Name: Nanopore DNA rangschikkend voor Metagenomic bodemanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Leer nanopore DNA-sequencing voor metagenomische bodemanalyse met minimale apparatuur. Deze methode genereert real-time data voor educatieve toepassingen en studenten leren bio-informatica tools gebruiken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project was steun ten dele door de Johns Hopkins University, Office van de Provost via de Gateway wetenschap initiatief.

Opmerking: Metagenomic DNA wordt gezuiverd van de bodem (Baltimore County, Maryland) met behulp van een commercieel beschikbare bodem genomic isolatie kit (Zie Tabel van materialen). Met behulp van een UV spectrofotometer (Zie Tabel of Materials), het gezuiverde genomic DNA moet een 260/280 (nm) verhouding &#62; 1.8 en een 260/230 verhouding tussen 2.0-2.2 te verzekeren dat het monster vrij is van contaminanten. Het bedrag van de genomic DNA dat vereist is voor NS varieert van 200 ng 2 µg.
1. Stroomversnelling Library voorbereiding methode (korte Protocol)
Opmerking: Dit is een korte protocol. Zie Tabel van materialen voor de snelle sequencing kit.
<ol>
	<li>In een 0,2 mL (Zie Tabel van materialen) dunwandige buis 200 toevoegen ng van ultrahoog moleculair gewicht DNA in een finale van volume van 7,5 ÂµL van gedistilleerd water.</li>
	<li>Voeg 2.5 µL van fragmentatie mix (FM) van de snelle bibliotheek voorbereiding kit en meng zachtjes door inversie. Pulse centrifuge te draaien naar beneden (1.000 x g voor 5 s).</li>
	<li>Leg het monster in een thermocycler (Zie Tabel of Materials) voor een ronde bij 30 ° C gedurende 1 min gevolgd door 75 ° C gedurende 1 min. verwijderen de centrifuge buis en pols te draaien naar beneden van het monster.</li>
	<li>Voeg 1 µL van snelle adapter en 0.2 µL van bot/TA ligase master mix, en vervolgens het opslaan van de bibliotheek aangepast en vastgebonden op ijs. Opmerking: Als u via het korte protocol verder met stap 8</li>
</ol>
2. afbinding Sequencing Protocol (lange Protocol): Metagenomic DNA fragmentatie
Opmerking: Zie Tabel van materialen voor de afbinding sequencing kit.
<ol>
	<li>Verdunnen 1 µg gezuiverde genomic DNA tot een eindvolume van 46 µL in gedeïoniseerd water.</li>
	<li>Overdracht aan de fragmentatie van een DNA Monster buis (Zie Tabel van materialen) en Centrifugeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur op 8.000 x g met behulp van een microcentrifuge (Zie Tabel of Materials) voor de productie van ~ 8 kb genomic fragmenten. Zorg ervoor dat alle van de vloeistof in de buis van de collectie is verstreken.</li>
	<li>Omkeren van de buis van de versnippering, teruggaan naar de centrifuge en centrifuge voor 1 min om te verzamelen van de gefragmenteerde genomic DNA in de tweede kamer.</li>
	<li>De gefragmenteerde genomic DNA overbrengen naar een steriel laag-DNA-bindende 1,5 mL-buis, en een gedeelte van een laag percentage agarose gel (0,6%) om te bevestigen van versnippering te analyseren &#62; 30 kb.</li>
</ol>
3. gefragmenteerd Genomic DNA einde-voorbereiding
<ol>
	<li>Met behulp van 800 ng van gefragmenteerde genomic DNA in 45 ÂµL van gedeïoniseerd water, voeg 7 µL einde-prep reactie (Zie Tabel van materialen), 3 µL enzym mix buffer (Zie Tabel of Materials), en 5 µL van nuclease gratis water.</li>
	<li>Meng door inversie en pulsstand centrifuge (1.000 x g voor 5 s).</li>
	<li>Monster overbrengen in een 0,2 mL dunwandige buis en monster gedurende 5 minuten bij 20 ° C, gevolgd door incubatie bij 65 ° C gedurende 5 minuten uit te broeden.</li>
	<li>Pulse centrifuge om inhoud aan de onderkant van de buis.</li>
	<li>Monster overbrengen in een tube van 1,5 mL laag-DNA-bindende microcentrifuge.</li>
	<li>Magnetische kralen (Zie tabel van materialen) voor te bereiden. 60 µL van de geresuspendeerde kralen aan de einde prep reactie toevoegen uit stap 3.5 en meng door pipetteren.</li>
	<li>Incubeer op een rotator mixer op 100 rpm (Zie Tabel van materialen) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Pulse Centrifugeer het monster naar de kralen pellet en leg het monster naast magneet.</li>
	<li>Zodra de magneet de kralen zijn nageleefd, Pipetteer af supernatant en negeren.</li>
	<li>De buis uit de kralen van de magneet en wassen met 200 µL van vers bereide 70% ethanol verwijderen door zachtjes pipetteren het monster en neergaande.</li>
	<li>Pulse centrifuge pellet de kralen en terugkeren naar de magneet.</li>
	<li>De bovendrijvende vloeistof verwijderen en weggooien. Herhaal de stap van de wassen opnieuw met behulp van 200 µL van 70% ethanol.</li>
	<li>Pulse centrifugeren van de buis, terug te keren naar de magneet en verwijder alle de 70% ethanol wassen.</li>
	<li>Met de microcentrifuge buis deksel open, toestaan de kralen in de lucht droog gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwijder de buis uit magneet en Suspendeer de pellet in 31 ÂµL van steriele, nuclease-gratis water. Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Terug de buis naar de magneet totdat alle kralen hebben Ingehuld en het eluaat duidelijk is.</li>
	<li>Het eluaat overbrengen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Met behulp van 1 µL van het monster, het kwantificeren van de einde-klaargestoomd DNA met behulp van een UV spectrofotometer op 260 nm (Zie Tabel van materialen). Opmerking: Het percentage herstel moet ~ 70% (700 ng) van een beginconcentratie van 1 µg genomic DNA.</li>
</ol>
4. adapter en Tether toevoeging aan einde-klaargestoomd Genomic DNA-fragmenten
<ol>
	<li>Meng alle de bot/TA ligase master mix buizen door inversie en vervolgens pulse centrifuge om inhoud aan de onderkant.</li>
	<li>Met behulp van 30 µL van eind-klaargestoomd DNA, Voeg 20 µL van adapter mix en 50 µL van bot/TA afbinding master mix.</li>
	<li>Meng door inversie, pulse centrifuge, en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
</ol>
5. magnetische Bead voorbereiding
<ol>
	<li>Vortex de kralen en vervolgens overdracht 50 µL van zwevende parels aan een 1,5 mL microfuge buis.</li>
	<li>Plaats de buis op de magneet aan de kralen pellet, totdat het eluaat geleegd.</li>
	<li>De bovendrijvende vloeistof verwijderen en weggooien.</li>
	<li>Voeg 100 µL van de kraal bindende buffer (Zie Tabel van materialen voor parelkit) pellet aan de kralen, vortex aan resuspendeer de parels, de kralen aan de magneet, verwijder het supernatant en negeren. Herhaal het wassen met 100 µL van bindende buffer.</li>
	<li>Voeg 100 µL van de kraal bindende buffer aan de gewassen kralen. Vortex aan resuspendeer de kralen.</li>
</ol>
6. bibliotheek zuivering
<ol>
	<li>Met behulp van een P200-micropipet, voeg 40 µL van parels uit de vorige stap tot het aangepast/aangebonden genomic DNA. Meng het monster zorgvuldig door pipetteren.</li>
	<li>Incubeer het monster op een rotator mixer bij 100 t/min gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Plaats van het monster aan de magneet en laat de kralen te regelen. Pipetteer af het supernatant en gooi deze weg.</li>
	<li>Resuspendeer de kralen in 140 µL van kraal bindende buffer door pipetteren. Leg het monster tegen de magneet, verwijder het supernatant en wassen opnieuw met een andere 140 µL van kraal bindende buffer.</li>
	<li>Pulse centrifugeren van de buis, de buis op de magneet voor 2 min. de resterende kraal bindende buffer verwijderen uit de pellet.</li>
</ol>
7. de elutie van bibliotheek van magneet kralen
<ol>
	<li>Resuspendeer de magnetische kralen in 15 µL van elutie buffer door pipetteren. Incubeer het monster gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Plaats de buis tegen de magneet aan de pellet van de kralen.</li></ol>Als de oplossing wist, verwijder 15 µL van het eluaat en transfer naar een 1,5 mL microfuge buis en leg het monster op het ijs.
	<li>Kwantificeren van de bibliotheek met behulp van een UV spectrofotometer. Opmerking: Het percentage herstel moet ~ 25% (250 ng) van een beginconcentratie van 1 µg genomic DNA.</li>

8. het starten van een Run/kwaliteitscontrole
<ol>
	<li>Verwijder de stroom cel uit verpakking en hechten van de stroom-cel met de draagbare, real-time sequencer (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>De sequencer aansluit op een computer via USB-kabel en start de sequencing software (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Klik op "Connect" apparaat via de sequencing software, selecteer "NC_Platform_QC.py" en klik op "Start".</li>
	<li>De kwaliteitscontrole (QC) duurt ongeveer 6-7 min te voltooien; zoekt u een 'zee van groen' (grote gebieden van uitvoer) op de QC-uitlezing te bevestigen zijn er genoeg actieve poriën (&#62; 800) voor het rangschikken van DNA.</li>
</ol>
9. Start een Sequencing Run
<ol>
	<li>Open het programma sequencing; Er verschijnt een dialoogvenster. In het vak Voorbeeld ID naam het monster.</li>
	<li>Klik op het vak "Flow Cell ID" en voer de code gevonden op de sticker op de bovenkant van de cel van de stroom.</li>
	<li>Open het deksel van de cel stroom en schuif de cover monster poort rechts (rechtsom) zodat de poort monster zichtbaar is. Zodra de poort open, controleren voor een kleine luchtbel is. Verwijder een paar microliters van buffer met inbegrip van de zeepbel.</li>
	<li>Controleren om er zeker van te zijn dat er buffer over de sensor-array. De priming buffer te maken door het mengen van 480 µL van het runnen van de buffer met brandstofmix (RBF-1, zie de Tabel van materialen) (zorg ervoor dat u meng grondig eerste) met 520 µL nuclease-gratis water.</li>
	<li>800 µL van de priming buffer aan de priming-poort toevoegen. Trek voorzichtig de cover "SpotOn" om deze toegankelijk te maken.</li>
	<li>Na 5 min, voeg toe een extra 200 µL van priming buffer aan de priming-poort.</li>
</ol>
10. veilig laden van de bibliotheek
<ol>
	<li>Voor de voorbereiding van de plaats van de bibliotheek de volgende reagentia op ijs: RBF-1 (vanaf de sequencing-kit), aangepast en aangebonden bibliotheek en bibliotheek laden kralen (LLB; uit de sequencing-kit).</li>
	<li>Een centrifugebuis 0,2 mL toevoegen 25,5 µL van RBF en 12 µL van nuclease-gratis water bewaard bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Meng de LLB door pipetteren en neergaande. 26.5 µL van de LLB aan de buis 0.2 µL toevoegen. Meng de reagentia door pipetteren en neergaande. Opmerking: De LLB heeft de neiging om uit het mengsel te regelen.</li>
	<li>11 µL van de bibliotheek aangepast en vastgebonden aan de buis 0.2 µL toevoegen. Meng door inversie en spin down door puls centrifugeren.</li>
	<li>Toevoegen van 75 µL van monster uit stap 9.4 aan de poort van de "SpotOn" ontkleuring. Zorg ervoor dat elke daling mondt uit in de poort voor het toevoegen van de volgende.</li>
	<li>Zorgvuldig de monster poort cover vervangen zodat de bung de poort treedt, en vervang het apparaat deksel.</li>
</ol>
11. starten een Sequencing Software Protocol Script
<ol>
	<li>Open de dropdown-menu onder 'Selecteer programma' en selecteer "48 uur sequencing."</li>
	<li>Klik op de knop "Uitvoeren" om te beginnen het script.</li>
	<li>Bekijk de resultaten van de Mux scan gemeld in de stroom van de kennisgeving voor het aantal actieve poriën in de MUX scannen. Opmerking: Dit nummer kan afwijken van het aantal poriën in de QC uitvoeren en een groot verschil kan wijzen op een probleem.<ol>
		<li>Als er een aanzienlijke vermindering van de actieve poriën van de QC-run, opnieuw opstarten van de software, en als er nog een significant verschil, herstart de computer.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Controleer of de temperatuur koelplaat 34 ° C, is zoals gerapporteerd door het script van sequencing software. Opmerking: Als de temperatuur niet bij 34 ° C dan zal niet er genoeg actieve poriën voor de run.</li>
	<li>Controleer het histogram van Lees lengtes om te bepalen of de lengte van de reeks verwacht en geschikt is voor de proefopzet.</li>
	<li>Sluit de desktop agent die met behulp van 'close x.' Quit de sequencing software door het sluiten van de web GUI. Koppel het apparaat los van de computer.</li>
</ol>
12. analyse van Run en resultaten
Opmerking: Tijdens de sequencing, de gegevens kan worden gecontroleerd met behulp van het "Rapport weergeven"-programma met behulp van de desktop agent. Tijdens of na de run voltooid is, de bestanden zijn beschikbaar in een bestandsindeling in het gegevens → leest → pass map (standaard) FAST5. Als deze map geopend is terwijl sequencing actief is, is de computer vastlopen.
<ol>
	<li>Kunnen bekijken en manipuleren van reeksen downloaden van een "HDFViewer".</li>
	<li>De volgorde om bestanden te bekijken, direct open HDF viewer → open Data map → Selecteer die alle bestand typen → Selecteer C: schijf (standaard) → gegevens selecteren → Selecteer leest → select pass.</li>
	<li>Zoek en selecteer het bestand FASTQ in het linker keuzemenu; bestanden wordt geopend en in FASTQ-indeling kunnen worden opgeslagen. Opmerking: Met het oog op de student experiment, sequenties van 350 nucleotiden of langer werden geselecteerd voor verdere analyse. Uitvoer van de base roeping kan de gebruiker om te sorteren op volgorde leest op basis van grootte. FASTQ bestanden kunnen worden geanalyseerd via BLAST (NCBI) of andere bioinformatics programma's.</li>
</ol>

<ol><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time%2C+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).</li>
<li>Greninger, A. L., et al. <a target="_blank" href="https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-015-0220-9">Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis.</a> Genome Med. 7, 99(2015).</li>
<li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+draft+sequencing+and+real-time+nanopore+sequencing+in+a+hospital+outbreak+of+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella.</a> Genome Biology. 16, 114(2015).</li>
<li>Ashton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinION+nanopore+sequencing+identifies+the+position+and+structure+of+a+bacterial+antibiotic+resistance+island%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island.</a> Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).</li>
<li>Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+bacterial+genome+assembled+de+novo.+using+only+nanopore+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Method%22%5BJournal%5D)">A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data.</a> Nat Method. 12, 733-735 (2015).</li>
<li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+Sequencing+as+a+Rapidly+Deployable+Outbreak+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool.</a> Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).</li>
<li>Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li>
<li>Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing+for+Microbial+Identification+and+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization.</a> J. Vis. Exp. (78), e50405(2013).</li>
<li>Rothberg, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v475/n7356/full/nature10242.html?foxtrotcallback=true">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li>
<li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zero-mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li>
<li>Eid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li>
<li>Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+discrimination+in+immobilized+DNA+oligonucleotides+with+a+biological+nanopore%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore.</a> PNAS. 106, 7702-7707 (2009).</li>
<li>Shendure, J., Hanlee, J. Next generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li>
<li>Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Metagenomics+of+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Metagenomics of Soil.</a> Nat Rev Microbiol. 3, 470-478 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen informatieverschaffing.

Vele volgende generatie sequencing methoden zijn gegenereerd en elk hangt af van het rangschikken door synthese, maar de detectie-platforms voor het identificeren van nucleotiden verschillen. NS, de meest recente toevoeging aan de markt, gebruikt een andere methode volledig, die hoeft niet de reactie van een sequentie of label nucleotiden. Deze methode maakt gebruik van de gratis differentieel van reeds opgenomen nucleotiden als ze een geëlektrificeerde porie passeren. De identificatie van elk nucleotide treedt op door de modulatie van de elektrische stroom door de verschillende basen als ze de nanopore passeren. Dit multiplexed systeem kan de gebruiker naar de volgnummer van vele fragmenten tegelijk. Door beide strengen van DNA sequencing, de nauwkeurigheid van de sequentie wordt aanzienlijk verhoogd en de sequencing software, die kan worden geladen op een laptopcomputer, verwerkt de signalen en biedt de sequentie-informatie die kan worden geanalyseerd.
In pyrosequencing, een rangschikken door synthese (SBS) methode en hangt opsporing van de specifieke base in de sjabloon opgenomen af van de luciferase assay en de generatie van chemiluminescentie signalen8. In ion halfgeleider sequencing, wordt het vrijgegeven waterstof ion, dat de pH vermindert gedetecteerd door een ion sensor9. Enkel molecuul real-time sequencing, hangt af van de nul modus Golf gids (ZMW)10, die verlicht voor de detectie van een TL molecuul aan de opgenomen nucleotide gelabeld. SBS een unieke methode gebruikt voor het versterken van doelDNA zodanig dat clusters van unieke reeksen gegenereerde13. Detectie van de toegevoegde nucleotide wordt bereikt wanneer de fluorescentie van de tagged nucleotide is opgenomen. NS heeft aan de andere kant uniek voordeel ten opzichte van andere methoden in dat het beperkte technische middelen vereist, draagbaar is, lang sequencing leest produceert, geen voorafgaande versterking van DNA vereist, en tegen een verminderde prijs, vergeleken met andere methoden kan worden bediend. Onze studenten de nieuwere, snelle bibliotheek prep protocol eenvoudig en vatbaar voor een drie uur durende lab klasse aangetroffen. Enkele van de kwesties die we tegenkwamen waren bubbels in de cel van de stroom die moeilijk waren te verwijderen, het vereist aanzienlijke computer macht (één terabyte aan opslagruimte), de huidige output van gegevens is in een FAST5-bestand en de sequencing stroom cel heeft een beperkte houdbaarheid voordat het verslechtert. Daarnaast andere nadelen van het NS afbinding sequencing protocol (lange) is dat het vereist verschillende bibliotheek voorbereiding stappen vereist expertise in moleculaire biologietechnieken en genereert verminderde sequencing trouw in vergelijking met sommige sequencing methodologieën3. Echter, recente vooruitgang met de nieuwe snelle library voorbereiding kit vereist slechts 10 min voor de voorbereiding van de bibliotheek en een verminderde sequencing foutenpercentage heeft aangetoond. De nieuwe bibliotheek-voorbereiding methode was zeer vatbaar voor gebruik in een lab-klasse.
Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol, met name in de QC van de stroom-cel. Dit omvat het uitvoeren van een eerste QC binnen vijf dagen na de ontvangst van de cel van de stroom en met behulp van hen binnen acht weken. Hoewel we hebben stroom cellen die buiten 8 weken werden gebruikt, is het aantal open/actieve poriën sterk verminderd. Het is belangrijk dat experimenten zijn gepland om te passen een tijdlijn waar maximaal gebruik van de cellen van de stroom is bereikt. Wij hebben de schoonmaak protocol gebruikt en hergebruikt de cellen van de stroom met succes.
Onderzoekt de metagenomics bodem vertegenwoordigen een onaangesproken genetische reservoir van microbiële diversiteit. Bijvoorbeeld, een gram van de bodem wordt geschat op tussen de 10 bevatten7 - 109 prokaryotische cellen14. Bovendien zijn de organismen in de bodem een hoofdbron van roman natuurproducten, enzymen en antibiotica. Bodem metagenomics DNA sequentieanalyse vormt aldus, een waardevol educatief hulpmiddel voor studenten op alle niveaus van het onderwijs. Van de technologie van de NS gebruiksgemak en lage kosten maken dit systeem een zeer effectieve leermiddel. Studenten kunnen volgnummer milieu monsters, en na voltooiing van de reeks gebruiken beschikbaar bioinformatica tools te identificeren en te karakteriseren van microben en metagenomics sequenties van analysemonsters. Met de technologie van de NS hebben studenten echte hands-on ervaring, die heeft tot nu toe uit bereiken voor gebruik in laboratorium cursussen vanwege de geavanceerde technische deskundigheid en hoge reagens, apparatuur en het onderhoud kosten in andere sequencing-platforms. Een van onze studenten (J. Harrison, persoonlijke mededeling) rapporteerde onlangs, het gebruik van deze technologie in een controle milieuproject van boerderij bodems. Wij verwachten dat er veel meer toepassingen voor deze technologie in het onderwijs ruimte zullen.

Het doel van deze procedure is om aan te tonen de stappen die nodig zijn voor de voorbereiding van een milieu bibliotheek van DNA sequencing, gebruik van een nanopore stroom cel sequencing apparaat, en voor het uitvoeren van de analyse van de gegenereerde DNA-sequenties met behulp van system-software en het National Center for biotechnologie informatie (NCBI) bioinformatica tools te identificeren van microbiële soorten in de bodem. Momenteel vereisen de meeste DNA sequencing platformen een grote investering in technische opleiding en complexe instrumentatie, die niet haalbaar in resource slechte omgevingen of in veld toepassingen is. De nanopore sequencing (NS) platform elimineert deze problemen met een kosten-effectieve, eenvoudig te gebruiken protocol van de voorbereiding van de bibliotheek en een draagbaar apparaat om de volgorde en analyseren van een verscheidenheid van verschillende types van nucleïnezuren1,3. We hebben de NS platform verwerkt in verschillende klassen van de lab voor studenten van de master's degree.
Nanopore technologie voor sequencing biomoleculen gebleken breed toepassingen in de biowetenschappen, met inbegrip van de identificatie van bacteriële en virale ziekteverwekkers1,2,6, milieu biodiversiteit studies, voedsel veiligheid controle, genomic analyse3,5, en karakterisering van bacteriële resistentie tegen antibiotica4. NS is een snelle en nauwkeurige methode om reeks nucleic zuren die is gebaseerd op het beginsel van "sequencing strand" door het detecteren van elektrische verstoring door individuele nucleotide basen wanneer één gestrande DNA een nanopore ingevoegd in een geëlektrificeerde passeert synthetische polymeren membraan. De stappen die betrokken zijn bij de voorbereiding van DNA voor NS omvatten genoom fragmentatie, einde reparatie en 3' dA-tailing van genomic fragmenten, adapter en ketting gloeien tot het DNA, DNA bibliotheek zuivering en het laden van de bibliotheek in het nanopore apparaat voor de cel van de stroom. Fragmentatie van het genoom in ~ 8 kb grootte wordt bereikt door centrifugeren van 1-2 µg genomic DNA door middel van een g-buis fragmentatie buis. De gefragmenteerde genomic uiteinden zijn vervolgens gerepareerd en tailed met poly dA met behulp van een commercieel beschikbare kit. Één gestrande adapter sequenties, die verenigbaar met de nanopore motor proteïne zijn, worden toegevoegd aan DNA-uiteinden die worden gebruikt voor het begeleiden van de opeenvolging van DNA door de nanopore (Figuur 1). De tether-sequenties zijn vereist voor de zuivering van het DNA en voor het lokaliseren van de DNA moleculen naar de porie-membraan. De haarspeld wordt gegenereerd door een haarspeld-adapter op één uiteinde van de staart bibliotheek van dA ligating. De haarspeld structuren aan de uiteinden van DNA kunnen lezen van de betekenis en antisense strengen als het DNA passeert de nanopore (Figuur 2). De bereid genomic bibliotheek wordt dan gezuiverd van de reactie met behulp van daar kralen met behulp van een magnetisch veld, gevolgd door het laden van het monster naar de nanopore stroom cel voor analyse.
De gesequenceerd DNA is beoordeeld op kwaliteit en sequencing leest die acceptabel voor analyse zijn zijn vervolgens onderworpen aan verschillende bioinformatica tools te identificeren van microben. De sequenties worden "vertaald" in een FASTQ van een FAST5 indeling. Het formaat van de FASTQ, kunnen de sequenties vervolgens worden gebruikt in BLAST analyse.

<table><tbody><tr><td>Thermal Cycler</td><td>LifeECO</td><td>BTC42096</td><td></td></tr><tr><td>Covaris g-TUBE</td><td>Covaris</td><td>520079</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext End Repair Module</td><td>New England BioLab</td><td>E7546</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505</td><td></td></tr><tr><td>NEB Blunt/TA Ligase Master Mix</td><td>New England BioLab</td><td>MO367</td><td></td></tr><tr><td>MyOne C1 Strepavidin Beads</td><td>Thermo Fisher</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Model 5420</td></tr><tr><td>Nanodrop UV spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-2000</td><td>Model 2000</td></tr><tr><td>Belly Dancer Orbital Shaker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z768499</td><td></td></tr><tr><td>Power Soil DNA Isolation Kit</td><td>MO BIO</td><td>12888-50</td><td></td></tr><tr><td>Ligation Sequencing Kit 2D</td><td>Oxford Nanopore&nbsp;</td><td>SQK-LSK208</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA</td><td>Oxford Nanopore&nbsp;</td><td>SQK-RAD002</td><td></td></tr><tr><td>End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix)</td><td>New England BioLab</td><td>MO367</td><td></td></tr><tr><td>AmPure XP Magnetic Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Basic Starter Pack&nbsp;</td><td>Oxford Nanopore&nbsp;</td><td></td><td>Includes MinION&nbsp; Sequencing Device and Flow Cell</td></tr><tr><td>MinKNOW software</td><td>Oxford Nanopore&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA</td><td>Oxford Nanopore&nbsp;</td><td>SQK-RAD002</td><td>Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB)</td></tr></tbody></table>

nanopore dna rangschikkend voor metagenomic bodemanalyse

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

Dit artikel beschrijft de stappen voor de bouw van een DNA-bibliotheek van de bodem, voorbereiding en het gebruik van de cel van de stroom nanopore, en analyse van de DNA-sequenties geïdentificeerd met behulp van computersoftware. Nanopore DNA sequencing is een flexibele techniek die voor snelle microbiële genoom sequencing te identificeren van bacteriële en virale soorten, zorgt te karakteriseren bacteriestammen, en om op te sporen van genetische mutaties die verlenen van resistentie tegen antibiotica. De voordelen van de nanopore rangschikking (NS) voor life sciences zijn haar lage complexiteit, lagere kosten en snelle real-time sequentiebepaling van gezuiverde genomic DNA, PCR waarbij, cDNA monsters of RNA. NS is een voorbeeld van "strand sequencing" waarbij DNA sequencing door het begeleiden van een enkele gestrande DNA-molecule door middel van een nanopore dat is ingevoegd in een synthetisch polymeer-membraan. Het membraan is een elektrische stroom overheen, dus als de individuele honken passeren van de nanopore de elektrostroom zijhetelkinverschillende mate wordt verstoord door de vier basen nucleotide toegepast. De identificatie van elk nucleotide treedt op door het detecteren van de karakteristieke modulatie van de elektrische stroom door de verschillende basen als ze de nanopore passeren. Het NS-systeem bestaat uit een handheld, USB aangedreven draagbaar apparaat en een wegwerp stroom cel een matrix van nanopore bevat. Het draagbare apparaat aangesloten op een standaard laptopcomputer die leest en registreert de opeenvolging van DNA met behulp van computersoftware.

Het experimentele ontwerp en nanopore technologie verstrekt een snelle en goedkope methode voor studenten om te bodem DNA-sequentie. De representatieve run doorgegeven de afstellingsparameters van kwaliteit met meer dan 800 poriën beschikbaar voor het rangschikken. De run resulteerde in meer dan 125.000 leest beschikbaar voor studie met een lengte van de mediane opeenvolging van 5.38 kb. Sequenties zijn gegeven een kwaliteitsscore en alleen deze sequenties met aanvaardbare scores werden vervolgens geanalyseerd. Als de uitvoer van de sequencing is reactie in FAST5-indeling, die wordt niet geaccepteerd door programma's zoals BLAST (NCBI), de sequenties werden bekeken in de HDF-viewer die de sequenties die zijn omgezet in FASTQ formaat, dat compatibel voor BLAST analyse is. In de toekomst iteraties van de software, zullen de gegevens beschikbaar als een FASTQ formaat, eliminerend de behoefte aan de HDF-viewer. Zie aanvullende cijfers 1, 2 en 3.
Vijftig sequenties van meer dan 350 nucleotiden in lengte waren onderworpen aan analyse per BLASTN (nucleotiden tegen nucleotide-database) of BLASTX (nucleotiden aminozuur reeks vertaald) (NCBI) te identificeren van de organismen in het bodemmonster. Gezien de tijd beperkingen van de klasse en dat de focus van de cursus op laboratoriummethoden en niet bioinformatics is, we hebben de studenten analyseren sequenties binnen deze parameters. Onze klassen bioinformatica kunnen gebruiken de gegevens voor ontwikkeling van pijpleiding analyse-instrumenten. Dit niveau van bioinformatica analyse wordt niet gedekt in het laboratorium gebaseerd klasse. Tabel 1 is een lijst van de organismen die werden aangeduid met e waarden van minder dan 4 e-04. In het algemeen, e-waarden kleiner dan 4 e-04 geven sterke gelijkenis tussen de input sequentie (query) en de gevonden reeks. De organismen aangeduid met BLASTN (tegen de niet-redundante (nr) database) zijn uit een grote verscheidenheid van soorten en zijn beschikbaar voor verdere genomic en eiwit analyses. In dit voorbeeld van de bodem, die afkomstig uit een tuin in Baltimore County, MD waren had nooit getest, dus geen vorige gegevens waaruit om te bepalen wat organismen in de bodem zou kunnen zijn. BLASTN-analyse (tegen de nr database)-analyse wordt tevens aangegeven er waren sequenties met geen overeenkomsten in de database van nr. Om te bepalen of deze echt roman sequenties, is verder onderzoek nodig. Analyse van verschillende reeksen van BLASTX bleek verschillende eiwitten uit organismen niet vertegenwoordigd in de analyse van de BLASTN. Tabel 2 de lijsten verschillende mogelijke eiwitten, met inbegrip van Endopeptidasen, en ATPasen-achtige eiwitten. Met behulp van deze bibliotheek van sequenties, hebben studenten de mogelijkheid geavanceerdere bioinformatica tools gebruiken voor het uitvoeren van verdere analyse, als geregisseerd door de instructeur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig1.jpg"> 
Figuur 1 : Genomic bibliotheek voorbereiding. Stappen voor de voorbereiding van genomic bibliotheek van DNA sequencing met behulp van nanopore technologie. Dit cijfer is gewijzigd met de vereiste machtigingen. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig2.jpg"> 
Figuur 2 . Schematische van DNA sequencing met behulp van een nanopore. DNA passeren een nanopore membraan met elektrisch signaal generatie en base identificatie. Dit cijfer is gewijzigd met de vereiste machtigingen. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organisme</td>
			<td>e waarde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomyces sp.</td>
			<td>3.00E-06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocardoides sp.</td>
			<td>5.00E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gordonia sp.</td>
			<td>5.00E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyphomicrobium nitrativorens</td>
			<td>1.00E-139</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starkeya novelle</td>
			<td>1.00E-31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyphomicrobium denitrificans</td>
			<td>1.00E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibomicrobium sp.</td>
			<td>5.00E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas sp.</td>
			<td>2.00E-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodothemus marinus</td>
			<td>1.00E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turneiella parva</td>
			<td>2.00E-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>0.00E + 00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradyrhizobium sp.</td>
			<td>3.00E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemmatirosa kalamazoonesis</td>
			<td>1.00E-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burkholderia sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomonas sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellumonas sp.</td>
			<td>6.00E-11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1: resultaten van BLASTN analyse geselecteerd. De bodem van metagenomics DNA-sequenties onderworpen aan BLASTN gelijkaardigheidsonderzoek tegen de NCBI niet-redundante nucleotide database. De ingediende gegevens hebben e-waarden van 4 x e-4 of minder.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Eiwit</td>
			<td>Organisme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypothetische eiwit</td>
			<td>Acidobacter bacterie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAM afhankelijk methyltransferase</td>
			<td>H. denitrificans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPase</td>
			<td>Jannaschia sp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endopeptidase</td>
			<td>Shigella sonnei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis van de eiwitten</td>
			<td>E. coli</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 2: geselecteerd van de resultaten van de analyse BLASTX. De bodem van metagenomics DNA-sequenties onderworpen aan BLASTX gelijkaardigheidsonderzoek tegen de NCBI niet-redundante eiwit database.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig1.jpg"> 
Aanvullende figuur 1: Platform QC resultaten. De resultaten van het platform QC worden gepresenteerd. Zijn de resultaten van de QC voor actieve poriën in de hogere juiste hoek. Elk kwadrant van de stroom-cel wordt getest voor actieve poriën. De belangrijkste pagina is dynamisch en verandert nadat elk kwadrant is getest. Op deze termijn werden 1.414 één poriën ontdekt.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig2.jpg"> 
Aanvullende figuur 2: FAST5 converteren van bestanden tot FASTQ bestanden. Hier is aan de rechterkant, de output van de gegevens uit de volgorde uitvoeren. Elke regel vertegenwoordigt een afzonderlijke reeks. De linkerkant van de figuur toont de gemarkeerde volgorde vanaf de rechterkant, in de HDF-viewer die de volgorde wordt omgezet in een FASTQ-bestand dat kan worden gebruikt voor verdere analyse. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig3.jpg"> 
Aanvullende figuur 3: voorbeeld van FASTQ volgorde in HDF viewer. Deze volgorde (Lees 803) is in een FASTQ-bestand dat de FAST5 gegevens naar nucleotiden converteert. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Nanopore technologie voor sequencing biomoleculen heeft brede toepassingen in de biowetenschappen, met inbegrip van de identificatie van ziekteverwekkers, voedsel veiligheid controle genomic analyse, metagenomic milieumonitoring en karakterisering van bacteriële resistentie tegen antibiotica. In dit artikel wordt de procedure voor het rangschikken van het DNA van de bodem van het metagenomic voor soorten identificatie met behulp van de technologie van het rangschikken nanopore aangetoond.

Nanopore DNA rangschikkend voor Metagenomic bodemanalyse

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

Het algemene doel van deze video is om te demonstreren hoe metagenomisch bodem-DNA te sequentiëren met behulp van een nanopore-sequentiemethode. Deze methode kan docenten helpen DNA-sequencing in een klasomgeving te introduceren en real-time genereren van nieuwe DNA-sequencinggegevens voor analyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het snel, betaalbaar is en minimaal laboratoriumapparatuur vereist.Deze techniek biedt studenten ook de mogelijkheid om meer geavanceerde bioinformatica-tools te gebruiken die meestal beschikbaar zijn in laboratoriumlessen. Dit korte protocol werkt met een snel sequentiekit. Om te beginnen voegt u 200 nanogram DNA met hoog moleculair gewicht toe aan een dunne wandbuis van 0,2 milliliter en vult u het volume aan met gedistilleerd water tot 7,5 microliter.Voeg vervolgens 2,5 microliter fragmentatiemix uit de kit toe en meng de buis voorzichtig door middel van inversies. Gebruik vervolgens een puls centrifugatie om de inhoud van de buis naar beneden te draaien. Breng nu de buis over naar een thermocycler voor een cyclus van een minuut bij 30 graden Celsius, gevolgd door een tweede cyclus van een minuut bij 75 graden Celsius.Pulseer de buis vervolgens opnieuw. Om de aangepaste en vastgebonden bibliotheek te voltooien, voegt u één microliter van een snelle adapter en 0,2 microliter van een blunt/TA ligase mastermix toe. Gebruik vervolgens inversie om de buis te mengen, gevolgd door een andere pulsspin en bewaar de buis op ijs.Stel eerst de sequencer in, verwijder de Flow Cell uit de verpakking en bevestig deze aan de draagbare real-time sequencer. Bevestig vervolgens de sequencer op een computer met behulp van de USB-kabel en start de sequencingsoftware. Selecteer in de software de opdracht voor het startapparaat en kies de optie voor QC-platform.Druk vervolgens op uitvoeren om de kwaliteitscontrole uit te voeren. Na ongeveer zeven minuten is de kwaliteitscontrolelopen voltooid. De groene markering op de uitlezing geeft aan dat er actieve poriën beschikbaar zijn voor DNA-sequencing.Er zijn minimaal 800 actieve poriën vereist. Ga nu naar het dialoogvenster. Voer in het veld Sample ID de naam in van het monster dat moet worden gesequenced.Voer voor de Flow Cell ID de code in die op het stickerlabel op de bovenkant van de Flow Cell staat. Open nu het sequencerluid en schuif vervolgens de priming poortdeksel naar links om toegang te krijgen tot de poort. Verwijder nu een paar microliters buffer, inclusief een kleine luchtbel die vaak aanwezig is.Maak nu genoeg buffer om de sensorarray te vullen. Bereid één milliliter vers gemaakte, grondig gemengde primingbuffer. Voeg vervolgens 800 microliter primingbuffer toe en wacht vijf minuten.Voeg na vijf minuten de resterende 200 microliter primingbuffer toe. Om de bibliotheek voor het laden voor te bereiden, koelt u RBF1 en LLB op ijs samen met de aangepaste en vastgebonden bibliotheek. Voeg vervolgens aan een nieuwe centrifugeerbuis van 0,2 milliliter 25,5 microliter RBF1 en 12 microliter kamertemperatuur kernvrij water toe.Meng vervolgens de LLB met pipettrituratie, neem vervolgens een aliquot van 26,5 microliter en voeg dit toe aan de buis met verdunde RBF1. Meng de reagentia met meer trituratie om te voorkomen dat de kralen zich binnenin nestelen. Voeg nu 11 microliter van de aangepaste en vastgebonden bibliotheek toe en meng de buis voorzichtig door middel van inversie.Gebruik vervolgens een pulsspin om het monster te poolen. Terwijl u de kralen vermijdt, neemt u 75 microliter van het monster en voegt u het druppelsgewijs toe aan de spot op de poort. Zorg ervoor dat elke druppel in de poort stroomt voordat u de volgende toevoegt.Bij het laden van het monster is het van vitaal belang dat elke druppel de poort binnenkomt voordat de volgende wordt toegevoegd. Het is ook belangrijk om te voorkomen dat de kralen opnieuw worden opgehangen bij het laden van de monsterpoort, wat de poort kan verstoppen. Vervang nu de deksel van de monsterpoort en zorg ervoor dat de bung in de poort komt.Vervang vervolgens het apparaatdeks en ga verder met het uitvoeren van de 48 uur durende sequencing run die is geselecteerd via de software. Met behulp van de beschreven procedure wordt een snelle en goedkope methode geboden voor het sequentiëren van bodem-DNA voor educatieve doeleinden. Runs leverden doorgaans meer dan 125.000 reads op, met een gemiddelde van meer dan 5.000 basenparen.Elke run kreeg een kwaliteitsscore om de meest bruikbare te selecteren voor verdere analyse. Vervolgens onderwierp elke student 50 sequenties van minstens 350 nucleotiden aan BLASTN of BLASTX-analyse om organismen uit het monster te identificeren. Geïdentificeerde organismen met e-waarden minder dan 0,0004 worden als sterke overeenkomsten beschouwd.Veel sequenties die aan BLASTN werden onderworpen, waren niet gematcht en hadden betrekking op nieuwe organismen. BLASTX onthulde verschillende eiwitten van organismen die niet waren vertegenwoordigd in de BLASTN-analyse. Van belang waren endopepeptidase en ATPase-achtige eiwitten die werden geïdentificeerd.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u bodem-DNA voor sequencing kunt voorbereiden en analyseren met behulp van nanopore-sequencingtechnologie. Dit protocol kan in twee en een half uur worden voltooid, vereist minimaal laboratoriumapparatuur of technische expertise en kan in een klasomgeving worden voltooid. Bij het uitvoeren en voltooien van deze procedure is het belangrijk om de reagentia voorzichtig te pipetten, monsters grondig te mengen en monsters te centrifugeren tussen stappen om verlies van monster te voorkomen.

nanopore-dna-sequencing-for-metagenomic-soil-analysis

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Een methodiek om hoog moleculair gewicht en de hoge kwaliteit van genomisch DNA te isoleren uit de bodem microbiële gemeenschap wordt beschreven.

Extractie met een hoog molecuulgewicht Genomic DNA uit bodems en sedimenten

Het karakteriseren van microbiële gemeenschappen is een al lang bestaand doel in de milieumicrobiologie. Methoden voor next-generation sequencing maken nu de karakterisering van microbiële gemeenschappen mogelijk op een ongekende diepte met minimale kosten en arbeid. We beschrijven hier onze aanpak om bacteriële 16S ribosomale RNA-genen te sequencen met behulp van een tafelsequencer.

Next-generation sequencing van het 16S ribosomaal RNA Gene Amplicons

Metagenomica werd gebruikt om het microbioom van silage rundveevoer te onderzoeken. Analyse werd uitgevoerd door shotgun sequencing. Deze aanpak werd gebruikt om de samenstelling van de microbiële gemeenschap binnen het rundveevoer te karakteriseren.

Metagenomic Analyse van kuilvoer

Een protocol wordt gepresenteerd voor gelijktijdig metabolieten, eiwitten en lipiden extraheren uit een één bodemmonster, waardoor deelmonster bereidingstijden en multi-dienst spectrometrische analyse van monsters met een beperkte hoeveelheden inschakelen.

Het MPLEx-Protocol voor Multi-dienst Analyses van bodemmonsters

Hier beschrijven we een protocol om amplicon reeks gegevens van bodem, rhizosfeer en wortel endosphere microbiomes te verkrijgen. Deze informatie kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de samenstelling en de diversiteit van de plant-geassocieerde microbiële gemeenschappen, en is geschikt voor het gebruik met een breed scala van plantensoorten.

Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere

Opgraving van plantenwortels uit het veld en verwerking van de monsters in endosphere, rhizosfeer en bodem worden in detail, met inbegrip van DNA-extractie en gegevens analysemethoden beschreven. Dit document is bedoeld om andere laboratoria maken gebruik van deze technieken voor de studie van de bodem, endosphere en microbiomes van de rhizosfeer.

Isolatie en analyse van microbiële gemeenschappen in bodem, rhizosfeer en wortels in de overblijvende gras experimenten

Lange-lezen sequenties vergemakkelijken aanzienlijk de assemblage van complexe genomen en karakterisering van structurele variatie. Beschrijven we een methode voor het genereren van ultra lange reeksen door sequentiebepaling nanopore gebaseerde platformen. De benadering neemt een geoptimaliseerde DNA-extractie, gevolgd door de gewijzigde bibliotheek preparaten voor het genereren van honderden kilobase leest met gematigde dekking van menselijke cellen.

Ultra lange lezen Sequencing voor hele Genomic DNA-analyse

Nanogaatje sequencing is een nieuwe technologie die het mogelijk maakt kosteneffectieve sequencing in afgelegen locaties en resource-arme instellingen. Hier, presenteren wij een protocol voor het rangschikken van mRNAs van geheel bloed dat met dergelijke voorwaarden compatibel is.

Het rangschikken van mRNA van geheel bloed gebruikend Nanogaatje het rangschikken

We valideerden eerder een protocol voor op amplicon gebaseerde whole genome Usutu virus (USUV) sequencing op een nanopore sequencing platform. Hier beschrijven we de methoden die in meer detail worden gebruikt en bepalen we het foutenpercentage van de nanopore R10-stroomcel.

Validering van Whole Genome Nanopore Sequencing, met behulp van Usutu Virus als voorbeeld

Het huidige artikel heeft tot doel gedetailleerde en adequate protocollen te bieden voor de isolatie van plant-geassocieerde endofytische schimmels, langdurige bewaring van isolaten, morfologische karakterisering en totale DNA-extractie voor daaropvolgende moleculaire identificatie en metagenomische analyses.

Isolatie, karakterisering en totale DNA-extractie om endofytische schimmels in mycoheterotrofe planten te identificeren

Deze studie presenteert een snelle ddPCR-methode om de microbiële biomassa van de bodem en de verhoudingen tussen schimmel en bacteriën te kwantificeren. Hoewel ddPCR-afgeleide microbiële biomassakoolstof slechts een zwakke correlatie vertoont met schattingen van chloroformfumigatie, biedt de methode een gevoelige, schaalbare moleculaire benadering om de microbiële abundantie te beoordelen zonder extra bodemmonsters of het gebruik van harde bodem.

Bepaling van microbiële biomassa in de bodem met behulp van Digital Droplet PCR (ddPCR)

Leer nanopore DNA-sequencing voor metagenomische bodemanalyse met minimale apparatuur. Deze methode genereert real-time data voor educatieve toepassingen en studenten leren bio-informatica tools gebruiken.

Nanopore DNA rangschikkend voor Metagenomic bodemanalyse

Meer video's verkennen