3D Microtissues voor injecteerbare regeneratieve therapie en High-throughput Drug Screening
October 4th, 2017
Dit protocol beschrijft de fabricage van elastische 3D macroporeuze microcryogels door de integratie van microfabrication met cryogelation-technologie. Bij het laden met cellen, worden 3D-microtissues gegenereerd, die kan gemakkelijk ingespoten in vivo om regeneratieve therapie of geassembleerd tot arrays voor in vitro high-throughput drug screening.
Het algemene doel van het fabriceren van elastische 3D macroporeuze microcryogels met behulp van cryogelatie is om injecteerbare regeneratieve therapie en in vitro high-throughput medicijnscreening te vergemakkelijken. Deze video presenteert de protocollen om veelzijdige 3D microweefsels te fabriceren en deze toe te passen op regeneratieve therapie en medicijnscreening. De regeneratieve therapietechniek verbetert het vasthouden, overleven en therapeutische functies van stamcellen na injectie op een wondlocatie.
Medicijnscreening wordt ook verbeterd door de gebruiksgemak en het potentieel voor high-throughput screening. Over het algemeen worstelen individuen die nieuw zijn in 3D-kweek met de ingewikkelde protocollen. Deze techniek vereenvoudigt 3D-kweek en biedt onderzoekers meer controle over de resulterende 3D-microweefsels.
Assisterend bij de demonstratie van deze procedures zullen Zhou Lyu, Liu Wei, Li Yaquian en You Zhifeng, vier afgestudeerde studenten uit ons laboratorium, zijn. Was de PMMA-microstencil-arraychips met gedeïoniseerd water om het puin te verwijderen dat overbleef na het lasergraveren. Droog vervolgens de microstencil-arraychips bij 60 graden Celsius.
Behandel vervolgens de gedroogde chips in een plasmareiniger in groepen van vier. Laat eerst de vacuümpomp twee minuten lopen. Gebruik vervolgens 18 watt RF-vermogen gedurende drie minuten om de hydrofiliteit van de chips te verhogen.
Maak nu één milliliter gelatine-precursoroplossing voor elke vijf chips. Los de gelatine op in een waterbad van 60 graden Celsius en incubeer de oplossing gedurende vijf minuten op ijs. Zodra het lichtjes is afgekoeld maar nog steeds vloeibaar, meng glutaaraldehyde grondig in de gelatine-precursoroplossing tot een uiteindelijke concentratie van 0,3% glutaaraldehyde.
Pipetteer nu 200 microliters van de bereide oplossing op het bovenoppervlak van elke chip. Verdeel de oplossing gelijkmatig over de chips met behulp van een gebogen glazen staaf. Breng vervolgens onmiddellijk de met oplossing geladen arraychips over in een min 20 graden Celsius vriezer gedurende 16 uur voor cryogelatie.
Koel de volgende dag een lyofilisaator af tot min 40 graden Celsius gedurende ongeveer 30 minuten. Laad vervolgens de arraychips en lyofiliseer ze gedurende twee uur onder vacuüm. Het ijs zal onder deze omstandigheden sublimeren en de chips zullen dan klaar zijn voor gebruik.
Begin met het oogsten van individuele microcryogels uit de chips. Begin met het overleggen van de vervaardigde microcryogel-arraychip bovenop de vervaardigde PDMS-uitwerpnaald-array. Lijn elke microcryogel uit met een uitwerpnaald.
Druk vervolgens de microcryogel-arraychip in de array om de microcryogels uit hun putjes te verplaatsen. Oogst nu de uitgeworpen microcryogels in een waterbad en verzamel ze met behulp van een celstrainer. Gebruik één sif om alle microcryogels van één chip te verzamelen.
Was vervolgens de microcryogels met natriumborohydride op ijs. Laat de niet-verknoopte aldehyderesten ongeveer 20 minuten uitlekken. Gooi vervolgens het natriumborohydride weg en was de microcryogels met vijf milliliter gedeïoniseerd water gedurende 15 minuten.
Voer in totaal drie tot vijf waterwasbeurten uit voordat u verdergaat. Na het verwijderen van de microcryogels uit de laatste waterwas, gebruikt u een pincet om ze over te brengen van de celsif naar een 35-millimeter petrischaal. Elke verzameling van microcryogels vormt één cluster.
Voeg nu 50 tot 70 microliters gedeïoniseerd water toe aan elk cluster van microcryogels en dek de schaal af. Tik vervolgens zachtjes op de schaal om eventuele gestapelde microcryogels te egaliseren. Vries vervolgens de microcryogels in bij min 20 graden Celsius gedurende vier tot 16 uur.
Lyofiliseer ze later gedurende twee uur zoals eerder. De volgende stap is om de 3D-microweefsels te maken. Steriliseer eerst de microcryogels.
Verzamel vervolgens de cellen met trypsine, bepaal hun dichtheid en suspendeer ze opnieuw in groeimedium op acht miljoen cellen per milliliter. Pipetteer vervolgens 60 microliters celsuspensie op elk cluster van microcryogels. Bewaar de schalen in een bevochtigde kamer en incubeer ze gedurende twee uur bij 37 graden Celsius zodat de cellen in de gels zullen absorberen.
Na de incubatie, voegt u twee milliliter kweekmedium toe aan elke schaal en zet u de kweek voort, waarbij u het medium om de andere dag ververst. Binnen twee dagen zullen 3D-microweefsels zijn gevormd. Om de 3D-microweefsels in een muis te injecteren, brengt u ze eerst over in een vijf-milliliter pipet en laadt u ze vervolgens in een celsif om het kweekmedium te filteren.
Suspensieer vervolgens de 3D-microweefsels in een 15% gelatine-oplossing. Na het voorbereiden van het dier voor de implantatie, injecteert u de microweefsels intramusculair in drie locaties van de gracilis-spier. Elke injectie moet 150 microcryogels bevatten in 150 microliters oplossing.
Gebruik een ene-milliliter spuit met een 23 gauge naald. Na het assembleren van de microcryogel-array voor on-chip celkweek, plaatst u ze voorzichtig in een voorverwarmde vochtigheidskamer zonder ze nat te maken. Verdeel vervolgens voorzichtig drie microliters volledig gemengde celsuspensie rechtstreeks op elk microcryogelputje.
Laat de pipettenpunt lichtjes de oppervlakte van de microcryogel aanraken voordat u de oplossing uitstoot. Zaai niet de perifere putjes. Voeg na het laden van de putjes 10 microliters selectief medium toe aan elk putje en voeg medium toe aan de perifere putjes om verdamping te vertragen met behulp van een 96-kanaals vloeistofdiser.
Kweek vervolgens de chips in de vochtigheidskamer gedurende 24 uur om 3D-microweefsels te vormen. De volgende dag, met behulp van de 96-kanaals vloeistofdiser, voegt u 10 microliters medicijn toe aan elk putje in een concentratiegradiënt vier keer om de to
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft de fabricage van elastische 3D macroporeuze microcryogels met behulp van cryogelatietechnologie. Deze microcryogels kunnen worden geladen met cellen om 3D microweefsels te creëren voor regeneratieve therapie en high-throughput geneesmiddelenscreening.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Regeneratieve Geneeskunde
- Geneesmiddelenscreening
Achtergrond
- 3D-kweektechnieken zijn vaak complex en uitdagend voor onderzoekers.
- Microcryogels bieden een veelzijdig platform voor weefselengineering.
- Verbeterde stamcelretentie en overleving zijn cruciaal voor effectieve regeneratieve therapieën.
- High-throughput geneesmiddelenscreening kan profiteren van vereenvoudigde 3D-kweekmethoden.
Doel van het onderzoek
- Om het proces van 3D-kweek voor onderzoekers te vereenvoudigen.
- Om de therapeutische functies van stamcellen in regeneratieve therapie te verbeteren.
- Om high-throughput geneesmiddelenscreening te vergemakkelijken met behulp van 3D microweefsels.
Gebruikte methoden
- Integratie van microfabricage met cryogelatietechnologie.
- Laden van cellen in 3D microcryogels.
- Injectie van microweefsels in vivo voor regeneratieve toepassingen.
- Assemblage van microweefsels in arrays voor geneesmiddelenscreening.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle fabricage van elastische 3D macroporeuze microcryogels.
- Verbeterde stamcelretentie en overleving na injectie.
- Verbeterde gebruiksgemak voor geneesmiddelenscreening toepassingen.
- Grotere controle over de kenmerken van 3D microweefsels.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol vereenvoudigt 3D-kweektechnieken.
- Microcryogels kunnen de resultaten van regeneratieve therapie aanzienlijk verbeteren.
- Deze methode belooft vooruitgang in high-throughput geneesmiddelenscreening.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol addresses the discovery-stage challenge of translating 3D cell culture into scalable, reproducible workflows for regenerative therapy and drug screening. By enabling injectable 3D microtissues with enhanced cell survival and compatibility with standard 384-well formats, it supports predictive confidence in target validation and lead identification. The method bridges early discovery and preclinical continuity through mechanistically relevant, disease-relevant systems that reduce biological risk in portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation through 3D microtissues that clarify pathway functionality in regenerative contexts.
- Operational Value: Supports biological de-risking by improving stem cell retention and survival post-injection, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Predictive Value: Enhances lead identification confidence via controlled 3D microtissue formation that models tissue-level responses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by forming size- and shape-controllable 3D microtissue arrays.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through on-chip assembly in 384-multi-well format compatible with common laboratory equipment.
- Screening Readiness: Enables reliable compound evaluation by facilitating high-throughput drug screening with quantitative metabolic readouts like resazurin reduction.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Demonstrates translational continuity from discovery through preclinical validation using the mouse limb ischemia model to assess therapeutic outcomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports predictive de-risking by showing improved limb salvage with microtissue treatment, informing go/no-go decisions.
- Biomarker Alignment: Connects to preclinical continuity through quantifiable physiological endpoints like toe amputation rates in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification to Preclinical work, supporting hypothesis testing, assay readiness, and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling 3D microtissue formation that models complex tissue interactions.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible 3D microtissue array formation in 384-well format for scalable compound screening.
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as resazurin-based metabolism assays that allow teams to compare drug conditions across wells.
- Translational Research: Connects method to preclinical continuity via demonstrated therapeutic efficacy in mouse limb ischemia model, supporting biomarker-aligned advancement.
- Enterprise Reuse: frames the method as a reusable capability for both regenerative therapy and drug screening workflows across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity through 3D microtissue models.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via cryogel-based microtissue arrays in multi-well formats.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through improved preclinical predictivity.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on enhanced stem cell survival and therapeutic outcomes.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in microfabrication, cryogelation, and 3D cell culture techniques.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including plasma cleaners, lyophilizers, cell strainers, and plate readers for resazurin assays.
- Cross-team standardization requirements for hydrogel preparation, cell seeding density, and injection protocols across biology and engineering teams.
- Adaptation considerations across model systems, including varying cell types and drug compounds as demonstrated with hepatocellular carcinoma and NSCLC cells.
- Practical limitations supported by source material: hazardous reagents (glutaraldehyde, sodium borohydride) require proper protective garments and laboratory hood use.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:18
Fabrication of 3D Microcryogels
3:11
Injectable 3D Microtissues for Treatment of Critical Limb Ischemia
7:09
Assembly of Microtissue Array Chip for High-throughput Drug Screening
9:05
Results: Microcryogels Used as a Therapeutic and for High-throughput Drug-screening
10:31
Conclusion
