Kwantitatieve lokalisatie van een Golgi-eiwit door Imaging Center van fluorescentie massa

Het algemene doel van deze op beeldvorming gebaseerde methode is om een golgi-eiwit kwantitatief te lokaliseren met een resolutie van nanometer. Deze methode kan helpen om de belangrijkste vragen te beantwoorden in de studie van het golgiapparaat, zoals de organisatie van de golgi en hoe het werkt. Het grote voordeel van deze methode is dat het een conventionele lichtmicroscoop en softwaretools gebruikt.

Om te beginnen, kweek HeLa-cellen in een T25-fles in DMEM aangevuld met 10% FBS en incubeer de cultuur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Wanneer de cellen ongeveer 80% confluency bereiken, aspireer het cultuurmedium en voeg een milliliter van 25% Trypsin EDTA toe aan de fles. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende twee minuten.

Verwijder de cellen uit de incubator en voeg een milliliter compleet medium toe om de cellen voorzichtig van de fleswand af te spoelen. Breng de losgelaten cellen over in een steriele centrifugeerbuis en centrifugeer de buis gedurende twee minuten bij 500 g om de cellen te pelleten. Na het aspireren van het supernatant, gebruik een milliliter compleet medium om het celpellet te suspenderen.

Verwijder het medium uit de put van een 24-welplaat met een gesteriliseerde glazen deksel en zaai ongeveer 100.000 cellen in de put. Gebruik compleet medium om het volume van de put aan te vullen tot 5 milliliter. Bewaar de plaat vervolgens bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.

Wanneer de cellen 80% confluency hebben bereikt, gebruik 80 nanogram GalT-mCherry en 320 nanogram TPST1-EGFP plasmide-DNA en transfectiereagens om de cellen te transfecteren volgens het protocol van de fabrikant. Na de cellen vier tot zes uur te hebben geïncubeerd, ververs het medium en plaats de cellen terug in de incubator voor 12 uur. Aspireer het medium in de put en voeg 5 milliliter van 33 micromold Nocodazole bevattend compleet medium toe en incubeer de cellen vervolgens bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende drie uur.

Na het reinigen van glazen deksels volgens het tekstprotocol, gebruik eenmaal PBS bevattend 1 microgram per microliter van BSA om 110 nanometer multi-kleurige fluorescerende kralen 80 keer te verdunnen. Scheud de buis kort om de kralenaggregaten te verspreiden. Gebruik een pipettentip om 60 microliters van de verdunde kralen op een schone deksel te verspreiden.

Plaats in het donker de deksel in een 35 millimeter schaal en dek deze af met aluminiumfolie. Droog de deksel in het donker in een droogkast verbonden met een vacuümpomp. Gebruik vervolgens 50 microliters montagemedium om de deksel op een glazen plaatje te monteren.

Goed schoongemaakte deksels zijn essentieel om fluorescente deeltjes te elimineren. Om multi-kleurige kralen in groene, rode en verre rode kanalen te beeld, verwerf aan het begin van de beeldsessie 3D-stacks van afbeeldingen, door drie secties boven en onder het beste brandpuntsvlak te nemen. Sla de stacks op als TIFF-bestanden.

Om golgi-mini-stacks te beeld, gebruik TPST1-EGFP en GalT-mCherry getransfecteerd in fluorescerend gelabelde slides om cellen te vinden die TPST1-EGFP en een laag of medium niveau GalT-mCherry tot expressie brengen. Verwerf 3D-afbeeldingsstacks zoals net gedemonstreerd. Om de afbeeldingen te analyseren, open image J, kies Bestand, Afbeelding, Open, om een set van kralenbeelden te openen bestaande uit drie TIFF-bestanden.

Kies Afbeelding, Stacks, Z Project, om drie opeenvolgende secties rond de beste gefocuste sectie in het rode kanaal te gemiddelen. Voer het sectienummer van startslice en stopslice in en selecteer onder de opties voor projectietype gemiddelde intensiteit. Teken achtergrond ROI's die geen kralen bevatten in het beeld.

Vervolgens in Analyse, Meetinstellingen, vink alleen gemiddelde grijze waarde en Standaardafwijking of SD aan. Voer Analyse, Meet, uit om de gemiddelde achtergrondintensiteit en standaardafwijking te verkrijgen. Kies Proces, Wiskunde, Aftrekken, om het beeld met de overeenkomstige waarden van de gemiddelde achtergrondintensiteit plus zes keer de standaardafwijking af te trekken. Voer vervolgens de berekende waarde in die overeenkomt met dit kanaal.

Herhaal het gemiddelde en aftrekking voor groene en verre rode kanaalafbeeldingsstacks door dezelfde start- en stopslice te gebruiken en dezelfde achtergrond-ROI. Voeg de drie verwerkte afbeeldingen samen met behulp van Afbeelding, Kleur, Kanalen samenvoegen, door kanaal R als rood, kanaal G als groen en kanaal B als blauw te selecteren. Start de ROI Manager door Analyse, Gereedschappen, ROI Manager te kiezen.

Teken vierkante ROI's rond enkele kralen. Voeg vervolgens de ROI toe aan de ROI Manager door op T op het toetsenbord te drukken. Onder Analyse, Meetinstellingen, vink alleen zwaartepunt aan.

In de ROI Manager, selecteer kanaal R en klik op Meten om de X- en Y-coördinaten van de centra van ROI's in het resultatenvenster te verkrijgen. Kopieer en plak de twee kolommen in een spreadsheet. Verkrijg de coördinaten van de centra van ROI's voor kanaal G en kanaal B. Sla de spreadsheet op als beads.csv.

Gebruik in image J plugins installeren om de twee macro's te installeren, macro golgi ROI inspectie en macro output drie kanalen data. Wis de ROI Manager en het resultatenvenster. Open een set van golgi-mini-stack-afbeeldingen bestaande uit drie TIFF-bestanden.

Genereer achtergrond afgetrokken afbeeldingen zoals eerder in deze video is gedemonstreerd voor later gebruik. Dupliqueer vervolgens de afbeeldingen. Onder Proces, Beeldcalculator, voeg de achtergrond afgetrokken kanaal G, kanaal R en kanaal B afbeeldingen toe.

Voor de resulterende afbeelding onder Afbeelding, Aanpassen, Drempel, selecteer Instellen om één als de laagste drempelwaarde in te voeren. Onder Analyse, Deeltjes analyseren, voer de groottebereik in voor grootte pixel te. Voer 50 tot oneindig in, vink uitsluitend randen aan en voeg toe aan manager.

Gebruik vervolgens Afbeelding,