Bepaling van de expressie van de celoppervlakte en de endocytische snelheid van eiwitten in primaire astrocytekulturen met behulp van biotinylering
July 3rd, 2017
Twee biotinylatie-gebaseerde methoden, ontworpen voor het bepalen van de expressie van de celoppervlak en de endocytische snelheid van eiwitten uitgedrukt in het plasmamembraan, worden in dit rapport weergegeven.
In deze video worden twee methoden gepresenteerd, celoppervlakte biotinylering en pulse-chase biotinylering. In de volgende demonstratie zullen we astrocyten gebruiken. Dit zijn de meest voorkomende gliacellen in de hersenen, en ze blijken ons eiwit van belang te produceren, dat is Aquaporin-4.
De methoden die we in dit artikel gebruiken, kunnen worden toegepast op veel verschillende celtypen, en dat kunnen zowel cellen in suspensie als adherente cellen zijn. Deze technieken kunnen worden gebruikt om de expressie aan het celoppervlak en internalisatie van vrijwel elk transmembraaneiwit te bestuderen, zolang het een extracellulair domein bezit dat toegankelijk is voor biotin. Het algemene doel van deze celoppervlakte biotinyleringstest is om de effecten van laminine op de expressie van het waterdoorlatende kanaal Aquaporin-4 te bepalen aan het plasmamembraan van astrocyten.
Om deze procedure te beginnen, verwijdert u de astrocytenculturen uit de incubator en gooit het medium weg door aspiratie. Was de cellen driemaal met vier milliliter gekoeld CM-PBS en plaats de schalen op verpletterd ijs. Verwijder de CM-PBS door aspiratie en pipet vervolgens twee milliliter biotin buffer in elke put.
Kanteel de schalen een paar keer voor en achter om volledige dekking te garanderen voordat u de culturen 30 minuten op ijs plaatst. Verwijder daarna de biotin buffer, vervang deze met vier milliliter blusbuffer en houd de culturen 10 minuten op ijs. Aspiraat vervolgens en vervang door dezelfde hoeveelheid blusbuffer voordat u de culturen nogmaals 10 minuten op ijs laat staan.
Gooi vervolgens de blusbuffer weg en was de cellen driemaal met vier milliliter gekoeld CM-PBS. Schrob vervolgens de cellen in één milliliter gekoeld CM-PBS en breng de suspensie over naar een microcentrifugebuisje. Pel de cellen vervolgens door centrifugatie bij 100 g gedurende drie minuten in een gekoelde microcentrifuge ingesteld op vier graden Celsius.
Vervolgens gooit u de supernatant weg en suspendeert u de cellen in 500 microliter lysisbuffer. Laat vervolgens de monsters 30 minuten op ijs staan, terwijl u elke vijf minuten voorzichtig schudt. Centrifugeer vervolgens het lysaat bij 14.000 g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius om alle detergent en oplosbare materialen te pellen.
Vervolgens brengt u het supernatant over naar een nieuw microcentrifugebuisje. Bewaar 50 microliter van het lysaat en voeg 25 microliter van drie keer laadbuffer toe. Denatureer het vervolgens door het te verwarmen tot 95 graden Celsius in een droog bad.
Dit is de inputfractie, die zowel biotinylerde celoppervlakte-eiwitten als niet-biotinyleerde cytosolische eiwitten bevat. Gebruik een afgesneden pipettip om 75 microliter streptavidin agarose korrels naar het lysaat over te brengen en incubeer het gedurende drie uur op vier graden Celsius op een shaker. Pel vervolgens de streptavidin agarose korrels door centrifugatie bij 1.500 g gedurende 30 seconden bij vier graden Celsius.
Bewaar 50 microliter van de supernatant en voeg 25 microliter van drie keer laadbuffer toe. Denatureer het vervolgens bij 95 graden Celsius in een waterbad of een verwarmingsblok. Dit vertegenwoordigt de intracellulaire fractie en bestaat voornamelijk uit niet-biotinyleerde cytosolische eiwitten.
Resuspendeer vervolgens de bepelletingskorrels in één milliliter wasbuffer en schud het gedurende drie minuten bij vier graden Celsius. Pel de korrels en gooi de supernatant weg. Herhaal dit proces nog vier keer om de niet-specifieke binding van niet-biotinyleerde cytosolische eiwitten te minimaliseren.
Voeg 50 microliter laadbuffer toe, verdund tot een keer met behulp van lysisbuffer. Ontbind biotin en streptavidin van de korrels door ze te denatureren bij 95 graden Celsius. Deze fractie zou alleen biotinylerde celoppervlakte-eiwitten moeten bevatten.
Vervolgens scheiden we de input, celoppervlakte en intracellulaire fracties door SDS-PAGE en analyseren door middel van western blotting. Het algemene doel van de pulse-chase biotinyleringstest is om de geschatte internalisatie van Aquaporin-4 in astrocyten te bepalen. Verwijder eerst de astrocytenculturen uit de incubator en zuig het medium op.
Was vervolgens de cellen driemaal met vier milliliter gekoeld CM-PBS en plaats de schalen op verpletterd ijs. Zuig de CM-PBS op en pipet vervolgens drie milliliter biotin buffer in elke schaal. Kanteel de schalen een paar keer voor en achter om ervoor te zorgen dat de buffer goed verdeeld is en laat ze 30 minuten op ijs staan.
Vervolgens zuigt u de biotin buffer weg en vervangt u deze door vijf milliliter warm medium. Incubeer één cultuurschaal bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten en een tweede schaal bij dezelfde temperatuur gedurende 30 minuten. Laat een andere schaal op vier graden Celsius staan als nulminuut monster.
Aan het einde van de incubatieperiode gooit u het medium weg en was de cellen driemaal met vier milliliter gekoeld CM-PBS. Aspiraat vervolgens de CM-PBS en pipet zes milliliter reducerende buffer over de cellen en laat het monster 15 minuten op ijs staan. Vervolgens vervangt u het medium door zes milliliter vers reducerende buffer en plaatst u het monster nogmaals 15 minuten op ijs.
Deze stap is cruciaal, omdat de glutathion in de reducerende buffer het biotin moaisi dat op het celoppervlak achterblijft, zal afsplitsen. Dit zorgt ervoor dat alleen geïnternaliseerde eiwitten worden gelabeld met biotin. Vervolgens verwijdert u de reducerende oplossing en vervangt u deze door zes milliliter blusbuffer.
Laat het monster nog eens 15 minuten op ijs staan en herhaal de blusstap nog een keer. Gooi vervolgens de blusbuffer weg en was de cellen driemaal, met vier milliliter gekoeld PBS. Zuig de CM-PBS op en schraap de cellen in één milliliter gekoeld PBS, met behulp van een cellift, en breng de suspensie over in een microcentrifugebuisje.
Pel de cellen door centrifugatie bij 100 g gedurende drie minuten. Na drie minuten gooit u de supernatant weg en suspendeert u de cellen in 500 microliter lysisbuffer. Laat het monster 30 minuten op ijs staan en schud elke vijf minuten.
Centrifugeer het lysaat bij 14.000 g, gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, om het detergent en oplosbare materialen te
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit rapport presenteert twee biotinylering-gebaseerde methoden voor het beoordelen van celoppervlakte-expressie en endocytische snelheden van eiwitten in het plasmamembraan. De technieken worden gedemonstreerd met behulp van astrocyten en richten zich op het eiwit Aquaporin-4.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Biochemie
Achtergrond
- Aquaporin-4 is een waterkanaaleiwit dat wordt geëxpresseerd in astrocyten.
- Astrocyten zijn de meest voorkomende gliacellen in de hersenen.
- Biotinyleringstechnieken maken de studie van transmembraaneiwitten mogelijk.
- Het begrijpen van eiwitexpressie en internalisatie is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
Doel van het onderzoek
- Om de effecten van laminine op Aquaporin-4-expressie te bepalen.
- Om methoden te bieden die van toepassing zijn op verschillende celtypen.
- Om het begrip van eiwitdynamica in het plasmamembraan te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Celoppervlakte biotinylering
- Pulse-chase biotinylering
- Gebruik van astrocyten voor demonstratie
- Beoordeling van eiwitexpressie en internalisatie
Belangrijkste resultaten
- Gedemonstreerde methoden kunnen op verschillende celtypen worden toegepast.
- Toonde de impact van laminine op Aquaporin-4 in het plasmamembraan.
- Bieden inzichten in de internalisatiesnelheden van transmembraaneiwitten.
- Valideerde technieken voor het bestuderen van eiwitdynamica in de neurowetenschappen.
Conclusies
- De biotinyleringsmethoden zijn effectief voor het bestuderen van eiwitexpressie.
- Deze technieken kunnen worden aangepast voor verschillende onderzoekstoepassingen.
- Het begrijpen van Aquaporin-4-dynamica kan neurologisch onderzoek informeren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of cell-surface protein expression and endocytic rates is critical for de-risking target validation and optimizing lead selection in neurobiology and membrane protein drug discovery. The biotinylation-based workflows described enable precise measurement of protein trafficking dynamics, supporting predictive confidence in early-stage portfolio decisions. These methods facilitate robust evaluation of membrane protein modulation, a key inflection point for therapeutic hypothesis testing and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of membrane protein localization and trafficking.
- Supports functional validation of transmembrane targets in primary cell systems.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing surface versus internalized protein pools.
- Provides data to inform target engagement and modulation strategies.
Screening & Assay Development
- Establishes validated protocols for reproducible measurement of cell-surface and internalized protein fractions.
- Delivers quantitative outputs suitable for downstream screening and comparative analysis.
- Supports assay standardization and scalability across diverse cell types and targets.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein trafficking dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro trafficking data with disease-relevant protein modulation in primary astrocytes.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of membrane protein targets.
- Supports risk-adjusted advancement by quantifying functional protein changes in response to modulators.
- Enables integration with orthogonal readouts such as immunofluorescence and TIRF microscopy for translational insight.
Pipeline & Workflow Integration
These biotinylation-based assays position within the early discovery to lead identification continuum, enabling robust target validation and assay development for membrane proteins in primary cell models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on protein localization and endocytic regulation in response to extracellular cues.
- Screening: Provides quantitative, reproducible readouts for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables statistical comparison of protein surface and internalization rates across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro trafficking data with disease-relevant astrocyte biology.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocols for diverse transmembrane targets and primary or engineered cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic understanding of protein trafficking.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable workflows for quantitative protein analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and reduces late-stage biological risk for membrane protein programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on trafficking and modulation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture and protein biochemistry.
- Needs access to western blotting and quantitative densitometry infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable to both adherent and suspension cell models with accessible extracellular domains.
- Dependent on the availability of high-quality antibodies and biotinylation reagents for target specificity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:51
Determining Relative Cell-surface Protein Expression in Astrocytes by Biotinylation
4:40
Determining Internalization Rate of Cell-surface Proteins in Astrocytes by Biotinylation
8:52
Results: AQP4 Expression at the Cell-surface in the Presence of Laminin and AQP4 Internalization in Astrocytes
10:15
Conclusion
