Name: Live-cel beeldvorming van schimmel cellen om modi van binnenkomst en Subcellular Localisatie van antischimmel Plant defensinen te onderzoeken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Leer live-cel beeldvorming om de internalisatie en subcellulaire lokalisatie van antischimmel plant defensinen in Fusarium graminearum te bestuderen. Deze methode onthult hoe deze peptiden zich gedragen in levende schimmelcellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Dr. R. Howard Berg, directeur van de geïntegreerde microscopie faciliteit in de Donald Danforth Plant Science Center, voor zijn leiding en helpen met confocale microscopie. De auteurs hebben geen conflict van belang te verklaren.

1. etikettering van defensinen met Fluorophores
<ol>
	<li>Selecteer een fluorophore die minimale gevolgen voor de antimicrobiële eigenschappen, evenals de opname en de lokalisatie heeft van de defensin binnen de levende cel. Opmerking: Selectie van de optimale fluorophore afhankelijk van experimentele specifiekedoelstellingen. De spectrale en chemische eigenschappen, de fotostabiliteit, de grootte en de kosten van de fluorophore moeten ook worden overwogen.</li>
	<li>Label defensin met de geselecteerde fluorophore met behulp van een passende peptide labeling kit beschikbaar zijn van commerciële leveranciers. U kunt ook chemisch synthetiseren defensinen fluorophore-label. In deze studie, label MtDef5 defensin met DyLight550 met behulp van een commerciële labeling kit volgens fabrikant protocol en tetramethyl rhodamine (TAMRA)-gelabelde MtDef4 defensin was chemisch gesynthetiseerd commercieel. Opmerking: Het wordt aanbevolen dat chemisch gesynthetiseerde fluorophore gelabeld peptiden (vooral voor korte peptides van 50 aminozuren of minder) gebruikt worden, omdat de fluorophore kan worden aangesloten op het N - of C-terminaal residu van de peptide om minimale invloed op de antimicrobiële activiteit. Synthese van lange peptiden met meer dan drie disulfide bindingen is uitdagend. In dit geval is het aanbevolen dat peptide worden aangeduid met een optimale fluorophore met behulp van een geschikte verkrijgbare peptide labeling kit.</li>
	<li>In vitro antimicrobiële activiteit van de gelabelde defensin te testen de minimaal remmende concentratie (MIC) tegen de schimmels te worden onderzocht. Opmerking: In deze studie werd de MIC van DyLight550-MtDef5 en TMR-MtDef4 tegen Neurospora crassa en Fusarium graminearumbepaald.</li>
</ol>
2. schimmel culturen en groeimedium
<ol>
	<li>Conidiën overbrengen van een N. crassa voorraadculturen slant buis met Vogel's agar middellange21 en Incubeer bij kamertemperatuur onder licht gedurende 5 dagen.</li>
	<li>Cultuur F. graminearum PH-1 Druk op de platen met volledige middellange (CM)22 bij 28 ºC voor 5 dagen. Voor de productie van conidiën, beënten 4 (10 mm doorsnede) stekkers van 5 dagen oude cultuur van F. graminearum PH-1 in 50 mL van carboxymethyl cellulose (CMC) medium (15 g carboxymethylcellulose, 1 g gistextract, 0,5 g MgSO4.7 H2O, 1 g NH 4 GEEN3en 1 g KH2PO4) en cultuur voor 4-7 dagen bij 28 ° c in een roteerapparaat bij 180 t/min.</li>
</ol>
3. bereiding van Conidial schorsing
<ol>
	<li>F. graminearum conidial schorsing
	<ol>
		<li>Vortex de F. graminearum vloeibare cultuur en verzamelen conidiën door het filteren van 1,5 mL schimmel cultuur door middel van twee lagen van filtratie materiaal (zoals Miracloth) in een tube van 2 mL microcentrifuge. Centrifugeer de conidial schorsing op 13,226 x g snelheid in een microcentrifuge gedurende 2 minuten.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en voeg 1 mL steriel water te wassen de pellet.</li>
		<li>Centrifugeer de conidial schorsing op 13,226 x g snelheid in een microcentrifuge voor 2 min. negeren het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 mL 2 X SFM (synthetische schimmel Media)23.</li>
		<li>Tellen de conidiën met behulp van een hemocytometer onder een lichte Microscoop.</li>
		<li>Pas de conidial schorsing tot 105 conidiën/mL met 2 X SFM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>N. crassa conidial schorsing
	<ol>
		<li>Breng een kleine hoeveelheid groeiende cultuur (5 dagen oud) van N. crassa met behulp van een lus van de inoculatie tot een koker van de microcentrifuge met 2 mL vloeibare voedingsbodem van Vogel's.</li>
		<li>Vortex conidial opschorting en filteren door middel van filtratie materiaal in een nieuwe microcentrifuge buis.</li>
		<li>Centrifugeer de conidial schorsing op maximale snelheid in een microcentrifuge voor 2 min. negeren het supernatant en resuspendeer de conidial pellet in 1 mL vloeibare voedingsbodem van Vogel's.</li>
		<li>Tellen de conidiën met behulp van een hemocytometer onder een lichte Microscoop.</li>
		<li>Pas de conidial schorsing tot 105 conidiën/mL met vloeistof van Vogel's.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. voorbereiding en confocale microscopie proeven
<ol>
	<li>Subcellular Localisatie van MtDef4 defensin in schimmel cellen
	<ol>
		<li>Pipeteer 50 µL van elke conidial ophanging (105 conidiën/mL) in de 10 mm-microwell van 35 mm glas onder microwell gerechten. Voor de observatie van conidiën, direct doorgaan naar de volgende stap of germlings voorbereiding, pipet 50 µL van N. crassa en F. graminearum conidiën in de 35 mm cultuur gerechten en laten ontkiemen gedurende 3-6 uur op kamertemperatuur.</li>
		<li>Voeg 50 µL van fluorescently geëtiketteerde defensin op de MIC aan elk gerecht microwell en incubeer gedurende 2,5 uur. De microfoon van het fluorophore-label defensinen hier gebruikt (stap 1.3) is 3 µM voor zowel N. crassa en F. graminearum en de MIC van TMR-MtDef4 voor N. crassa en F. graminearum was 1 µM en 12 µM, respectievelijk.</li>
		<li>Voeg 2 µL van membraan-selectieve kleurstof FM4-64 (eindconcentratie: 5 µM) in cultuur schotel en incubeer gedurende 30 min en onmiddellijk te monteren op de confocal microscoop voor afbeeldingen.</li>
		<li>Selecteer de White Light laser (WLL). Gebruik de twee laser bronnen 488 nm en 550 nm te prikkelen TMR-MtDef4 en FM4-64 kleurstof, respectievelijk. Detecteren van de fluorescentie van TMR-MtDef4 bij 580-700 nm en detecteren FM4-64 kleurstof op 690-800 nm. Opmerking: Voer confocale microscopie in de donkere kamer.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tijd lapse beeldvorming van internalisering van MtDef5 defensin
	<ol>
		<li>Pipeteer 50 µL van N. crassa en F. graminearum conidial ophanging (105 conidiën/mL) in 10 mm microwell voor 35 mm glas onder microwell gerechten. De microwell van 10 mm is gelamineerd en heeft een No. 1.5 cover glas onderaan. Voor de observatie van conidiën, direct doorgaan naar de volgende stap. Incubeer gedurende 3-6 uur op kamertemperatuur voordat u verdergaat met de microscopie conidiën voor observatie van germlings.</li>
		<li>WLL inschakelen. Selecteer de regel van de laser bij 550 nm te wekken van het fluorophore-label defensinen hier gebruikt (stap 1.3) en FM4-64 met 1,00% intensiteit en activeren van de overeenkomstige detectoren. Het fluorophore-label defensinen hier gebruikt (stap 1.3) werd ontdekt op 560-600 nm en de FM4-64dye werd ontdekt op 690-800 nm. Opmerking: De intensiteit van de lage laser van het gebruik voor levende cellen imaging zoals hoge laser intensiteit schade aan de levende schimmel cellen toebrengen kan.</li>
		<li>Monteer de schotel microwell op de Microscoop. De cellen met behulp van 10 x doelstellingen in eerste instantie zoeken en vervolgens overschakelen naar 100 x / 1,44 olie doelstelling voor hogere vergroting. Opmerking: De scan-modus ingesteld op xyzt (combinatie van Z-stack en time-lapse modi), Z-positie, Zoom, frequentie van Fotolader, enz.</li></ol></li></ol>voordat u verdergaat met de volgende stap.
		<li>50 µL van het fluorophore-label defensinen hier gebruikt (stap 1.3) voor op de MIC 3 µm en 2 µL van membraan-selectieve kleurstof FM4-64 (eindconcentratie 5 µM) toevoegen aan elk gerecht microwell en start time-lapse imaging. Kleine stukken van natte papieren filters in de microwell-gerechten om te voorkomen dat verdamping plaats. De frequentie van Fotolader was 3 min 30 s en de totale periode 2 h 30 min. Opmerking: Defensin en fluorophore toevoegen na montage microwell schotel in de Microscoop kunt defocus de regio van belang. Daarom, na het toevoegen van defensin en fluorophore aan de microwell, regio van belang moet worden geconcentreerd die leiden vertraging in Beeldacquisitie tot kan.</li>
		<li>Gebruik een confocal microscoop voor alle confocal beeldvorming en uitvoeren van de microscopie bij kamertemperatuur in een donkere kamer.</li>

<ol><li>Jones, J. D. G., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v444/n7117/full/nature05286.html">The plant immune system.</a> Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).</li>
<li>Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Plant+Peptidome%3A+An+expanding+repertoire+of+structural+features+and+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+cell%22%5BJournal%5D)">The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions.</a> Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).</li>
<li>Van Der Weerden, N. L., Bleackley, M. R., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+mechanisms+of+action+of+naturally+occurring+antifungal+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+and+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Properties and mechanisms of action of naturally occurring antifungal peptides.</a> Cell. and Mol. Life Sci. 70 (19), 3545-3570 (2013).</li>
<li>Van der Weerden, N. L., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Marilyn_Anderson/publication/257691605_Plant_defensins_Common_fold_multiple_functions/links/02e7e5269aee227c27000000.pdf">Plant defensins: Common fold, multiple functions.</a> Fungal Biol Rev. 26 (4), 121-131 (2013).</li>
<li>De Coninck, B., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1749461312000346">Modes of antifungal action and in planta functions of plant defensins and defensin-like peptides.</a> Fungal Biol Rev. 26 (4), 109-120 (2013).</li>
<li>Kaur, J., Sagaram, U. S., Shah, D. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S174946131100042X">Can plant defensins be used to engineer durable commercially useful fungal resistance in crop plants?</a> Fungal Biol. Rev. 25 (3), 128-135 (2011).</li>
<li>Vriens, K., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+plant+defensins%3A+Mechanisms+of+action+and+production%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Antifungal plant defensins: Mechanisms of action and production.</a> Molecules. 19 (8), 12280-12303 (2014).</li>
<li>Sagaram, U. S., Kaur, J., Shah, D. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bk-2012-1095.ch015">Antifungal plant defensins: Structure-activity relationships, modes of action, and biotech applications.</a> ACS Symp. Ser. 1095, 317-336 (2012).</li>
<li>Thevissen, K., Francois, I. E. J. A., Aerts, A. M., Cammue, B. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+sphingolipids+as+targets+for+the+development+of+selective+antifungal+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Fungal sphingolipids as targets for the development of selective antifungal therapeutics.</a> Curr. Drug Targets. 6 (8), 923-928 (2005).</li>
<li>Thevissen, K., Kristensen, H. H., Thomma, B. P. H. J., Cammue, B. P. A., Francois, I. E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+antifungal+plant+and+insect+defensins%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins.</a> Drug Discov. Today. 12 (21-22), 966-971 (2007).</li>
<li>Aerts, A. M., François, I. E. J. A., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mode+of+antifungal+action+of+plant%2C+insect+and+human+defensins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65 (13), 2069-2079 (2008).</li>
<li>Van Der Weerden, N. L., Lay, F. T., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+defensin%2C+NaD1%2C+enters+the+cytoplasm+of+Fusarium+oxysporum+hyphae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The plant defensin, NaD1, enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae.</a> J. Biol. Chem. 283 (21), 14445-14452 (2008).</li>
<li>Lobo, D. S., Pereira, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+Pisum+sativum+Defensin+1+Interacts+with+Neurospora+crassa+Cyclin+F+Related+to+the+Cell+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Antifungal Pisum sativum Defensin 1 Interacts with Neurospora crassa Cyclin F Related to the Cell Cycle.</a> Biochemistry. 46 (4), 987-996 (2007).</li>
<li>El-Mounadi, K., Islam, K. T., Hernandez-Ortiz, P., Read, N. D., Shah, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+mechanisms+of+a+plant+defensin+MtDef4+are+not+conserved+between+the+ascomycete+fungi+Neurospora+crassa+and+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antifungal mechanisms of a plant defensin MtDef4 are not conserved between the ascomycete fungi Neurospora crassa and Fusarium graminearum.</a> Mol. Microbiol. 100 (3), 542-559 (2016).</li>
<li>Baxter, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tomato+Defensin+TPP3+Binds+Phosphatidylinositol+%284%2C5%29-Bisphosphate+via+a+Conserved+Dimeric+Cationic+Grip+Conformation+To+Mediate+Cell+Lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+and+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Tomato Defensin TPP3 Binds Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate via a Conserved Dimeric Cationic Grip Conformation To Mediate Cell Lysis.</a> Mol. and Cell. Biol. 35 (11), 1964-1978 (2015).</li>
<li>Kvansakul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+phosphatidic+acid+by+NsD7+mediates+the+formation+of+helical+defensin-lipid+oligomeric+assemblies+and+membrane+permeabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Binding of phosphatidic acid by NsD7 mediates the formation of helical defensin-lipid oligomeric assemblies and membrane permeabilization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113, 11202-11207 (2016).</li>
<li>Poon, I. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide-mediated+oligomerization+of+a+defensin+induces+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide-mediated oligomerization of a defensin induces cell lysis.</a> eLife. 3, e01808(2014).</li>
<li>Muñoz, A., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+and+analysis+shed+light+on+the+complexity+and+dynamics+of+antimicrobial+Peptide+action%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging and analysis shed light on the complexity and dynamics of antimicrobial Peptide action.</a> Front. Immunol. 3, 248(2012).</li>
<li>Hayes, B. M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+mechanism+of+action+of+the+plant+defensin+NaD1+as+a+new+member+of+the+antifungal+drug+arsenal+against+candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Identification and mechanism of action of the plant defensin NaD1 as a new member of the antifungal drug arsenal against candida albicans.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 57 (8), 3667-3675 (2013).</li>
<li>Muñoz, A., Marcos, J. F., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration-dependent+mechanisms+of+cell+penetration+and+killing+by+the+de+novo+designed+antifungal+hexapeptide+PAF26%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Concentration-dependent mechanisms of cell penetration and killing by the de novo designed antifungal hexapeptide PAF26.</a> Mol. Microbiol. 85 (1), 89-106 (2012).</li>
<li>Eaton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+guanine+nucleotide+exchange+factor+RIC8+regulates+conidial+germination+through+G%CE%B1+proteins+in+Neurospora+crassa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The guanine nucleotide exchange factor RIC8 regulates conidial germination through Gα proteins in Neurospora crassa.</a> PLoS One. 7 (10), e48026(2012).</li>
<li>Leslie, J. F., Summerell, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLeslie%2C+JF+%22The+Fusarium.+laboratory+manual%22">The Fusarium. laboratory manual</a>. , Blackwell Professional. Ames, IA, USA. (2006).</li>
<li>Broekaert, W. F., Terras, F. R. G., Cammue, B. P. A., Vanderleyden, J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1574-6968.1990.tb04174.x/abstract">An automated quantitative assay for fungal growth inhibition.</a> FEMS Microbiol.Lett. 69 (1-2), 55-59 (1990).</li>
<li>Sagaram, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+studies+of+a+phosphatidic+acid-binding+antifungal+plant+defensin+MtDef4%3A+Identification+of+an+RGFRRR+motif+governing+fungal+cell+entry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Structural and functional studies of a phosphatidic acid-binding antifungal plant defensin MtDef4: Identification of an RGFRRR motif governing fungal cell entry.</a> PLoS One. 8 (12), 1-22 (2013).</li>
<li>Uchida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+X-ray+tomography+of+phenotypic+switching+and+the+cellular+response+to+antifungal+peptoids+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (46), 19375-19380 (2009).</li>
<li>Nair, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+prediction+of+sub-cellular+localization+by+combining+evolutionary+and+structural+information%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins+Struct.+Funct.+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Better prediction of sub-cellular localization by combining evolutionary and structural information.</a> Proteins Struct. Funct. Bioinform. 53 (4), 917-930 (2003).</li>
<li>Scott, M. S., Calafell, S. J., Thomas, D. Y., Hallett, M. T. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/ploscompbiol/article?id=10.1371/journal.pcbi.0010066">Refining protein subcellular localization.</a> PLoS Comput. Biol. 1 (6), e66(2005).</li>
<li>Shagaghi, N., Bhave, M., Palombo, E., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+sequence+of+interactions+of+PuroA+peptide+with+Candida+albicans+cells+by+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Revealing the sequence of interactions of PuroA peptide with Candida albicans cells by live-cell imaging.</a> Sci. Rep. 7, 43542(2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In deze studie werd een betrouwbare live-cel imaging methodologie met het gebruik van fluorescently geëtiketteerde antischimmel defensinen omschreven te bestuderen van de kinetiek van de internalisering van deze peptiden in schimmel cellen en om hun subcellular doelstellingen te bepalen. Deze methode is een krachtig hulpmiddel voor het visualiseren van de dynamiek van de interactie tussen defensinen en schimmel cellen stoffelijk en ruimtelijk.
Verschillende methoden zijn gebruikt om het onderz...

Planten hebben zich ontwikkeld van een verfijnde ingeboren immune systeem voor verdediging tegen de microbiële plant ziekteverwekkers1. Zij express talrijke gen gecodeerde host defense peptiden met vermeende antimicrobiële activiteit2. Sterker nog, veel van deze peptiden weergeven antimicrobiële activiteit in vitro3 Defensinen bestaan uit één van de grootste groepen van host defense peptiden in de plant Koninkrijk4. Deze peptiden cysteïne-rijke, kationische Exposeren krachtige groei inhiberende activiteit tegen schimmel en oomycete ziekteverwekkers op micromolar concentraties en vertegenwoordigen een van de eerste regels van verdediging tegen deze ziekteverwekkers5,6. Vanwege hun krachtige antischimmel activiteit, kan de defensinen in agribiotechnological toepassingen voor het genereren van de ziekte resistente gewassen worden benut. Constitutieve overexpressie van verschillende plant defensinen is aangetoond dat verbetering van de ziekteresistentie in de serre en veld tests van transgene gewassen6. Het is belangrijk te ontrafelen van de mechanismen van de actie (MOA) van deze antischimmel peptides om hun potentieel volledig te benutten als effectieve instrumenten voor gewasbescherming. Echter, de MOA voor de defensinen van deze plant zijn slecht begrepen. Huidige bewijs suggereert dat ze verschillende MOA5,6,7,8 vertonen. Sommige defensinen extracellularly handelen op schimmels en gericht op specifieke celwand/plasma membraan resident sfingolipiden, verstoren de membraan integriteit en activeren van cellulaire toxiciteit trajecten9,10,11. Onlangs, echter, antischimmel defensinen die in schimmel cellen translocate zijn ontdekt12,13,14. Sommige van deze defensinen binden aan membraan-ingezeten bioactieve fosfolipiden, vormen van oligomere complexen en permeabilize plasma membranen15,16,17. Zo hebben sommige aspecten van de MOA van plantaardige defensinen zijn opgehelderd. Echter de MOA van plantaardige defensinen waarschijnlijk betrekking hebben op een complexe reeks gebeurtenissen die hebben nog niet geïdentificeerd en geïntegreerd in een uitgebreide model. In het bijzonder, blijft er een grote kloof in ons begrip van de cellulaire doelstellingen van deze peptiden.
Met recente vooruitgang in microscopie technologieën en de ontwikkeling van nieuwe TL sondes, zijn live-cel beeldvormingstechnieken nu vaak gebruikt voor het bestuderen van de MOA van antimicrobiële peptides (ampère). Deze technieken aanvullen gebruikte methoden zoals immunolocalization, atomaire kracht microscopie en elektronenmicroscopie X-ray tomografie18, die meestal voor het analyseren van de gevolgen van antischimmel peptiden voor de morfologie hebben gewerkt en groei van de schimmel cellen met inbegrip van de studie van de integriteit van de celwand, wijzigingen in celpatronen groei/vertakking, evenals plasmamembraan permeabilization en doden. Deze studies hebben echter beperkt tot imaging cellen op een bepaald punt van de tijd na de behandeling met de peptiden in plaats van het uitvoeren van time-lapse imaging op dezelfde cellen te controleren hun dynamische veranderingen in reactie op defensin uitdaging. In de afgelopen jaren heeft gebruik van fluorescently geëtiketteerde peptiden in combinatie met levende cel imaging met behulp van de confocal microscopie Visualisatie in real time van de dynamiek van de AMP-microbe interacties. Beide natuurlijk gezuiverd en chemisch gesynthetiseerde antischimmel peptiden kunnen worden gelabeld met de fluorescerende etiketten (b.v., DyLight, rhodamine, BODIPY of Alexa Fluor gebaseerd kleurstoffen) en rechtstreeks waargenomen tijdens hun interactie met cellen door time-lapse Live-cel imaging. Het gebruik van deze peptiden label is aanzienlijk gestegen van ons begrip van de verschillende aspecten van hun MOA waaronder modus van binnenkomst, subcellular localisatie, intracellulaire mensenhandel, en sites van antischimmel actie binnen levende schimmel cellen 18.
Verschillende studies hebben onlangs aangetoond dat verschillende antischimmel peptiden, met inbegrip van plantaardige defensinen zijn geïnternaliseerd door levende schimmel cellen12,14,19,20. De MOA van deze defensinen waarschijnlijk betrekken interactie met intracellulaire doelen. Onlangs hebben we de schimmeldodende werking van een plant MtDef4 in twee Ascomycota schimmels, Neurospora crassa en Fusarium graminearumdefensin gemeld. MtDef4 werd aangetoond dat het gebruik van verschillende routes voor schimmel cel invoeren en subcellular localisatie in deze schimmels14. Deze studie gebruikt chemisch gesynthetiseerd tetramethyl rhodamine (TAMRA)-label van MtDef4 in combinatie met vitale fluorescente kleurstoffen (membraan-permeant kleurstof, SYTOX Green, de membraan selectieve kleurstof, FM4-64; de cel dood verslaggever kleurstof, propidium jodide) en metabole remmers. Deze analyses aangetoond de kinetiek van de internalisering van de MtDef4, de mechanismen van intracellulair transport en haar subcellular doelstellingen14.
Hier, wordt een protocol voor live-cel geschikt zijn met behulp van de confocal microscopie gepresenteerd. Het protocol maakt gebruik van fluorescently geëtiketteerde peptiden in combinatie met vitale fluorescente kleurstoffen te bestuderen van de plant defensin-schimmel interacties, in het bijzonder, de trajecten van translocatie en de intracellulaire doelstellingen van defensinen in cellen van de schimmel.

<table><tbody><tr><td>FM4-64 Dye</td><td>Life Technologies</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 550 Antibody Labeling Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>84530</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottom Microwell Dishes</td><td>Mat TeK</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Mira cloth</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>475855-1R</td><td></td></tr><tr><td>SP8-X confocal microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>FiJi</td><td></td><td>Voor beeldanalyse</td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Voor beeldanalyse</td></tr></tbody></table>

live-cel beeldvorming van schimmel cellen om modi van binnenkomst en subcellular localisatie van antischimmel plant defensinen te onderzoeken

Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

Kleine cysteïne-rijke defensinen zijn één van de grootste groepen van host defense peptides aanwezig in alle planten. Veel plantaardige defensinen Exposeren krachtige in vitro antischimmel activiteit tegen een breedspectrum van schimmel ziekteverwekkers en daarom hebben het potentieel om te worden gebruikt als antischimmel gemachtigden in transgene gewassen. Om te benutten het volledige potentieel van de plant defensinen voor ziekten controle, is het van cruciaal belang voor het ophelderen van de mechanismen van de actie (MOA). Met de komst van geavanceerde microscopie technieken, live-cel imaging uitgegroeid tot een krachtig hulpmiddel voor het inzicht in de dynamiek van de antischimmel MOA van plantaardige defensinen. Hier, wordt een confocale microscopie gebaseerd live-cel beeldvorming beschreven met behulp van twee fluorescently geëtiketteerde plant defensinen (MtDef4 en MtDef5) in combinatie met vitale fluorescente kleurstoffen. Deze techniek maakt visualisatie in real time en analyse van de dynamische gebeurtenissen van internalisering van de MtDef4 en MtDef5 in cellen van de schimmel. Nog belangrijker is, is deze test genereert een schat aan informatie, met inbegrip van internalisering kinetiek, wijze van vermelding en subcellular localisatie van deze peptiden. Samen met andere cel biologische hulpmiddelen, hebben deze methoden kritisch inzicht in de dynamiek en de complexiteit van de MOA van deze peptides verstrekt. Deze hulpprogramma's kunnen ook worden gebruikt om te vergelijken de MOA van deze peptides tegen andere schimmels.

Live cel imaging werd uitgevoerd voor het bijhouden en vergelijken de internalisering en subcellular localisatie van twee defensinen, MtDef4 en MtDef5, van Medicago truncatula; in de cellen van de schimmel. TMR-MtDef4 was chemisch gesynthetiseerd terwijl MtDef5 was gelabeld met Dylight550 (Dylight550-MtDef5). Conidiën werden geïncubeerd met beide defensin in combinatie met de membraan selectieve kleurstof FM4-64. Figuur 1 toont de TMR-MtDef4 heeft ve...

Plant defensinen spelen een belangrijke rol in de verdediging van de plant tegen ziekteverwekkers. Voor effectief gebruik van deze antischimmel peptiden als antischimmel gemachtigden, begrijpen hun vervoerswijzen actie (MOA) is van cruciaal belang. Hier, wordt een live-cel beeldvorming beschreven om te bestuderen van kritieke aspecten van de MOA van deze peptiden.

Live-cel beeldvorming van schimmel cellen om modi van binnenkomst en Subcellular Localisatie van antischimmel Plant defensinen te onderzoeken

Small cysteine-rich defensins are one of the largest groups of host defense peptides present in all plants. Many plant defensins exhibit potent in vitro ...

Het algemene doel van deze methode voor live-cell imaging is het bestuderen van kritische aspecten van de werkingsmechanismen van antifungale plantdefensines in schimmelcellen. Met de komst van geavanceerde confocale microscopietechnieken is live-cell imaging een krachtig instrument geworden om de werkingswijzen van antifungale plantdefensines te bestuderen. Door gebruik te maken van deze technologie presenteren wij hier een methode die helpt bij het beantwoorden van kernvragen voor het begrijpen van de werkingswijzen van antifungale plantdefensines.Onze focus ligt op hoe deze peptiden worden geïnternaliseerd in de schimmelcellen en hoe deze peptiden gelokaliseerd zijn in de celorganellen of diffunderen in het cytoplasma. Om een conidiesuspensie van de PH-1 stam van Fusarium graminearum te maken, worden eerst culturen van de stam op platen met compleet medium opgezet. Kweek deze gedurende vijf dagen bij 28 °C.Om conidia te produceren, inoculeert u vier pluggen met een diameter van 10 millimeter van de vijf dagen oude cultuur in 50 milliliter carboxymethylcellulosemedium. Cultiveer deze pluggen gedurende vier tot zeven dagen bij 28 graden Celsius op een rotoschudmachine ingesteld op

live-cell-imaging-fungal-cells-to-investigate-modes-entry-subcellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates live cell imaging for the analysis of antifungal activity in human neutrophils using fluorescent Aspergillus reporter conidia. Initially, both red and magenta fluorescence are detected within neutrophils, while red fluorescence decreases over time, indicating the degradation of conidia and confirming the antifungal activity of neutrophils.

Real-Time Assessment of the Antifungal Activity of Primary Human Immune Cells

We beschrijven werkwijzen voor levende cellen videomicroscopie...

Live-cel Video Microscopie van pathogene schimmel Fagocytose

Hier beschrijven we een protocol om antifungale activiteit van primaire menselijke immuuncellen te beoordelen in real-time met behulp van fluorescente Aspergillus reporter conidia in combinatie met live-cell video microscopie en flowcytometrie. Gegenereerde data inzicht in gastheer Aspergillus cel-interacties zoals fungicide werking, fagocytose, celmigratie remming van de schimmelgroei.

Live-Imaging van antischimmelactiviteit door Human Primary neutrofielen en monocyten in reactie op<em&gt; A. fumigatus</em

Fluorescerende eiwit gebaseerde benaderingen te controleren effectoren uitgescheiden door bacteriën in de cellen van de gastheer zijn uitdagend. Dit is te wijten aan de incompatibiliteit tussen fluorescente proteïnen en het type III secretie systeem. Hier, wordt een geoptimaliseerde split superfolder GFP-systeem gebruikt voor visualisatie van effectoren uitgescheiden door bacteriën in de fabriek van de gastheercel.

Split groen Fluorescent proteïne systeem te visualiseren effectoren verlost van bacteriën tijdens de infectie

Vitale fluorescerende kleurstoffen zijn essentiële hulpmiddelen voor Live-celbeeldvormings analyses in moderne schimmel celbiologie. Dit papier Details de toepassing van gevestigde en minder bekende fluorescerende kleurstoffen voor het volgen van plasma membraan dynamiek, Endo-/exocytose en celwand morfogenese in filamenteuze schimmels.

Toepassing van selectieve fluorescerende kleurstoffen voor membraan-en celwand voor het beeldvorming van filamenteuze schimmels in levende cellen

Vanwege de ondoorzichtigheid van de bodem kunnen interacties tussen de samenstellende microben niet gemakkelijk worden gevisualiseerd met cellulaire resolutie. Hier worden twee microfluïdische hulpmiddelen gepresenteerd, die nieuwe mogelijkheden bieden voor het onderzoeken van schimmel-microbiële interacties. De apparaten zijn veelzijdig en eenvoudig te gebruiken, waardoor hoge spatiotemporale controle en beeldvorming met hoge resolutie op cellulair niveau mogelijk is.

Microfluïdische hulpmiddelen voor het onderzoeken van schimmel-microbiële interacties op cellulair niveau

Dit manuscript beschrijft een geoptimaliseerd inoculatieprotocol dat gebruik maakt van losse maïsbladomhulsels voor reproduceerbare cytologische, fysiologische en moleculaire studies van maïsinteracties met schimmelpathogenen van planten. De bladomhulsels vergemakkelijken real-time observatie van cellulaire interacties tussen de levende plant en de schimmel in niet-gefixeerde weefsels.

Losse maïsomhulsels voor levende beeldvorming van infectie door schimmelpathogenen van bladmaïs

Xenopus embryonale epitheel is een ideaal modelsysteem om cel gedrag, zoals polariteit ontwikkeling en vorm veranderen tijdens epitheliale morfogenese bestuderen. Traditionele histologie van vaste monsters wordt in toenemende mate aangevuld door live-cell imaging confocale. Hier laten we zien methoden om de kikker weefsel te isoleren en te visualiseren live-epitheliale cellen en hun cytoskelet met behulp van live-cell confocale microscopie.

Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis</em

Fluorescentie-gebaseerde waardering van Store-bediende Calcium Entry in levende cellen: van Cultured Cancer Cell op Skeletal Muscle Fiber

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het visualiseren van een DNA dubbelstrengs breuken signaleringeiwit geactiveerd in reactie op DNA schade en de lokalisatie tijdens mitose.

Twee-en drie-dimensionale live cell imaging van DNA schade respons Eiwitten

Leer live-cel beeldvorming om de internalisatie en subcellulaire lokalisatie van antischimmel plant defensinen in Fusarium graminearum te bestuderen. Deze methode onthult hoe deze peptiden zich gedragen in levende schimmelcellen.

Live-cel beeldvorming van schimmel cellen om modi van binnenkomst en Subcellular Localisatie van antischimmel Plant defensinen te onderzoeken (Video) | JoVE Journal

Live-cel beeldvorming van schimmel cellen om modi van binnenkomst en Subcellular Localisatie van antischimmel Plant defensinen te onderzoeken

Meer video's verkennen