Een rekenkundige methode om te kwantificeren vliegen circadiane activiteit

Bij de meeste dieren coördineren circadiane klokken gedragsmatige en moleculaire processen en synchroniseren zij deze met de dagelijkse licht-donkercyclus. Bij fruitvliegen wordt de klok doorgaans bestudeerd met behulp van locomotorische registraties. Hier is een voorbeeld van de gemiddelde locomotoriek van het wildtype, gemeten in een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker; de licht-donkercyclus wordt bovenaan weergegeven met een geel-zwarte balk.

Een typische registratie van een vlieg vertoont een complex, bimodaal patroon met twee activiteitspieken: een ochtendpiek die rond dageraad optreedt en een avondpiek die rond schemering optreedt. Deze twee pieken vormen samen een golfvorm die sterk verschilt van de sinusvormige oscillaties die worden waargenomen in klokgenen, wat suggereert dat mechanismen, naast de biologische klok, een aanzienlijke invloed hebben op het produceren van het waargenomen patroon in gedragsgegevens. Hier presenteren wij de eerste methode die temporele patronen in de activiteit van vliegen wiskundig beschrijft.

We passen de activiteitsgegevens aan op een modelgolfvorm die de locomotie van de vlieg nabootst. Ons model bestaat uit vier exponentiële termen: twee termen voor de ochtendpiek en twee termen voor de avondpiek. Samen met de circadiane periode heeft ons model negen onafhankelijke parameters.

B-parameters definiëren de snelheid van de ochtendstijging, het ochtendverval, de avondstijging en het avondverval. TM en TE definiëren de breedtes van de ochtend- en avondpieken, en HM en HE definiëren de hoogtes van de pieken. Samen beschrijven deze parameters volledig de grootte en vorm van de ochtend- en avondpieken in het activiteitspatroon.

Onze methode kan worden toegepast om de mechanismen en substraten te verduidelijken die ten grondslag liggen aan het veelvoorkomende bimodale activiteitspatroon bij locomotorische metingen van vliegen. Bereid voor het locomotie-experiment individuele buisjes voor met voedsel aan het ene uiteinde en watten aan het andere. Plaats hiervoor eerst vijf tot zes gram vliegvoedsel in een bekerglas van 50 milliliter.

Snijd het voedsel in kleine stukjes, zodat het gemakkelijker in de magnetron kan worden gesmolten. Eén activiteitsmonitor biedt plaats aan 32 individuele buisjes. Neem daarom 32 buisjes en verbind deze met elkaar met een elastiekje.

Smelt het voedsel in het bekerglas in een magnetron. Verhit het voedsel gedurende ongeveer 10 tot 15 seconden. Stop de magnetron elke vijf seconden en schud het bekerglas met het voedsel een beetje om een gelijkmatige smelting van het voedsel te waarborgen.

Zorg ervoor dat al het voedsel is gesmolten en dat er geen vaste stukjes voedsel meer in het bekerglas achterblijven. Terwijl het voedsel nog vloeibaar is, plaatst u de buisjes in het bekerglas met voedsel. Beweeg de buisjes een klein beetje op en neer, zodat ze gelijkmatig gevuld zijn.

Laat het voedsel ongeveer een uur afkoelen en stollen. Nadat het voedsel gestold is, worden de buisjes met een draaiende beweging uit het bekerglas verwijderd, zodat het voedsel niet aan de bodem van het bekerglas blijft kleven. Verwijder vervolgens het elastiekje.

Verzegel het uiteinde van de buis met was. Neem hiervoor eerst een papieren handdoek en veeg de buis voorzichtig schoon. Druk de buis vervolgens tegen de was.

Controleer visueel de kwaliteit van de verzegeling en herhaal de verzegeling indien nodig. Verzegel met deze techniek alle buizen voor het experiment. Sluit het andere uiteinde van de buizen af met watten.

Het wattenpluis laat lucht door, terwijl de vliegen in de buisjes opgesloten blijven. Het is bovendien eenvoudig te verwijderen en terug te plaatsen, wat handig is wanneer we de buisjes met vliegen vullen voor het experiment. Nu de buisjes gereed zijn, kunnen ze worden gevuld met vliegen voor het experiment.

Hiervoor worden de vliegen met CO2 op het plaatje overgebracht. Plaats vervolgens met een penseel voorzichtig één enkele vlieg in elke individuele buis. Plaats de buis met de vlieg in de monitor.

In dezelfde volgorde als in de monitor zal de locomotie van de vliegen door het monitorsysteem worden geregistreerd in het uitvoerbestand. Sluit de monitor aan op de computer en plaats deze in een incubator die een constante temperatuur en luchtvochtigheid handhaaft. Stel op basis van het experiment de juiste licht/donker-condities in.

Houd voor het licht/donker-experiment de vliegen gedurende het hele experiment in een licht-donkercyclus. Gebruik de eerste dag van de metingen niet in de analyse. Houd voor het experiment met constante duisternis de vliegen eerst twee dagen in licht/donker-condities voor entrainment en synchronisatie van de klokken, en schakel daarna over naar constante duisternis.

Gebruik de metingen van de eerste dag van constante duisternis niet in de analyse. Voordat u naar de volgende sectie gaat, raden wij aan het protocol te lezen. Het monitorsysteem genereert één enkel bestand dat de activiteit van alle vliegen in de monitor bevat.

De laatste 32 kolommen van het uitvoerbestand bevatten de activiteit van individuele vliegen. Ons programma werkt met de activiteit van enkele vliegen. Splits daarom het uitvoerbestand op in meerdere bestanden met de activiteit van enkele vliegen.

Elk bestand moet een TXT-bestand met één kolom zijn. Nu we de activiteitsbestanden hebben voorbereid, kunnen we onze analyse uitvoeren. Voer de functie ModelFitPS3 uit in het MATLAB Command Window met de volgende inputparameters.

Bemonsteringssnelheid: voer het tijdsinterval van de gegevenssteekproef in seconden in. Onze gegevens werden bijvoorbeeld verzameld met een bemonsteringssnelheid van 20 seconden. Daarom voeren we hier 20 in.

Voer bij bin interval het tijdsinterval in minuten in waarin de gegevens worden gegroepeerd voor een betere visualisatie. Wij raden aan om te groeperen per 20 of 30 minuten, maar voor nu voer ik hier 10 in, om u later te laten zien hoe dit eenvoudig kan worden gewijzigd. Voer bij trend een één in als de getoonde gegevens een baseline trend vertonen en anders een nul.

Onze gegevens vertonen geen baselinetrend. Daarom heb ik hier nul ingevuld. Druk op Enter om de functie uit te voeren.

Select in het pop-upvenster één bestand met vliegactiviteit en klik op Openen. Het programma berekent en tekent het vermogenspectrum van de gegevens. Bepaal in dit venster de primaire periode in de gegevens.

Klik hiervoor met de linkermuisknop op de piek bij de circadiane periode of met de rechtermuisknop op de piek bij de tweede harmonische, die zich ongeveer bevindt op de circadiane periode gedeeld door twee. In ons geval is de piek bij de tweede harmonische veel groter en scherper dan de piek bij de circadiane periode. Daarom gebruiken we de tweede optie.

Vervolgens zal het programma de gegevens plotten, gegroepeerd volgens het geselecteerde bin-interval. Zoals u kunt zien, zijn de ochtend- en avondpieken bij een bin-interval van 10 minuten niet erg duidelijk gevisualiseerd. Daarom willen we deze waarde wijzigen.

Om dit te doen, klikt u eenvoudig met de rechtermuisknop ergens op de grafiek. Typ in het nieuwe dialoogvenster de nieuwe waarde voor het bin-interval. Wij raden aan om te groeperen in tijdintervallen van 20 minuten.

Daarom vullen we hier 20 in. Klik op OK. Het programma tekent de gegevens onmiddellijk opnieuw met de nieuwe waarde van het bin-interval. Om deze waarde te accepteren, klikt u eenvoudigweg met de linkermuisknop ergens op de grafiek.

Het programma zal nu de gegevens opnieuw tekenen en slechts vijf dagen aan metingen tonen. Selecteer in dit venster de eerste ochtendpiek die in de analyse zal worden gebruikt. Soms is het nodig om de eerste één of twee dagen over te slaan, die nodig zijn voor de vlieg om zich aan te passen aan de licht-donkercyclus.

Om de ochtendpiek te selecteren, klikt u eenvoudig op de gewenste piek. Het programma tekent de gegevens opnieuw en toont nu slechts drie dagen aan metingen, beginnend bij de geselecteerde ochtendpiek. De blauwe en rode verticale lijnen geven de eerste avondpiek en de tweede ochtendpiek aan, gebaseerd op de periode die in het eerste venster is geselecteerd.

Select in dit venster het punt van de buis die is gebruikt voor de voorlopige fit van de gegevens met de modelfunctie. Klik hiervoor op de volgende punten in deze specifieke volgorde. Klik eerst op de top van de eerste ochtendpiek.

De klik wordt aangegeven met de rode ster onderaan, die de locatie van de klik toont. Klik vervolgens op het einde van de ochtendpiek, daarna op het begin van de avondpiek, vervolgens op de top van de avondpiek, daarna op het einde van de avondpiek en tot slot op de top van de ochtendpiek van de volgende dag. Het programma zal het powerspectrum opnieuw plotten, aangezien de definitieve parameters worden verkregen uit de spectrale fit.

Het spectrum is nu uitgezet met de frequentie op de x-as, waarbij de circadiane piek zich aan de linkerkant van de grafiek bevindt. De in de eerste stap bepaalde periode wordt weergegeven door een rode verticale lijn. Om de fittingspunten te selecteren, moet eerst de primaire periode ruwweg worden bepaald.

Klik hiervoor met de linkermuisknop op de piek bij de circadiane periode, of met de rechtermuisknop op de piek bij de tweede harmonische. We maken opnieuw gebruik van de tweede optie. Daarna verschijnt er onderaan een schuifregelaar om de punten voor de spectrale fit te selecteren.

De punten worden weergegeven met rode cirkels en verschijnen na het bewegen van de schuifregelaar. Beweeg de schuifregelaar naar links en rechts, en plaats de punten zo dicht mogelijk bij de toppen van de spectrale pieken. Nadat het beste beeld is verkregen, drukt u op de knop Accept, waarna het programma de geselecteerde punten fit met de analytische expressie voor het model-powerspectrum.

Na het fitten zal het programma nog twee grafieken genereren. De eerste is een powerspectrum van het model dat is opgesteld met de geëxtraheerde parameters. De tweede is de data gefit met het model.

De gegevens worden weergegeven met een zwarte lijn en het model met een rode lijn. Er is te zien dat de functie sterk lijkt op de gegevens, met name tijdens de laatste drie dagen van de activiteit. De geëxtraheerde parameters zijn opgeslagen in het TXT-bestand met model-fitparameters.

Na de bestandsnaam worden de parameters in de volgende volgorde opgeslagen: eerst b van de ochtendafname, daarna b van de ochtendstijging, b van de avondstijging, b van de avondafname, de circadiane periode, vervolgens de breedte van de ochtendpiek gedeeld door de circadiane periode, de breedte van de avondpiek gedeeld door de circadiane periode, de hoogte van de ochtendpiek, de hoogte van de avondpiek en de fittingsfout van de spectrale fit. Naast het bestand met de modelfitparameters zal het programma ook nog twee andere bestanden genereren. Ten eerste de datafit met de modelfunctie en ten tweede een spectrale fit.

Voer deze analyse uit met andere activiteitsbestanden. Alle geëxtraheerde parameters worden opgeslagen in het TXT-bestand met modelfitparameters en kunnen verder worden gebruikt om gedragsoutput te koppelen aan de onderliggende mechanismen die het dagelijkse gedrag van de vlieg reguleren, gestuurd door het activiteitspatroon van het model.