Name: Chondrogenische Pelletvorming van Koord Bloed afgeleide geïnduceerde Pluripotente Stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Leer chondrogene pelletvorming van navelstrengbloed-afgeleide iPSCs voor kraakbeenreparatie. Dit protocol genereert grote hoeveelheden pellets voor ziekte-modellering en geneesmiddelonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van het Koreaanse Gezondheidszorg Technology R &amp; D project, ministerie van Volksgezondheid, Welzijn &amp; Gezin, Republiek Korea (HI16C2177).

Dit protocol is goedgekeurd door het institutionele review board van de Katholieke Universiteit van Korea (KC12TISI0861). CBMC&#39;s die worden gebruikt voor herprogrammering, werden direct verkregen uit de Cord Blood Bank van het Seoel St. Mary&#39;s Hospital. 1. Chondrogeen Differentiatie van iPSCs <ol><li> CBMC-iPSC generatie <ol><li> Genereer CBMC-hiPSCs met behulp van het protocol dat is weergegeven in ons vorige werk 23 . </li><li> Verzamel de bloedcellen in een 15 ml conische buis en tel ze met een hemocytometer. </li><li> Bereid 3 x 10 5 cellen en centrifugeer ze gedurende 5 minuten bij 515 xg en RT. Verwijder de supernatant door zuigkracht en resuspendeer de cellen in 0,5 ml bloedcelmedium. </li><li> Breng de cellen naar een putje van een niet-gecoate 24-putjesplaat en voeg het Sendai-virusmengsel toe volgens de aanbevelingen van de fabrikant. </li><li> Centrifugeer de plaat gedurende 30 minuten bij 1.150 xg en 30 ° C. </li><li> achteruitCentrifugeren, incubeer de cellen gedurende een nacht (O / N) bij 37 ° C in 5% CO2. </li><li> De volgende dag, overdragen de getransduceerde cellen naar een matrix beklede put. Centrifugeer de plaat bij 1,150 xg gedurende 30 minuten bij 30 ° C. </li><li> Na centrifugeren, verwijder de supernatant, voeg 1 ml iPSC medium toe en houd de cellen O / N bij 37 ° C in 5% CO 2 . </li><li> Houd de bijgeleverde cellen bij 37 ° C en 5% CO2 vast. Verander het medium dagelijks, vervang het met vers iPSC-medium. OPMERKING: Kolonies verschijnen op dag 14-21 na transductie. </li></ol></li><li> EB generatie <ol><li> Houd de hiPSCs bij 37 ° C en 5% CO 2 . Verander het medium dagelijks, vervang het met verse Essential 8 (E8) medium. </li><li> Bereid 2 x 10 6 hiPSC&#39;s in een vitronectine gecoate, 100 mm schaal in E8 medium. </li><li> Verwijder het E8-medium uit de kweekschotel en wassen met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Voeg 1 toeMl 1 mM ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 gedurende 2 minuten. </li><li> Oog de cellen met 3 ml E8-medium en breng ze over naar een nieuwe 15-ml conische buis. Centrifugeer de cellen bij 250 xg bij kamertemperatuur (RT) gedurende 2 minuten. </li><li> Aspirateer de supernatant zonder de celpellet te storen en de cellen opnieuw te suspenderen in 5 ml E8-medium. </li><li> Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en berei 2 x 10 6 cellen voor elke 100 mm Petri schotel. Resuspendeer de bereide cellen in een 10 ml mengsel van E8 en EB medium (1: 1) met 10 μM rho geassocieerde kinase (ROCK) inhibitor. </li><li> Incubeer de cellen O / N voor aggregatie bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Op de volgende dag, geoogst de geaggregeerde EB&#39;s door pipettering. Centrifugeer de cellen bij 250 xg gedurende 1 minuut. Verwijder de supernatant en resuspendeer de EB&#39;s in 10 ml vers E8 medium. </li><li> Vergroot de gegenereerde EB&#39;s gedurende 5 dagen, met dagelijkse veranderingen met fresH E8 medium. Voor verdere rijping, verander het kweekmedium naar E7 medium. Houd de EB&#39;s bij 37 ° C en 5% CO 2 gedurende nog eens 5 dagen, en voer dagelijkse medium veranderingen uit met vers E7 medium. OPMERKING: E7 medium is E8 medium zonder FGF2. </li></ol></li><li> Uitgroei celinductie van EB&#39;s <ol><li> Voeg 6 ml 1% gelatine toe aan een 100 mm schaal en incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 gedurende 30 minuten. </li><li> Verwijder de gelatine en droog de schotel volledig gedurende 2-3 uur voor gebruik. </li><li> Breng de EB&#39;s over naar een 50 ml conische buis. Laat de EB&#39;s losmaken op de bodem van de conische buis. Verwijder de supernatant zonder de EB&#39;s te storen. </li><li> Resuspendeer de EB&#39;s in 10 ml medium van Dulbecco&#39;s Modified Eagle (DMEM) met 20% foetaal runder serum (FBS). Breng de EB&#39;s naar de gelatine gecoate, 100 mm schotel. Voeg 10 μM ROCK remmer toe. </li><li> Incubeer en onderhou de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 7 dagen. Thema veranderenDium elke andere dag zonder toevoeging van ROCK-remmer. </li></ol></li><li> Chondrogeen pelletvorming <ol><li> Aspiratie van het kweekmedium uit de schotel en wassen de cellen drie keer met PBS. </li><li> Breng 1 ml 1 mM EDTA aan en incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 gedurende 2 minuten. </li><li> Oog de cellen met 5 ml DMEM met 20% FBS en verplaats ze naar een nieuwe 15-ml conische buis. </li><li> Centrifugeer de cellen gedurende 2 minuten bij 250 xg en RT. Gooi de supernatant weg en verwijder de pellet in 10 ml DMEM met 20% FBS. </li><li> Filter en wis de celklompen met behulp van een 40 μm celfilter en oog de enkele cellen op. Tel de enkele cellen met behulp van een hemocytometer. </li><li> Centrifugeer de cellen gedurende 2 minuten bij 250 xg en RT. Verwijder de supernatant en zaad 3 x 10 5 cellen per pellet in een 15 ml conische buis met 300 μl chondrogeen differentiatie medium (CDM). </li><li> Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij pelletvorming680 xg en RT. OPMERKING: De pellets worden gehandhaafd in 15 ml conische buizen tijdens de differentiatie van de chondrogeenpellets. </li><li> Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Verander de CDM om de 2-3 dagen. Binnen 3 dagen zullen pellets versteekte, bolvormige morfologieën vertoonden. Houd de pellets gedurende 21 dagen bij 37 ° C en 5% CO 2 . </li></ol></li></ol> 2. Chondrogeen Pellet Karakterisering Door Staining <ol><li> Chondrogeen embedding <ol><li> Voor het inbedden, bereiden en smelten paraffine bij 58 ° C. </li><li> Bevestig de pellets in 1 ml 4% paraformaldehyde gedurende 2 uur bij RT in een 1,5 ml buis. Voorzichtigheid: paraformaldehyde is zeer giftig. Vermijd contact met de ogen, de huid of de slijmvliezen. Vermijd blootstelling en vermijd inademing tijdens het bereiden. </li><li> Plaats een laag gaas op de cassette en zet de vaste pellets over met een pipet. Bedek de pellet door te vouwenE gaas en sluit de cassette deksel. </li><li> Begin dehydrering in 100 ml 70% ethanol (EtOH) tweemaal, 10 minuten elk. De pellets uitdrogen door opeenvolgende 10 minuten wassen in 80% en 95% EtOH. </li><li> Breng de pellets over 10 minuten naar 100% EtOH. Herhaal driemaal met verse EtOH. </li><li> Voor &quot;clearing&quot;, wissel de oplossing voor een 100 ml, 1: 1 mengsel van EtOH en xyleen, gevolgd door een 1: 2 mengsel van EtOH en xyleen gedurende 10 minuten elk. Verwijder de resterende EtOH door de pellets tweemaal in 100% xyleen, 10 minuten elk, te incuberen. </li><li> Voor paraffine-infiltratie, incubateer de pellets in opeenvolgende xyleen- en paraffine mengsels. Voer het volledige paraffine-infiltratieproces bij 58 ° C uit. Incubeer de pellets in 100 ml van een 2: 1 mengsel van xyleen en paraffine gedurende 30 minuten. </li><li> Vervang de oplossing voor 100 ml van een 1: 1 mengsel van xyleen en paraffine en incubeer gedurende 30 minuten. </li><li> Vervang de oplossing voor 100 ml van een 1: 2 mengsel van xyleen en paraffine en incubeer voor 30 min. </li><li> Voor de laatste infiltratie, breng de pellets over naar het eerste bad van 100% paraffine en incubeer gedurende 2 uur. </li><li> Breng de pellets over naar het tweede bad van 100% paraffine en incubeer O / N bij 58 ° C. </li><li> Vervolg de volgende dag de pellets voorzichtig door middel van een pincet. Voeg paraffine toe aan de mal uit de paraffine dispenser. Stabiliseer de paraffine gedurende 30 min bij 4 ° C. </li><li> Snijd de secties op 7 μm en plaats de secties op de glijbaan. Laat de glijbanen overnacht drogen en sla de glijbanen op RT totdat ze klaar zijn voor gebruik. </li></ol></li><li> Slide voorbereiding <ol><li> Deparaffinize de glijbanen door ze gedurende 5 minuten per 100 ml 100%, 90%, 80% en 70% EtOH achtereenvolgens te bewegen. </li><li> Plaats de glijbanen in een glazen pot en spoel met kraanwater gedurende 5 minuten. </li></ol></li><li> Alcian blauw kleuring <ol><li> Incubeer de dia&#39;s in 50 ml 1% alcianblauwe oplossing gedurende 30 minuten. NIETE: Alcian blauw wordt verdund in 3% azijnzuuroplossing. Pas de pH op 2,5 met azijnzuur aan. </li><li> Plaats de glijbanen in een glazen pot en spoel met kraanwater gedurende 2 minuten. </li><li> Spoel de glijbanen in gedeïoniseerd water (DW) en tegenstain met nucleaire snel rode oplossing gedurende 2 minuten. </li><li> Plaats de glijbanen in een glazen pot en spoel met kraanwater gedurende 1 minuut. </li><li> 2.3.5) Ga verder met dehydratie en bevestig de glijbanen in stap 2.6. </li></ol></li><li> Toluidine blue staining <ol><li> Incubeer glijbanen in 50 ml toluidine blauwe oplossing gedurende 4 minuten. </li><li> Plaats de glijbanen in een glazen pot en spoel met kraanwater gedurende 5 minuten. </li><li> Ga verder met dehydratie en monteer de dia&#39;s in stap 2.6. </li></ol></li><li> Immunohistochemische kleuring <ol><li> Incubeer de dia&#39;s in 3% H202 gedurende 15 minuten voor endogene peroxidase-blokkering. </li><li> Breng 200 μL primair antilichaam (anti-COL1A1 en -COL2A1) op 1: 100 verdund in tris-buGefrituurde zoutoplossing (TBS) die 1% boviene serumalbumine (BSA) en 5% normaal geiten serum (NGS) op de glijbanen bevat en incubatie O / N bij 4 ° C. </li><li> De volgende dag plaatst u de glijbanen in een glazen pot en wast u deze met 50 ml TBS, die 0,1% polysorbaat 20 (TBST) drie keer per 5 minuten bevatten. </li><li> Breng 200 μl secundair antilichaam (geit anti-konijn IgG-antilichaam, verdund 1: 200 in TBS bevattende 1% BSA en 5% NGS) aan de glijbanen toe en incubeer bij 40 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Plaats de glijbanen in een glazen pot en was ze drie keer met 50 ml, 5 min elk. </li><li> Voor signaalversterking, gebruik HRP-conjugaat streptavidine oplossing op de glijbanen en incubeer gedurende 10 minuten. </li><li> Plaats de glijbanen in een glazen pot en was ze drie keer met 50 ml, 5 min elk. </li><li> Meng de DAB-peroxidase substraatoplossing, breng 200 μL oplossing aan elke dia, en incubeer gedurende 1 minuut. </li><li> Plaats de glijbanen in een glazen pot en spoel met kraanwater gedurende 5 minuten. </li><li> tegenkleuringMet Mayer&#39;s hematoxyline gedurende 1 minuut. </li><li> Was de glijbanen met DW. </li><li> Ga verder met dehydratie en monteer de dia&#39;s in stap 2.6. </li></ol></li><li> Uitdroging en montage <ol><li> Ontduik de glijbanen door ze achtereenvolgens te bewegen door 100 ml 70%, 80%, 90% en 100% EtOH, 30 s elk. </li><li> Dip de dia&#39;s in twee veranderingen van xyleen gedurende 1 min elk. </li><li> Voeg 50 μL montageoplossing toe aan de deklagen en plaats de glijbanen bovenop. </li></ol></li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol heeft succesvolle hiPSC&#39;s van CBMC&#39;s gegenereerd. We herprogrammeerde CBMC&#39;s aan hiPSCs met behulp van een Sendai virale vector die Yamanaka-factoren 24 bevat . Drie gevallen werden gebruikt in differentiatie, en alle experimenten hebben succesvol chondrogeenpellets op basis van dit protocol gegenereerd. Talrijke studies hebben protocols voor de differentiatie van hiPSCs gemeld in chondrocyten 25 , 26 ,...

Het gebruik van hiPSC&#39;s vertegenwoordigt een nieuwe strategie voor drugscreening en mechanistische studies van diverse ziekten. Uit een regeneratief perspectief zijn hiPSCs ook een potentiële bron voor de vervanging van beschadigde weefsels die beperkte geneeskracht hebben, zoals articulair kraakbeen 1 , 2 . De regeneratie van inheemse gewrichtskraakbeen is al enkele decennia een uitdaging geweest. Articulair kraakbeen is een zacht, wit weefsel dat het einde van de botten bekleedt, beschermt tegen wrijving. Het heeft echter beperkte regeneratieve capaciteit bij beschadiging, waardoor zelfherstel bijna onmogelijk is. Daarom is onderzoek gericht op kraakbeenregeneratie al enkele decennia doorlopend. Vroeger werd in vitro differentiatie in de chondrogeen lijn meestal uitgevoerd met BMSC&#39;s of natieve chondrocyten die uit het kniegewricht 3 werden geïsoleerd. Wegens tO hun chondrogeenpotentieel, BMSC&#39;s en natieve chondrocyten hebben talrijke verdiensten die hun gebruik bij chondrogenese ondersteunen. Door hun beperkte expansie en instabiele fenotype worden deze cellen echter geconfronteerd met verschillende beperkingen bij de reconstructie van articulaire kraakbeenafwijkingen. Onder de in vitro- kweekomstandigheden hebben deze cellen de neiging om hun eigen karakteristieken na 3-4 passages te verliezen, wat uiteindelijk hun differentieringsvermogen beïnvloedt 4 . Ook bij nierlijke chondrocyten is extra schade aan het kniegewricht onvermijdelijk bij het verkrijgen van deze cellen. In tegenstelling tot BMSC&#39;s of natieve chondrocyten kunnen hiPSCs onbepaald in vitro uitbreiden. Met de juiste cultuuromstandigheden hebben hiPSCs een groot potentieel als vervangende bron voor chondrogeen differentiatie. Het is echter uitdagend om de intrinsieke eigenschappen van hiPSCs 5 te wijzigen . Bovendien duurt het een aantal ingewikkelde in vitro stePs om het lot van hiPSCs naar een specifiek celtype te leiden. Ondanks deze complicaties, wordt het gebruik van hiPSCs nog steeds aanbevolen door hun hoge zelfvernieuwingsvermogen en hun capaciteit om te onderscheiden in gerichte cellen, waaronder chondrocyten 6 . Chondrogene differentiatie wordt gewoonlijk gedaan met driedimensionale cultuursystemen, zoals de pelletkweek- of micromassa-cultuur, met behulp van MSC-achtige stamcellen. Als u hiPSC&#39;s gebruikt, verschilt het protocol voor het genereren van MSC-achtige stamcellen van de bestaande protocollen. Sommige groepen gebruiken een monolaagse cultuur van hiPSCs om het fenotype direct in MSC-achtige cellen 7 om te zetten . Echter, de meeste studies gebruiken EB&#39;s om opgroei cellen te genereren die lijken op MSCs 8 , 9 , 10 , 11 . Verschillende soorten groeifactoren worden gebruikt om chondroge te veroorzakenNesis. Gewoonlijk worden BMP- en TGFβ-familieproteïnen, alleen of in combinatie gebruikt. Differentiatie is ook geïnduceerd met andere factoren, zoals GDF5, FGF2 en IGF1 12 , 13 , 14 , 15 . TGFβ1 is aangetoond dat chondrogenese op een dosisafhankelijke manier in MSCs 16 wordt gestimuleerd. In vergelijking met het andere isotype, TGFβ3 induceert TGFβ1 chondrogenese door de pre-kraakbeen mesenchymale cel condensatie te verhogen. TGFβ3 induceert chondrogenese door de mesenchymale cel proliferatie 17 aanzienlijk te verhogen. TGFβ3 wordt echter vaker gebruikt door onderzoekers dan TGFβ1 7 , 10 , 18 , 19 . BMP2 versterkt de expressie van genen gerelateerd aan de chondrogeen matrixcomponenten in het menselijkArticulaire chondrocyten onder in vitro condities 20 . BMP2 verhoogt de expressie van genen die kritiek zijn op kraakbeenvorming in MSC&#39;s in combinatie met TGFβ-eiwitten 21 . Het is ook aangetoond dat BMP2 het effect van TGFβ3 synergistisch verbetert via de Smad- en MAPK-pathways 22 . In deze studie werden CBMC-hiPSC&#39;s geaggregeerd in EB&#39;s met behulp van EB-medium in een Petri-schotel met lage gehechtheid. Uitgroei cellen werden geïnduceerd door de EB&#39;s aan een gelatine gecoate schotel te bevestigen. Chondrogene differentiatie met behulp van uitgroeicellen werd uitgevoerd door pelletkweek. Behandeling met zowel BMP2 als TGFβ3 heeft de cellen succesvol gecondenseerd en geïnduceerde extracellulaire matrix (ECM) eiwit accumulatie voor chondrogeen pelletvorming. Deze studie suggereert een simpele, maar efficiënte chondrogene differentiatieprotocol met behulp van CBMC-hiPSCs.

<table><tbody><tr><td>Kunststofwaren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm Dish</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>6-well Plate</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Cornical Tube</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Cornical Tube</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Disposable Pipette</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Disposable Pipette</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>12-well Plate</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Beschrijving</td></tr><tr><td>E8 Medium Materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>E8 Medium (500 mL)</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Life Technologies</td><td>25080-094</td><td>E8 Medium (Conc.: 543 &mu;g/mL)</td></tr><tr><td>Sodium Selenite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td>E8 Medium&nbsp; (Conc.: 14 ng/mL)</td></tr><tr><td>Human Transfferin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3705</td><td>E8 Medium (Conc.: 10.7 &mu;g/mL)</td></tr><tr><td>Basic FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>E8 Medium&nbsp; (Conc.: 100 ng/mL)</td></tr><tr><td>Human Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>E8 Medium (Conc.: 20 &mu;g/mL)</td></tr><tr><td>Human TGF&beta;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)</td></tr><tr><td>Ascorbic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>E8 Medium&nbsp; (Conc.: 64 &mu;g/mL)</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Beschrijving</td></tr><tr><td>Controlemateriaal van de kwaliteit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm Dekglas</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech &amp; Innovation</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SSEA4 Antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4 Antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 Antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sox2 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-81 Antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4 Antibody</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody</td><td>Molecular Probe</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody</td><td>Molecular Probe</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probe</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong gold antifade reagent</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech &amp; Innovation</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen II antibody</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab34712</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Alcian blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3157-10G</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7252-25G</td><td></td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>090m0039v</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear fast red</td><td>Americanmastertech</td><td>STNFR100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>xylene</td><td>Duksan</td><td>115&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Mayer's hematoxyline-oplossing</td><td>wako pure chemical industries</td><td>LAK7534</td><td></td></tr><tr><td>DAP</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>Glasplaat, Gecoat</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalcohol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Beschrijving</td></tr><tr><td>Chondrogenic Differentiatiematerialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td>Chondrogeen media component (500 mL)</td></tr><tr><td>Penicilin Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td>Chondrogeen media component (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>Ascorbic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>Chondrogeen media component (Conc.: 64 &mu;g/mL)&nbsp;</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Chondrogeen media component (Conc.: 100 mM)</td></tr><tr><td>rhBMP-2</td><td>R&amp;D</td><td>355-BM-050</td><td>Chondrogeen media component (Conc.:100 ng/ml)</td></tr><tr><td>Recombinant Hman TGF-beta3</td><td>R&amp;D</td><td>243-B3-002</td><td>Chondrogeen media component (Conc.:10 ng/ml)</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Chondrogeen media component (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>ITS+ Premix</td><td>BD</td><td>354352</td><td>Chondrogeen media component (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>Dexamethasone-Water Soluble&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2915-100MG</td><td>Chondrogeen

chondrogenische pelletvorming van koord bloed afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellen

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Menselijke kraakbeen ontbreekt aan het vermogen zich te herstellen. De degeneratie van kraakbeen wordt dus niet behandeld door curatieve maar door conservatieve behandelingen. Momenteel worden inspanningen gedaan om beschadigd kraakbeen te regenereer met ex vivo geëxpandeerde chondrocyten of beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen (BMSC&#39;s). De beperkte levensvatbaarheid en instabiliteit van deze cellen beperken echter hun toepassing bij kraakbeenherstructurering. Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) hebben wetenschappelijke aandacht ontvangen als een nieuw alternatief voor regeneratieve toepassingen. Met onbeperkte zelfvernieuwingsvermogen en multipotency, zijn hiPSCs gemarkeerd als een nieuwe vervangende celbron voor kraakbeenherstel. Het verkrijgen van een hoge hoeveelheid chondrogeenpellets van hoge kwaliteit is echter een belangrijke uitdaging voor hun klinische toepassing. In deze studie hebben we embryoïde lichaams- (EB) -uitgevoerde uitgroeicellen gebruikt voor chondrogeen differentiatie. Succesvolle chondrogenese werd bevestigd door PCR anD vlekken met alcia blauw, toluidine blauw en antilichamen tegen respectievelijk collageen typen I en II (respectievelijk COL1A1 en COL2A1). Wij bieden een gedetailleerde methode voor de differentiatie van bloedmononucleaire cel afgeleide iPSCs (CBMC-hiPSCs) in chondrogeenpellets.

In deze studie hebben we chondrogeenpellets van CBMC-hiPSCs gegenereerd door uitgroei cellen van EB&#39;s te induceren. Chondrogene differentiatie werd geïnduceerd door middel van CBMC-hiPSC&#39;s met bevestigde hoge pluripotentie 11 . Een eenvoudige regeling van ons protocol is weergegeven in figuur 1A . Vóór differentiatie werden iPSC kolonies uitgebreid ( Figuur 1B ). De uitgebreide iPSCs werden sameng...

Hier stellen wij een protocol voor chondrogenische differentiatie voor van bloedbloedmononucleaire cellen afgeleide door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Chondrogenische Pelletvorming van Koord Bloed afgeleide geïnduceerde Pluripotente Stamcellen

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van chondrogene pellets uit geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleid van navelstrengbloed. Met dit protocol kunnen we een relatief grote hoeveelheid chondrogene pellets genereren. De gegenereerde chondrogene pellets kunnen worden gebruikt voor studies of ziektemodellering, drugscreening en translationeel onderzoek om ons begrip van de aard van kraakbeen verder te vergroten.Menselijk kraakbeen herstelt traag. Daarom moet kraakbeendegeneratie via een conservatieve behandeling worden aangepakt. Vanwege hun onbeperkte zelfvernieuwingsvermogen en multipotentie zijn menselijke iPSCs aangemerkt als een nieuwe bron voor vervangingscellen bij kraakbeenherstel.De procedure zal worden gedemonstreerd door Eugene Nam en Arie Alice Ream, promovendi uit mijn laboratorium. Om te beginnen met het protocol, verzamel bloedcellen in een conische buis van 15 milliliter en tel deze met een hemocytometer. Bereid 3 × 10⁵ cellen voor en centrifugeer deze gedurende vijf minuten bij 515 ×g bij kamertemperatuur.Verwijder het supernatant door middel van aspiratie en resuspendeer de cellen in 0,5 milliliters bloedcelmedium. Breng de cellen vervolgens over naar een putje van een niet-gecoate 24-wellplaat en voeg het Sendai-virusmengsel toe volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Centrifugeer de plaat gedurende 30 minuten bij 1.150 ×g en 30 °C.Incubeer de cellen na centrifugatie een nacht. Breng de volgende dag de transudaatcellen over naar een gecodeerde matrixwell. Centrifugeer de plaat.Verwijder na centrifugatie het supernatant, voeg één milliliter iPSC-medium toe en onderhoud de cellen. Versoon het medium dagelijks en vervang het door vers iPSC-medium. Onderhoud de menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen, of HIPSCs.Vervang het medium dagelijks door vers essential eight, of E8-medium. Bereid twee keer 10⁶ HIPSCs voor in vitronectine-gecoat 100 milliliter E8-medium. Verwijder vervolgens het E8-medium uit de kweekschaal en was de cellen met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing, of PBS.Voeg 1 mL van 1 mM EDTA toe en incubeer de schaal gedurende twee minuten. Oogst vervolgens de cellen met 3 mL E8-medium en breng deze over naar een nieuwe conische buis van 15 mL. Centrifugeer de cellen bij 250 ×g bij kamertemperatuur gedurende twee minuten.Zuig het supernatant af zonder de cellaag te verstoren en resuspendeer de cellen in vijf milliliters E8-medium. Na het tellen van de cellen met een hemocytometer, worden er 2 × 10⁶ cellen klaargemaakt voor elke 100 millimeter Petri-schaal. Resuspendeer de klaargemaakte cellen in een 10 milliliter één-op-één mengsel van E8- en EB-medium, met 10 micromolar ROCK-inhibitor.Incubeer de cellen een nacht om aggregatie te bewerkstelligen. Oogst de geaggregeerde EB's de volgende dag met een pipet. Verwijder het supernatant en resuspendeer de EB's in 10 milliliters vers E8-medium.Laat de gegenereerde EB's vijf dagen uitgroeien, waarbij dagelijks wordt gewisseld met vers E8-medium. Voor verdere rijping wordt het cultuurmedium vervangen door E7-medium. Houd de EB's nog eens vijf dagen lang bij 37 degrees celsius en 5%carbon dioxide, waarbij dagelijks het medium wordt vervangen door vers E7-medium.Voeg zes milliliter 1% gelatine toe aan een schaal van 100 millimeter en incubeer de schaal gedurende 30 minuten. Verwijder de gelatine en droog deze schaal volledig gedurende twee tot drie uur voor gebruik. Breng de EB's over naar een conische buis van 50 milliliter.Laat de EB's naar de bodem van de conische buis zakken. Verwijder het supernatant zonder de EB's te verstoren. Resuspendeer de EB's vervolgens in 10 milliliters voorverwarmd shilbecco's modified equals medium, of DMEM, met 20% fetal bulbing serum, of FBS.Breng de EB's over naar de met gelatine gecoate schaal van 100 millimeter. Voeg 10 micromolar rock-inhibitor toe. Incubeer en onderhoud de cellen gedurende zeven dagen.Vervang om de dag het medium zonder toevoeging van een rokinhibitor. Zuig het kweekmedium uit de schaal. Voeg onmiddellijk één milliliter één millimolair EDTA toe aan de schaal en incubeer de cellen gedurende twee minuten.Oogst vervolgens de cellen met vijf milliliter DMEM met 20% FBS en breng deze over naar een nieuwe conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer de cellen gedurende twee minuten bij 250 ×g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 milliliter DMEM met 20% FBS.Filter en verwijder de celklonters met een celzeef van 40 micrometer en oogst de enkelvoudige cellen. Tel de enkelvoudige cellen met een hemocytometer. Centrifugeer de cellen.Verwijder het supernatant en zaai drie keer 10⁵ cellen per pellet in een conische buis van 15 milliliter met 300 µL chondrogene differentiatie medium, of CDM. Centrifugeer de cellen voor de vorming van pellets en incubeer de cellen vervolgens gedurende de nacht. Binnen drie dagen zullen de pellets afgeplatte sferoïdale morfologieën vertonen.Bewaar de pellets gedurende 21 dagen. Bereid vóór het inbedden paraffine voor en smelt deze bij 58 °C. Fixeer de pellets in één milliliter 4% paraformaldehyde gedurende twee uur bij kamertemperatuur in een 1,5 milliliter buisje.Plaats één laag gaas op de cassette en breng de gefixeerde pellets over met een pipet. Bedek de pellet door het gaas dubbel te vouwen en het deksel van de cassette te sluiten. Start de dehydratie in 100 milliliters van 70%ethanol.Dehydrateer de pellets door middel van opeenvolgende wasbeurten in 80% en 95% ethanol. Breng de pellets over naar 100% ethanol voor 10 minuten. Voor het klaren wordt de oplossing gedurende 10 minuten vervangen door een mengsel van 100 milliliter ethanol en xyleen in een verhouding van één op één.Vervang vervolgens de één-op-één oplossing gedurende 10 minuten door een mengsel van ethanol en xyleen in een verhouding van één-op-twee. Verwijder het resterende ethanol door de pellets te incuberen in 100% xyleen. Voor de paraffine-infiltratie worden de pellets geïncubeerd in opeenvolgende mengsels van xyleen en paraffine.Voer het volledige paraffine-infiltratieproces uit bij 58 °C. Incubeer de pellets gedurende 30 minuten in 100 milliliters van een mengsel van xyleen en paraffine in een verhouding van twee op één. Vervang vervolgens de oplossing door 100 milliliters van een mengsel van xyleen en paraffine in een verhouding van één op één en incubeer gedurende 30 minuten.Vervang vervolgens de oplossing door 100 milliliters van een mengsel van xyleen en paraffine in een verhouding van één op twee en incubeer gedurende 30 minuten. Voor de uiteindelijke infiltratie worden de pellets overgebracht naar het eerste bad van 100%paraffine en wordt de pellet twee uur geïncubeerd. Breng de pellets over naar het tweede bad van 100%paraffine en incubeer deze overnight bij 58 degrees celsius.Gebruik de volgende dag een pincet om de pellets voorzichtig over te brengen naar een mal. Voeg paraffine uit de paraffine-dispenser toe aan de mal. Laat de paraffine 30 minuten stollen bij vier graden celsius.Snijd de coupes met een dikte van 7 µm en breng de coupes over op het objectglas. Laat de objectglazen een nacht drogen en bewaar ze bij kamertemperatuur tot ze klaar zijn voor gebruik. Voorafgaand aan de differentiatie werden de iPSC-kolonies uitgebreid.De uitgebreide iPSCs werden samengevoegd als EB's om de differentiatie te initiëren. De gegenereerde EB's werden gehecht aan met gelatine gecoate schalen om uitgroeicellen te induceren. Na 21 dagen differentiatie werden kleine, kraalachtige chondrogene pellets verkregen, die werden gebruikt voor verdere karakterisering.De kwaliteit van de chondrogene pellets werd op dag 21 histologisch geëvalueerd, waarbij chondrogene BMSC-pellets als positieve controle werden gebruikt. De accumulatie van ECM-proteïnen, uitgescheiden door de gedifferentieerde chondrocyten, werd bevestigd met Alcian blue en Toluidine blue kleuring. Chondrogene pellets gegenereerd uit CDMC HIPSCs vertoonden een hogere expressie van COL2A1 dan pellets afgeleid van CBMSC HIPCs.De expressie van collageen type 1, een marker voor fibrotisch kraakbeen, was lager in pellets afgeleid van CBMC HIPSC in vergelijking met de expressie van COL2A1. De genexpressie van extracellulaire matrixproteïnen van het kraakbeen in chondrogene pellets op dag 21 werd bevestigd via real-time PCR. De aggrecan-expressie van pellets afgeleid van CBMC HIPSC was vergelijkbaar met die van pellets afgeleid van BMSC.We hebben een gedetailleerde methode beschreven voor de differentiatie van uit cord blood mononucleaire cellen afgeleide iPSCs tot chondrogene pellets. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in twee maanden worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video heeft u een goed begrip van hoe u chondrogene pellets uit iPSCs kunt genereren.

chondrogenic-pellet-formation-from-cord-blood-derived-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Mechanische stress kan de chondrogene differentiatie van stamcellen induceren, wat een potentiële therapeutische aanpak biedt voor de reparatie van beschadigd kraakbeen. We presenteren een protocol om de chondrogene differentiatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen (ASC's) te induceren met behulp van centrifugale zwaartekracht (CG). De door CG geïnduceerde opregulatie van SOX9 resulteert in de ontwikkeling van chondrogene fenotypes.

Chondrogene differentiatie Inductie van vetcellen afgeleide stamcellen door Centrifugaal Zwaartekracht

Chondrogenese uit stamcellen vereist fine tuning van de kweekomstandigheden. Hier presenteren we een magnetische aanpak voor het condenseren van cellen, een essentiële stap om chondrogenese te initiëren. Bovendien tonen wij aan dat dynamische rijping in een bioreactor zijn mechanische stimulatie van de cellulaire constructen en verbetert kraakbeenachtige extracellulaire matrix productie.

3D Magnetic Stem Cell Samenvoeging en Bioreactor rijping voor het herstel van kraakbeen

Hier presenteren we een protocol voor de ontleding van menselijke navelstreng (UC) en foetale placenta monster in koord bekleding (CL), Wharton's gelei (WJ), cord-placenta junctie (CPJ) en foetale placenta (FP) voor het isoleren en karakterisering van mesenchymale stromale cellen (MSC's) met de explantaatkweek techniek.

Isolatie en karakterisering van mesenchymale stromale cellen uit menselijke navelstreng en foetale Placenta

Wij presenteren een protocol voor het genereren van een chondrogeen afkomst van menselijk perifere bloed (PB) via geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) met behulp van een integratievrije methode, waaronder embryoïde lichaamsvorming (EB), uitbreiding van fibroblastische cellen en chondrogeeninductie.

Differentiatie van chondrocyten van perifere bloed afgeleide humane geïnduceerde pluripotente stamcellen

Wij stellen voor een protocol dat laat zien hoe geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige keratinocyten en fibroblasten differentiëren en genereren een 3D huid organoid, met behulp van deze keratinocyten en fibroblasten. Dit protocol bevat een extra stap van het genereren van een gehumaniseerd muizen model. De techniek die hier gepresenteerd zal dermatologische onderzoek verbeteren.

Generatie van 3D huid Organoid van koord bloed afkomstige geïnduceerde pluripotente stamcellen

Bottherapie via endochondrale ossificatie door het implanteren van kunstmatig kraakbeenweefsel geproduceerd uit mesenchymale stamcellen heeft het potentieel om de nadelen van conventionele therapieën te omzeilen. Hyaluronzuurhydrogels zijn effectief bij het opschalen van uniform gedifferentieerde kraakbeentransplantaten en bij het creëren van geïntegreerd bot met vascularisatie tussen gefuseerde transplantaten in vivo.

Geïntegreerde botvorming door in vivo endochondrale ossificatie met behulp van mesenchymale stamcellen

Dit protocol beschrijft en vergelijkt twee representatieve methoden voor het differentiëren van hiPSC's in mesenchymale stromale cellen (MSC's). De monolaagmethode wordt gekenmerkt door lagere kosten, eenvoudigere bediening en gemakkelijkere osteogene differentiatie. De embryoïde lichamen (EB's) methode wordt gekenmerkt door een lager tijdsverbruik.

Vergelijking van twee representatieve methoden voor differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen in mesenchymale stromale cellen

Dit protocol beschrijft de isolatie van chondrocyten, van de fibronectine-adhesietest afgeleide chondroprogenitoren (FAA-CP's) en migrerende chondroprogenitoren (MCP's) uit menselijk gewrichtskraakbeen. Het omvat enzymatische spijsvertering, fibronectine-adhesie en op migratie gebaseerde assays voor het isoleren en karakteriseren van deze cellen.

Isolatie van chondrocyten en chondroprogenitoren met behulp van fibronectine-adhesie en migratoire assay

Deze studie beschrijft een methode voor het produceren van chondrocytische sferoïden door cellen samen te voegen tot sferoïden onder omstandigheden met een lage adhesie met behulp van zwaartekracht, gevolgd door het kweken van de resulterende sferoïden in mini-bioreactoren.

Het genereren van sferoïden uit verschillende chondrocyten met behulp van weinig klevende omstandigheden onder zwaartekracht en zelfgemaakte mini-bioreactoren

Dendritische stekels van piramidale neuronen zijn de sites van de meest prikkelende synapsen in de hersenen van zoogdieren cortex. Deze methode beschrijft een 3D-kwantitatieve analyse van de wervelkolom morfologie in menselijke corticale piramidale glutamaat neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Driedimensionale Kwantificering van Dendritische stekels van Piramidale Neuronen afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen

Leer chondrogene pelletvorming van navelstrengbloed-afgeleide iPSCs voor kraakbeenreparatie. Dit protocol genereert grote hoeveelheden pellets voor ziekte-modellering en geneesmiddelonderzoek.

Chondrogenische Pelletvorming van Koord Bloed afgeleide geïnduceerde Pluripotente Stamcellen

Meer video's verkennen