembraan, en die recent geïnternaliseerd. Via deze methoden kan de celoppervlak expressie en endocytische snelheid van elk eiwit van belang worden gekwantificeerd, waardoor een duidelijkere beoordeling van de regulering ervan kan worden bereikt. Bepalen van relatieve celoppervlakte eiwit expressie door biotinylatie Biotine, of vitamine B7, voorheen bekend als vitamine H6, is een klein wateroplosbaar molecuul dat kan worden gebruikt om reactieve amine-, sulfhydryl- en carboxylgroepen biologische moleculen chemisch te wijzigen. Het huidige gewas biotinyleringsreagens van celoppervlak bestaat hoofdzakelijk uit membraan-impermeante gesulfoneerde N-hydroxysuccinimide (sulfo-NHS) esters van biotine of derivaten daarvan, die zijn ontworpen om te reageren met de aanwezige aminen aan de zijketens van lysine residuen van eiwitten uitgedrukt in Het celoppervlak wanneer deze worden gedeprotoneerd onder basisomstandigheden, waardoor de laatste een amidebinding met het biotine-gedeelte 7 vormt . Zodoende gemodificeerde celoppervlakte-eiwitten kunnen dan worden geïsoleerd via het gebruik van avidin, een 66-69 kDa tetramerisch eiwit dat grote affiniteit voor biotine bezit, die bindt aan de laatste met een dissociatieconstante van ongeveer 10-15, het markeren als een van de Sterkste niet-covalente interacties bekend 8 </suP&gt; , 9 . Een aantal alternatieve methoden voor het kwantificeren van eiwituitdrukking bij het celoppervlak zijn in eerdere studies gebruikt. De etikettering van niet-gemanimaliseerde cellen die gebruik maken van fluorescent gemerkte antilichamen die specifiek zijn voor het eiwit van belang, gevolgd door visualisatie via fluorescentiemicroscopie, is bijvoorbeeld een veelgebruikte aanpak, maar is sterk afhankelijk van de beschikbaarheid van antilichamen die kunnen binden aan extracellulaire epitopen. Meer recentelijk zijn ook methoden die het gebruik van chimere eiwitten met pH-gevoelige fluoroforen bevatten die reageren op blootstelling aan zure media 10 toegepast. Echter, dergelijke assays betreffen gewoonlijk de exogene expressie van deze constructen in cellijnen waarin het eiwit van belang niet natief gevonden wordt. Deze benaderingen zijn niettemin in staat om waardevolle informatie te verstrekken over de subcellulaire lokalisatie en exocytische route van deDoelwit eiwit, en moet daarom worden gebruikt in combinatie met de biotinylatie-gebaseerde benaderingen die hier worden beschreven als de gereedschappen beschikbaar zijn. Bij een typische biotinyleringsassay worden de cellen eerst grondig gewassen in 4 ° C PBS. Dit verwijdert eventuele sporen van serumproteïnen die door het kweekmedium worden geïntroduceerd, waardoor men ervoor zorgt dat deze niet in de volgende stap overmatige hoeveelheden biotine zullen verbruiken. Belangrijker nog, de vermindering van de temperatuur veroorzaakt endocytose om aanzienlijk te vertragen. Het biotinyleringsreagens wordt vervolgens toegevoegd. Vervolgens worden de cellen opnieuw gewassen en vervolgens geïncubeerd met een blusbuffer die glycine of NH4Cl bevat, die alle resterende sporen van niet gereageerd biotine inactivert. De cellen worden vervolgens gelicht, waarna agarose-geïmmobiliseerde streptavidine wordt toegevoegd om de biotinyleerde eiwitten te precipiteren. Analyse wordt gewoonlijk uitgevoerd via western blotting, waardoor de relatieve celoppervlak expressie van verschillende prOteins worden gekwantificeerd. Door de basis van deze analyse is het alleen geschikt voor gebruik met eiwitten die porties hebben blootgesteld aan de extracellulaire omgeving. Multipass transmembrane eiwitten, die waarschijnlijk een aantal reactieve lysinen bezitten binnen hun lusregio&#39;s, zijn de meest vatbaar voor deze methode, terwijl enkel-pass eiwitten minder gevoelig zijn voor biotinyleerde. Zelfs in deze gevallen blijft er een mogelijkheid dat conformatieve veranderingen of intermoleculaire interacties bepaalde reactieve plaatsen kunnen afsluiten, wat resulteert in een lager dan verwachte biotinylatieopbrengst. Bepalen van de internaliseringssnelheid van celoppervlakte-eiwitten door biotinylering De principes van deze analyse zijn grotendeels vergelijkbaar met die van de celoppervlakbiotinylatie, met een aantal uitzonderingen, waarvan het belangrijkste het gebruik is van omkeerbare biotinyleringsreagentia. De biotine groepen (van deze) bezitten disuLfide bindingen, in hun structuren die gevoelig zijn voor reductiemiddelen; Dit wordt geëxploiteerd om ervoor te zorgen dat alleen celoppervlakte-eiwitten die in intracellulaire plaatsen worden genomen gedurende de testperiode biotinyleren zullen worden gelaten. Een assay vindt over het algemeen plaats op de volgende wijze. De cellen worden eerst gewassen en biotinyleerd met koude reagentia, vervolgens wordt celcultuurmedium bij 37 ° C opnieuw geïntroduceerd en worden de cellen teruggebracht naar de incubator; Dit zorgt ervoor dat de gelabelde celoppervlakte-eiwitten endocytose ondergaan. Het reductiemiddel glutathion - dat het membraan niet kan binnendringen - wordt vervolgens toegevoegd om de disulfidebindingen van de biotine-delen te verbreken die zijn gehecht aan eiwitten die overblijven op het celoppervlak. Tenslotte worden de gebroken disulfidebindingen gereageerd met iodoacetamide, waarbij de labiele thiolgroepen worden verbruikt en de bindingen voorkomen worden van hervorming. Zoals eerder worden de cellen gelyseerd en worden de gelabelde eiwitten neergeslagen met behulp van streptavidine-agarose. De beperkingen schijfToegepast in het vorige gedeelte, gelden hier ook als gevolg van de overeenkomsten die tussen de methoden worden gedeeld. Bovendien is het de moeite waard in gedachten te houden dat de temperatuurverschuivingen die bij deze analyse betrokken zijn, de precieze bepaling van hoeveel eiwit voor elke tijdsvermindering endocytose verloopt, in het bijzonder bij snel geïnternaliseerde of snel recycle eiwitten voorkomt. De analyse verschaft daarom alleen een semiquantitatieve schatting van endocytische percentages. Totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie kan gebruikt worden om de opname van elke geladen vesikel op te sporen en een nauwkeuriger meting van de kinetiek van endocytose te geven. Het kan derhalve een zeer nuttige aanvulling op deze bepaling verschaffen, ervan uitgaande dat een fluorescerend gemerkte chimere construct van het geïnde eiwit 11 beschikbaar is.

<table><tbody><tr><td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-50</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenolblauw</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610404</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Dinatrium Ethyleen-diaminetetraacetaat dihydraat (EDTA)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610729</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610611</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21335</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21331</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Iodoaceetamide</td><td>Bio-Rad</td><td>#163-2109</td><td></td></tr><tr><td>Laminine uit Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoom basaalmembraan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Ontdooi op ijs.</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Muis monoklonaal anti-&beta;-actine antilichaam (AC-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>Muis monoklonaal anti-&beta;-dystroglycan antilichaam (43DAG1/8D5)</td><td>Leica Biosystems</td><td>B-DG-CE</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Ezel anti-Muis IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Geit anti-Konijn IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat-bufferoplossing met zout (PBS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Gereduceerd glutathion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6529</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>862010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine agarosehars</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#20347</td><td></td></tr><tr><td>Konijn polyklonaal anti-AQP4 antilichaam</td><td>Alomone</td><td>AQP-004</td><td></td></tr><tr><td>Tris base (Trizma base)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

bepaling van de expressie van de celoppervlakte en de endocytische snelheid van eiwitten in primaire astrocytekulturen met behulp van biotinylering

Cell-oppervlakte eiwitten bemiddelen een breed scala aan functies. In veel gevallen wordt hun activiteit gereguleerd door endocytische processen die hun niveaus op het plasmamembraan moduleren. Hier presenteren we gedetailleerde protocollen voor 2 methoden die de studie van dergelijke processen vergemakkelijken, die beide gebaseerd zijn op het principe van biotinylering van celoppervlakte-eiwitten. De eerste is ontworpen om de semi-kwantitatieve bepaling van de relatieve niveaus van een bepaald eiwit op het celoppervlak toe te staan. Daarin worden de lysine residuen van de plasmamembraan eiwitten van cellen eerst gemerkt met een biotine groep. Zodra de cellen zijn gelicht, kunnen deze eiwitten dan specifiek worden geprecipiteerd via het gebruik van agarose-geïmmobiliseerde streptavidine door de natuurlijke affiniteit van deze laatste voor biotine te exploiteren. De op dergelijke wijze geïsoleerde eiwitten kunnen dan worden geanalyseerd via een standaard western blotting benadering. De tweede methode verschaft een middel om de endocytische snelheid van een deeltje te bepalenHet doel van het celoppervlak over een periode van tijd. Cell-oppervlakte eiwitten worden eerst gemodificeerd met een biotin derivaat dat een splitsbare disulfide binding bevat. De cellen worden dan teruggeschoven naar normale kweekomstandigheden, waardoor de endocytische opname van een aandeel biotinyleerde eiwitten wordt veroorzaakt. Vervolgens worden de disulfidebindingen van niet-geïnternaliseerde biotine groepen verminderd met gebruikmaking van het membraan-impermeabele reductiemiddel glutathion. Via deze aanpak kunnen geëntocytoseerde eiwitten worden geïsoleerd en gekwantificeerd met een hoge mate van specificiteit.

Gebruik biotinylatie op celoppervlak om de plasmamembraanuitdrukking van AQP4 in astrocyten te beoordelen Laminine-behandelde astrocyteculturen en onbehandelde controlecellen werden onderworpen aan cel-oppervlakbiotinylatie onder toepassing van de beschreven methoden. Biotinyleerde eiwitten werden geprecipiteerd met agarose-geconjugeerde streptavidine, en vervolgens afgescheiden via SDS-PAGE. Cell-oppervlakfracties werden getest op AQP4 en β-dystroglycan (β-DG) al...

Twee biotinylatie-gebaseerde methoden, ontworpen voor het bepalen van de expressie van de celoppervlak en de endocytische snelheid van eiwitten uitgedrukt in het plasmamembraan, worden in dit rapport weergegeven.

Bepaling van de expressie van de celoppervlakte en de endocytische snelheid van eiwitten in primaire astrocytekulturen met behulp van biotinylering

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

In deze video worden twee methoden gepresenteerd, celoppervlakte biotinylering en pulse-chase biotinylering. In de volgende demonstratie zullen we astrocyten gebruiken. Dit zijn de meest voorkomende gliacellen in de hersenen, en ze blijken ons eiwit van belang te produceren, dat is Aquaporin-4.De methoden die we in dit artikel gebruiken, kunnen worden toegepast op veel verschillende celtypen, en dat kunnen zowel cellen in suspensie als adherente cellen zijn. Deze technieken kunnen worden gebruikt om de expressie aan het celoppervlak en internalisatie van vrijwel elk transmembraaneiwit te bestuderen, zolang het een extracellulair domein bezit dat toegankelijk is voor biotin. Het algemene doel van deze celoppervlakte biotinyleringstest is om de effecten van laminine op de expressie van het waterdoorlatende kanaal Aquaporin-4 te bepalen aan het plasmamembraan van astrocyten.Om deze procedure te beginnen, verwijdert u de astrocytenculturen uit de incubator en gooit het medium weg door aspiratie. Was de cellen driemaal met vier milliliter gekoeld CM-PBS en plaats de schalen op verpletterd ijs. Verwijder de CM-PBS door aspiratie en pipet vervolgens twee milliliter biotin buffer in elke put.Kanteel de schalen een paar keer voor en achter om volledige dekking te garanderen voordat u de culturen 30 minuten op ijs plaatst. Verwijder daarna de biotin buffer, vervang deze met vier milliliter blusbuffer en houd de culturen 10 minuten op ijs. Aspiraat vervolgens en vervang door dezelfde hoeveelheid blusbuffer voordat u de culturen nogmaals 10 minuten op ijs laat staan.Gooi vervolgens de blusbuffer weg en was de cellen driemaal met vier milliliter gekoeld CM-PBS. Schrob vervolgens de cellen in één milliliter gekoeld CM-PBS en breng de suspensie over naar een microcentrifugebuisje. Pel de cellen vervolgens door centrifugatie bij 100 g gedurende drie minuten in een gekoelde microcentrifuge ingesteld op vier graden Celsius.Vervolgens gooit u de supernatant weg en suspendeert u de cellen in 500 microliter lysisbuffer. Laat vervolgens de monsters 30 minuten op ijs staan, terwijl u elke vijf minuten voorzichtig schudt. Centrifugeer vervolgens het lysaat bij 14.000 g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius om alle detergent en oplosbare materialen te pellen.Vervolgens brengt u het supernatant over naar een nieuw microcentrifugebuisje. Bewaar 50 microliter van het lysaat en voeg 25 microliter van drie keer laadbuffer toe. Denatureer het vervolgens door het te verwarmen tot 95 graden Celsius in een droog bad.Dit is de inputfractie, die zowel biotinylerde celoppervlakte-eiwitten als niet-biotinyleerde cytosolische eiwitten bevat. Gebruik een afgesneden pipettip om 75 microliter streptavidin agarose korrels naar het lysaat over te brengen en incubeer het gedurende drie uur op vier graden Celsius op een shaker. Pel vervolgens de streptavidin agarose korrels door centrifugatie bij 1.500 g gedurende 30 seconden bij vier graden Celsius.Bewaar 50 microliter van de supernatant en voeg 25 microliter van drie keer laadbuffer toe. Denatureer het vervolgens bij 95 graden Celsius in een waterbad of een verwarmingsblok. Dit vertegenwoordigt de intracellulaire fractie en bestaat voornamelijk uit niet-biotinyleerde cytosolische eiwitten.Resuspendeer vervolgens de bepelletingskorrels in één milliliter wasbuffer en schud het gedurende drie minuten bij vier graden Celsius. Pel de korrels en gooi de supernatant weg. Herhaal dit proces nog vier keer om de niet-specifieke binding van niet-biotinyleerde cytosolische eiwitten te minimaliseren.Voeg 50 microliter laadbuffer toe, verdund tot een keer met behulp van lysisbuffer. Ontbind biotin en streptavidin van de korrels door ze te denatureren bij 95 graden Celsius. Deze fractie zou alleen biotinylerde celoppervlakte-eiwitten moeten bevatten.Vervolgens scheiden we de input, celoppervlakte en intracellulaire fracties door SDS-PAGE en analyseren door middel van western blotting. Het algemene doel van de pulse-chase biotinyleringstest is om de geschatte internalisatie van Aquaporin-4 in astrocyten te bepalen. Verwijder eerst de astrocytenculturen uit de incubator en zuig het medium op.Was vervolgens de cellen driemaal met vier milliliter gekoeld CM-PBS en plaats de schalen op verpletterd ijs. Zuig de CM-PBS op en pipet vervolgens drie milliliter biotin buffer in elke schaal. Kanteel de schalen een paar keer voor en achter om ervoor te zorgen dat de buffer goed verdeeld is en laat ze 30 minuten op ijs staan.Vervolgens zuigt u de biotin buffer weg en vervangt u deze door vijf milliliter warm medium. Incubeer één cultuurschaal bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten en een tweede schaal bij dezelfde temperatuur gedurende 30 minuten. Laat een andere schaal op vier graden Celsius staan als nulminuut monster.Aan het einde van de incubatieperiode gooit u het medium weg en was de cellen driemaal met vier milliliter gekoeld CM-PBS. Aspiraat vervolgens de CM-PBS en pipet zes milliliter reducerende buffer over de cellen en laat het monster 15 minuten op ijs staan. Vervolgens vervangt u het medium door zes milliliter vers reducerende buffer en plaatst u het monster nogmaals 15 minuten op ijs.Deze stap is cruciaal, omdat de glutathion in de reducerende buffer het biotin moaisi dat op het celoppervlak achterblijft, zal afsplitsen. Dit zorgt ervoor dat alleen geïnternaliseerde eiwitten worden gelabeld met biotin. Vervolgens verwijdert u de reducerende oplossing en vervangt u deze door zes milliliter blusbuffer.Laat het monster nog eens 15 minuten op ijs staan en herhaal de blusstap nog een keer. Gooi vervolgens de blusbuffer weg en was de cellen driemaal, met vier milliliter gekoeld PBS. Zuig de CM-PBS op en schraap de cellen in één milliliter gekoeld PBS, met behulp van een cellift, en breng de suspensie over in een microcentrifugebuisje.Pel de cellen door centrifugatie bij 100 g gedurende drie minuten. Na drie minuten gooit u de supernatant weg en suspendeert u de cellen in 500 microliter lysisbuffer. Laat het monster 30 minuten op ijs staan en schud elke vijf minuten.Centrifugeer het lysaat bij 14.000 g, gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, om het detergent en oplosbare materialen te

determining-cell-surface-expression-endocytic-rate-proteins-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Gereglementeerde endocytose regelt de cel oppervlakte-expressie niveaus van de meerderheid van de membraaneiwitten. Hier maken wij gebruik van herleidbaar, membraan impermeant biotinylatie reagentia aan de endocytische koers van de dopamine transporter (DAT), een membraaneiwit polytopic te meten. De methode maakt een directe benadering van het meten van de endocytische snelheid van de meeste plasma-membraan eiwitten.

Het meten van plasma membraaneiwit endocytische de tarieven door Omkeerbare biotinylatie

This video demonstrates the isolation of cell-surface and intracellular proteins from an astrocyte culture. The astrocyte culture is placed on ice to inhibit endocytosis, and then the cell-surface proteins are labeled with a biotinylation reagent. The cells are lysed to release the biotinylated cell-surface proteins and non-biotinylated intracellular proteins. Finally, streptavidin-coated beads are used to separate the biotinylated cell-surface proteins from the intracellular proteins.

Isolation of Cell-Surface and Intracellular Proteins from an Astrocyte Culture

This video demonstrates a method to assess target protein internalization in the mouse cortical astrocytes using biotinylation, followed by cell lysis, streptavidin-based protein extraction, denaturation, and Western blot analysis to confirm successful internalization.

Assessing the Internalization of  Target Surface Proteins Using a Biotin Derivative

Source: Creighton, B. A., et al. Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the visualization of intracellular cargo transport in cultured astrocytes using a fluorescent acidotropic probe that selectively labels acidic endolysosomal vesicles. Time-lapse imaging and Z-stack acquisition with a confocal microscope allow tracking of fluorescently labeled cargo throughout the three-dimensional cell volume.

Visualizing Intracellular Transport of Cargo in Cultured Astrocytes

Membraantransport omvat het transport van eiwitten van het plasmamembraan naar het celinterieur (d.w.z. endocytose) gevolgd door transport naar lysosomen voor afbraak of naar het plasmamembraan voor recycling. De methoden die in dit artikel worden beschreven, zijn ontworpen om endocytose en recycling van plasmamembraaneiwitten te bestuderen.

De op cellen gebaseerde L-glutathionebeschermingstests om endocytose en recycling van plasmamembraaneiwitten te bestuderen

Neuronale membraan mensenhandel stelt dynamisch plasmamembraaneiwit beschikbaarheid en significant invloed neurotransmissie. Tot op heden, is het een uitdaging om neuronale endocytische handel in volwassen neuronen te meten. Hier beschrijven we een zeer effectieve, kwantitatieve methode om snelle veranderingen in de oppervlakte-eiwit expressie ex vivo bij acute plakjes hersenen te meten.

Brain Slice Biotinylatie: An Ex Vivo Aanpak Regiospecifieke van plasma membraaneiwit Trafficking Meet in Adult Neuronen

Erfelijke hartritmestoornissen worden vaak veroorzaakt door mutaties die de oppervlakte levering van één of meer ionkanalen wijzigen. Hier passen we flowcytometrie assays een kwantificering van de relatieve totale en celoppervlak-eiwit expressie van recombinant ionenkanalen tot expressie gebracht in TSA-201 cellen.

Bepaling van de Relatieve celoppervlak en Total Expressie van recombinant Ion kanalen met flowcytometrie

Gepresenteerd hier is een protocol dat combineert een in vitro neurale-endotheliale co-cultuur systeem en metabole opname van sialoglycan met bioorthogonal functionele groepen uit te breiden primaire zenuw stam en voorlopercellen en label hun oppervlak sialoglycoproteïnen voorbeeld vorming of massaspectrometrie analyse van celoppervlak markeringen.

Identificeren van celoppervlak markeringen van primaire neurale stam en voorlopercellen door metabole labeling van Sialoglycan

Dit artikel presenteert een methode voor de studie van glutamaat receptor (glur) handel in gezien primaire hippocampal culturen. Met behulp van een antilichaam-voedende benadering voor het etiket van endogene of overexpressie receptoren in combinatie met farmacologische benaderingen, deze methode maakt het mogelijk voor de identificatie van moleculaire mechanismen regulering van GluR oppervlakte expressie door modulerende processen voor internalisatie of recycling.

Een aanpak van antilichamen voeding te bestuderen glutamaat receptor handel in Dissociated primaire Hippocampal culturen

Hier beschrijven we een in vitro Live-imaging methode om intracellulair transport van organellen en de handel in plasma membraan eiwitten in muriene astrocyten te visualiseren. Dit protocol presenteert ook een analysemethode voor het vrachtvervoer en kinetiek.

Visualisering en analyse van intracellulair transport van organellen en andere Cargo's in astrocyten

Onderzoek biotinyleringsmethoden voor het beoordelen van celoppervlakteexpressie en endocytische rates van eiwitten, met de focus op Aquaporine-4 in astrocyten.