Name: Zeer Multiplexed, Superresolutie Imaging van T-cellen Met behulp van madSTORM (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Leer zeer multiplexed superresolutiebeeldvorming van T-cellen met madSTORM. Deze methode maakt visualisatie van meerdere eiwitten mogelijk met hogere resolutie dan traditionele microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Xufeng Wu voor toegang tot de STORM-microscoop. Dit onderzoek werd ondersteund door het Intramuraal Onderzoeksprogramma van het NCI-Centrum voor Kankeronderzoek en het National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI).

Voorzichtigheid: Raadpleeg al de relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) voor gebruik. Verscheidene van de in dit protocol gebruikte chemicaliën zijn giftig en kankerverwekkend. Gebruik alstublieft alle passende veiligheidspraktijken bij het uitvoeren van het protocol, inclusief het gebruik van technische controles (dampkoker, handschoenkoffer) en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, broek met volledige lengte, gesloten schoenen). 1. Multiplexed Imaging of Activated T Cells <ol><li> Direct geconjugeerde antilichamen met Alexa-647 (A647) kleurstof met behulp van de Alexa 647 antilichamen etikettering kit. Volg het etiketteringsprotocol van de fabrikant. OPMERKING: Dialyse van antilichaamoplossing in 1x PBS wordt aanbevolen voor deze stap om de efficiëntie van antilichamen te vergroten. </li><li> Spin gelabelde antilichamen gedurende 5 minuten bij 20.800 rcf en verzamelen supernatant om geaggregeerde antilichamen te verwijderen. </li><li> Voorbereiding van fluorescerende nano-diamant bedekte deklagen <ol&gt; <li> Bedek 8-deksel dekselkamers (zie reagentielijst) met 250 μL 0,01% Poly-L-Lysine (PLL) gedurende 15 minuten, aspireren en droog bij 65 ° C gedurende 30 minuten. (Spoel nooit voor drogen.) </li><li> Bereid een verdunning van 100 nm FNDs in 1x PBS. Test diverse verdunningen om te verzekeren dat er genoeg FND&#39;s zijn, elk zichtveld in stap 1.2.7 (we gebruiken een 1: 200 verdunning van FND&#39;s die door de fabrikant zijn verstrekt). </li><li> Vortex de verdunde FND&#39;s gedurende 1 minuut. </li><li> Soniceer de FND supernatant gedurende 30 s bij een krachtige instelling. </li><li> Incubeer het sonicated FND supernatant in een PLL-gecoate 8-putjes deklaagkamer gedurende 30 minuten bij kamertemp. </li><li> Was 5x met 1x PBS en visualiseer de FND-gecoate kamer met behulp van 647 nm laser excitatie op de TIRF microscoop. Ideaal gezien zouden 4-10 individuele FND&#39;s zichtbaar moeten zijn in een gezichtsveld gezien de juiste verdunning van FND&#39;s in stap 1.2.2 (we gebruiken een 100X objectief met 256 x 256 camera pixel instelling om 61 x 61 μm zichtveld op te leveren) Met atMinstens één FND aanwezig in elk kwadrant van het beeldgebied. Als de FND&#39;s clusters lijken te zijn ( dwz FND&#39;s met een significant hoger signaal dan omgevende FND&#39;s en een puntverspreidingsfunctie groter dan 200 nm), centrifugeren FND&#39;s bij 6,800 rcf gedurende 1 min en herhaal de bekledingsprocedure met behulp van de FND supernatant. </li><li> Voeg 250 μl anti-CD3-antilichaam (10 μg / ml) in elke put toe en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C of overnacht bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de oplossing en voeg 1x PBS gedurende 30 seconden toe. Herhaal deze wasstap 5 keer (was 5x). </li></ol></li><li> Activatie van Jurkat T-cellen <ol><li> Spin 1 ml Jurkat T-cellen bij 800 rcf gedurende 6 min en resuspendeer in 300 μl 1x HBS-oplossing. Jurkat T-cellen dienen ideaal te zijn bij een concentratie van 0,5-1,0 x 10 6 cellen / ml alvorens te spinnen. 1x HBS-oplossing bestaat uit HEPES-bufferzout met 1% boviene serumalbumine zoals eerder beschreven 22 . </li><li> Voeg 150 μL toeVan 1x HBS oplossing in elke put en incuberen bij 37 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Voeg 50 μL geresuspendeerde Jurkat T-cellen aan elke put en incubeer gedurende 3 minuten bij 37 ° C. </li><li> Voeg 300 μl 4% paraformaldehyde toe aan elke put en incubeer gedurende 30 min bij 37 ° C. </li><li> Was 3x met 1x PBS. </li><li> Permeabiliseer cellen door 250 μl 0,1% Triton-X oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur toe te voegen. </li><li> Was 3x met 1x PBS. </li><li> Voeg 250 μL 1% visgelatineoplossing in 1x PBS toe aan elke putje gedurende 30 minuten bij kamertemp. </li><li> Was 3x met 1x PBS. </li></ol></li><li> Imaging geactiveerde Jurkat T-cellen met behulp van madSTORM <ol><li> Voeg 200 μl gemerkt antilichaam bij 0,1-0,5 μg / ml aan vaste cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Was 5x met 1x PBS. </li><li> Voeg 1 ml STORM buffer toe en bedek de kamer met een glazen deklaag om de blootstelling aan de lucht te beperken. De STORM buffer is eerder beschreven 10 . Wij raden ma aanKoning nieuwe STORM buffer voor elke ronde beeldvorming en draai de STORM buffer bij 20.800 rcf gedurende 2 minuten om precipitaten te verwijderen. </li><li> Gebruik een laag 647 nm laservermogen in de TIRF-modus, zoek een gekleurde cel met ten minste 3 FND&#39;s in het zichtveld. Om te helpen bij het lokaliseren van FND&#39;s kan gelijktijdige excitatie met 568 nm laser gebruikt worden om de helderheid van het FND-signaal te verhogen. OPMERKING: De prestatie van de gemiddelde fiduciale correctie beschreven in paragraaf 2.1 verbetert met het opnemen van meer FND&#39;s. </li><li> Verhoog 647 nm laservermogen en bekom beelden. We verwerven typisch 10.000 beelden bij 200 ms belichting, 125 mW 647 nm laser, 100X TIRF objectieflens (1,49 NA), 100X EM gain (5 MHz bij 16 bit, conversiewinst 1). Details van onze imaging setup zijn eerder beschreven 10 . </li><li> Was 5x met 1x TBS. </li><li> Voeg 1 ml o toeF-elueringsbuffer (3,5 M MgCl2, 20 mM PIPES, 0,1% Tween-20, pH 6,5) en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. </li><li> Herhaal elutie 3 keer. (Exacte elutieomstandigheden en het aantal elutiespoelingen die nodig zijn om het signaal te verwijderen moeten worden gecontroleerd op elk gebruikte antilichaam). </li><li> Was 3x met 1x TBS en voeg 1 ml 1x PBS toe. </li><li> Photobleach met 647 nm laser bij hoge vermogen (125 mW) met 405 nm laser bij 2-5 mW om foto&#39;s te activeren A647 kleurstoffen in donkere toestand. Wacht tot alle resterende signalen van niet-geëlueerde antilichamen gefotografeerd zijn. Dit duurt meestal 2-5 s van laserblootstelling. Het verkrijgen van voorbeeldbeelden (~ 100 frames) met behulp van de STORM instellingen in 1.3.5 na het elueren en fotolakken wordt aanbevolen om het verwijderen van het signaal te bevestigen. We gebruiken typisch 99,8% signaal door deze methode te gebruiken. We raden aan om de elutie-efficiëntie van elk antilichaam te testen voor gebruik in madSTORM zoals eerder getoond 10 . </li><li> Voeg 250 μl 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten toe. Dit prGebeurtenissen omgekeerde verknoping van vaste moleculen in de cel. </li><li> Was 3x met 1x PBS. </li><li> Herhaal stappen 1.3.1-1.3.12 voor opeenvolgende etikettering van meerdere doelen. Figuur 1 toont een samengesteld beeld van meerdere moleculen in een geactiveerde Jurkat T-cel die is verkregen met behulp van madSTORM. </li></ol></li></ol> 2. Drift Correctie en Uitlijning van Multiplexed Image Stacks <ol><li> Driftcorrectie van madSTORM beeldstapels <ol><li> Open afbeeldingen met behulp van ImageJ. We raden aan om de afbeeldingsbestanden om te zetten in een TIFF-formaat voordat u ImageJ opent. Gebruik rechthoek ROI om een ​​enkele FND te selecteren. Speel de tijdsverloop om ervoor te zorgen dat de FND zichtbaar is in elk frame van de beeldstapel. Gebruik Run Analyse in de ThunderSTORM plugin om de FND te lokaliseren. Voor de gemiddelde correctiefactor methode beschreven in 2.1.5 is het belangrijk dat een enkele FND gelokaliseerd is in elk beeldframe (dat wil zeggen dat het aantal geïdentificeerde pieken e moet zijnKwalificeren naar het aantal frames). </li><li> Als de FND niet in elk frame is geïdentificeerd, selecteer een andere FND. Als meerdere pieken zich in een enkel frame bevinden, verwijder dan de piek die het meest afwijkt van de vorige pieken. </li><li> Herhaal 2.1.2 voor elke FND in de beeldstapel. Houd er rekening mee dat sommige FND&#39;s niet in het drijfcorrectieproces moeten worden opgenomen, zodat ze kunnen dienen als een onafhankelijke meter voor drijfcorrectie precisie zoals beschreven in stap 2.1.7. </li><li> Voor snellere, minder nauwkeurige driftcorrectie, gebruik dan de kruiscorrelatie- of fiduciale correctiealgoritmen die in ThunderSTORM zijn opgenomen om de FND-beelden te corrigeren. Gewoonlijk gebruiken we 100 bakken, 5 vergrotingen en 0,1 trajectvergrotingsfactor voor cross correlatie en 10 maximale afstand, 0,1 min markering zichtbaarheid ratio en 0,01 traject-gladingsfactor voor fiduciale correctie. Kruiskorrelatie en fiduciale correctie geven een correctiebestand op dat kan worden toegepast op andere FND&#39;s om de drijfcorrectie precisie te testen. </li><li> Voor strengere nauwkeuriger drijfcorrectie gebruik dan het gemiddelde fiduciale correctie (AFC) algoritme zoals eerder beschreven 10 . Dit proces vereist geen optimalisatie van parameters en levert hogere lokalisatie precisie dan voorspeld door SMLM lokalisatie algoritmen. Een gemiddelde drijfcorrectie vereist echter minstens 4 FND&#39;s en dat de FND&#39;s in elk frame van de beeldstapel gelokaliseerd moeten worden. AFC-driftcorrectie presteert beter met het opnemen van meer FND&#39;s, omdat een groot aantal gelokaliseerde FND&#39;s het vervormende effect van een uitloperpiek in een bepaald kader zal verminderen. </li><li> Plaats alle puntverdelingsfuncties in de beeldstapel met behulp van ThunderSTORM zoals eerder beschreven 10 . We gebruiken gewoonlijk pixelformaat van 100 nm, foto-elektronen per A / D-telling van 4,28, basisniveau A / D-telling van 100, EM-winst van 100, PSF: Geïntegreerde Gaussische lokalisatie, 5 pixel montageradius, maximale waarschijnlijkheidsmetode en 1,3 Pixel initiële sigma.</li><li> Breng de drijfcorrectiefactor die van FND&#39;s is aangeleverd, aan op lokalisaties van de gehele beeldstapel. Controleer het uiteindelijke beeld visueel om de juiste drijfcorrectie te verzekeren ( Figuur 2 ). De resulterende drijfcorrectiefactor moet onafhankelijk worden getest op FND&#39;s die niet in de AFC-procedure zijn opgenomen om het niveau van drijfcorrectie precisie te meten. De precisie van drijfgerichte onafhankelijke FND&#39;s zou dicht bij de gemiddelde precisie / onzekerheidswaarde moeten zijn, berekend uit het lokalisatiealgoritme dat in stap 2.1.6 werd gebruikt. </li><li> Herhaal stappen 2.1.1-2.1.7 voor de madSTORM-beeldstapels van achtereenvolgens gemerkte antilichamen. Houd er rekening mee dat het identificeren van dezelfde set FND&#39;s in elke madSTORM-beeldstap kritiek is voor de volgende uitlijningsprocedure. </li></ol></li><li> Uitlijning van madSTORM afbeeldingen <ol><li> Bereken de centroid positie van de Drift Corrected FNDs in elk MadSTORM beeld. Om dit te doen, vind de gemiddelde x en y-as poSitions voor elke gelokaliseerde FND, en gemiddelde de gemiddelde x en y posities van alle FND&#39;s in elke madSTORM afbeelding. Het gedetailleerde algoritme voor deze stap is eerder beschreven 10 . Richt sequentiële madSTORM afbeeldingen uit met behulp van de centroidposities van FND fiducial markers. Om de uitlijning uit te voeren, bereken de compensatie tussen twee gelokaliseerde madSTORM-beelden door de centroidpositie van FND&#39;s in het tweede madSTORM-beeld van de eerste af te trekken. Vervolgens de verrekeningsbedrag van alle locaties in de tweede madSTORM-afbeelding aftrekken. </li><li> We raden aan om het eerste madSTORM-beeld te gebruiken als referentiebeeld en om deze uitlijningstap te herhalen tussen de eerste en de derde, de eerste en de vierde . Test de nauwkeurigheid van de uitlijning door de afweging tussen FND&#39;s die niet in het uitlijningsproces zijn opgenomen, te meten. Grote offsets kunnen aanwijzen dat verschillende sets FND&#39;s werden gebruikt bij het berekenen van de centroidposities van sequentiële madSTORM beelden. </li><li> Zo ja, stappen 2.2.1-2.2.2 shouLd worden herhaald met dezelfde set FND&#39;s om uitlijning uit te voeren. OPMERKING: Aangepaste codes voor zowel de AFC-drijfcorrectie als de uitlijningsprocedures worden verstrekt. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).</li>
<li>Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+localization+analysis+for+single-molecule+tracking+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Rieger, B., Stallinga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lateral+and+axial+localization+uncertainty+in+super-resolution+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">The lateral and axial localization uncertainty in super-resolution light microscopy.</a> Chemphyschem. 15 (4), 664-670 (2014).</li>
<li>Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnanometre+single-molecule+localization%2C+registration+and+distance+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements.</a> Nature. 466 (7306), 647-651 (2010).</li>
<li>Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%3A+a+method+for+superresolution+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging.</a> Cold Spring Harb Protoc. (6), 498-520 (2013).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((madSTORM%3A+a+superresolution+technique+for+large-scale+multiplexing+at+single-molecule+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">madSTORM: a superresolution technique for large-scale multiplexing at single-molecule accuracy.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3591-3600 (2016).</li>
<li>Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+super-resolution+imaging+with+photo-switchable+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes.</a> Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Erdelyi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+chromatic+offset+in+multicolor+super-resolution+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Correcting chromatic offset in multicolor super-resolution localization microscopy.</a> Opt Express. 21 (9), 10978-10988 (2013).</li>
<li>Gerdes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+single-cell+analysis+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11982-11987 (2013).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+cellular+super-resolution+imaging+with+DNA-PAINT+and+Exchange-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT.</a> Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).</li>
<li>Nanguneri, S., Flottmann, B., Horstmann, H., Heilemann, M., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tomographic+super-resolution+fluorescence+imaging+of+serially+sectioned+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tomographic super-resolution fluorescence imaging of serially sectioned thick samples.</a> PLoS One. 7 (5), e38098(2012).</li>
<li>Schubert, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+proteome+topology+and+function+by+automated+multidimensional+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy.</a> Nat Biotechnol. 24 (10), 1270-1278 (2006).</li>
<li>Tam, J., Cordier, G. A., Borbely, J. S., Sandoval Alvarez, A., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-talk-free+multi-color+STORM+imaging+using+a+single+fluorophore%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-talk-free multi-color STORM imaging using a single fluorophore.</a> PLoS One. 9 (7), e101772(2014).</li>
<li>Valley, C. C., Liu, S., Lidke, D. S., Lidke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+superresolution+imaging+of+multiple+targets+using+a+single+fluorophore%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sequential superresolution imaging of multiple targets using a single fluorophore.</a> PLoS One. 10 (4), e0123941(2015).</li>
<li>Hoebe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+light-exposure+microscopy+reduces+photobleaching+and+phototoxicity+in+fluorescence+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging.</a> Nat Biotechnol. 25 (2), 249-253 (2007).</li>
<li>Kiuchi, T., Higuchi, M., Takamura, A., Maruoka, M., Watanabe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multitarget+super-resolution+microscopy+with+high-density+labeling+by+exchangeable+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multitarget super-resolution microscopy with high-density labeling by exchangeable probes.</a> Nat Methods. 12 (8), 743-746 (2015).</li>
<li>Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+agonist+MHC-peptide+complex-dependent+T+cell+receptor+microclusters+as+scaffolds+for+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling.</a> J Exp Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).</li>
<li>Sarkar, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wide-field+in+vivo+background+free+imaging+by+selective+magnetic+modulation+of+nanodiamond+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Wide-field in vivo background free imaging by selective magnetic modulation of nanodiamond fluorescence.</a> Biomed Opt Express. 5 (4), 1190-1202 (2014).</li>
</ol>

We hebben niets om te onthullen.

De sequentiële multiplexing, driftcorrectie, en uitlijningsprocedures in madSTORM maken het mogelijk om nauwkeurige, hoogmultiplexeerde visualisatie van heterogene structuren in cellen toe te staan. 10 Bovendien vermijdt madSTORM de beperkingen van multi-color STORM, zoals chromatische aberratie en suboptimale fotowisseling / emissie eigenschappen van niet-ver rode kleurstoffen 9 , 12 . Aangezien de elutiestap sterische interferentie sign...

Een verscheidenheid aan superresolutie microscopie technieken zijn ontwikkeld om de diffractie grens van lichtmicroscopie (~ 200 nm) te overwinnen. Onder deze is een categorie technieken genaamd single molecule localization microscopy (SMLM), waaronder foto-activering lokalisatie microscopie (PALM) en stochastische optische reconstructie microscopie (STORM). SMLM technieken delen in het gebruik van fluorophoren die kunnen worden omgeschakeld tussen aan (fluorescerende) en off (donker / foto-geschakeld) staten, waardoor sequentiële lokalisatie van fluorescentie uit enkele moleculen 1 , 2 , 3 . Door zijn compatibiliteit met commercieel verkrijgbare kleurstoffen en microscopen is direct STORM (dSTORM) uitgegroeid tot een algemeen aanvaarde SMLM techniek 4 . DSTORM kan routinematig ~ 10 nm lokalisatie precisie bereiken, gedefinieerd als de onzekerheid bij het berekenen van het middelpunt van een diffractieIon-beperkte puntverdeling functie (PSF). Ondanks de hoge nauwkeurigheid die is geschat met behulp van lokalisatiealgoritmen 5 , 6 , 7 , is de nauwkeurige bepaling van de werkelijke locatie van enkele moleculen gehinderd door een aantal problemen. Ten eerste, mechanische beweging van de microscoopfase tijdens beeldverwerving voegt aanzienlijke onzekerheid toe aan de nauwkeurigheid van lokalisatie. Aangezien SMLM beelden worden verkregen over duizenden time-lapse frames, kunnen nano-schaalbewegingen van de microscoopfase de precisie van de uiteindelijke superresolutiebeeld 8 aanzienlijk in gevaar brengen. Voor het compenseren van de stadiumbeweging tijdens de beeldverzameling wordt de stadiumdrift algemeen geraamd uit regressiegebaseerde montage van binnenste lokalisaties van de afbeelding zelf (kruiscorrelatie) of sequentiële lokalisaties van fiduciale markeringen (fiduciale correctie) 1 , 9 . HowevEr zijn deze methoden nodig voor het optimaliseren van meerdere parameters voor elke beeldstapel en kunnen niet rekening houden met stadiumbewegingen op korte tijdschalen zoals mechanische trillingen. Gouden nanodeeltjes en multicolor fluorescerende kralen zijn gebruikt als fiduciale markers in SMLM, maar ze zijn niet fotostabiel en resulteren in een aanzienlijk lagere precisie na drijfcorrectie dan de stikstofcentrale fluorescerende nano-diamanten (FND&#39;s) gebruikt In madSTORM 10 . Naast de diffractiegrens wordt de lichtmicroscopie verder beperkt door spectrale grenzen. Gelijktijdige visualisatie van meerdere doelen vereist fluorescerende probes met niet-overlappende spectrale profielen, waarbij de fluorescentie gebaseerde lichtmicroscopie in het algemeen beperkt wordt tot 6 kleuren en SMLM tot 2-3 kleuren 4 , 11 , 12 . Bovendien veroorzaakt niet-lineaire chromatische aberratie verkeerde aanpassing van veelkleurige beelden, wHiervoor zijn uitgebreide uitlijningsprocedures nodig met behulp van multi-colored fiducial markers 8 , 13 . Om deze grenzen te overwinnen hebben eerdere studies meerdere doelen getoond door gebruik te maken van herhalende photobleaching of chemische quenching van achtereenvolgens gebonden fluorophoren 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Hoewel deze methoden de spectrale grenzen van microscopie kunnen overwinnen, is fluorescentiebleken bekend dat het een toxisch proces 20 is , en langdurig bleken of blussen kunnen ongewenste neveneffecten veroorzaken, zoals verlies van verknoping. Bovendien kan de accumulatie van fluorescerende probes leiden tot sterische blokkering van bindingsplaatsen in het monster, het voorkomen van grootschalige multiplexing en robuuste targeting van epitopen. Om dergelijke sterische interferentie te vermijden, is een recente sTudy bereikt multiplexing met behulp van stochastische uitwisseling van vrij diffuus eiwitfragmenten 21 . Terwijl deze methode een dichte etikettering van cellulaire structuren mogelijk maakt, vereist het uitgebreide biochemische bereiding om peptidefragmenten te isoleren, geen enkele molecuulposities kan isoleren en niet gemakkelijk grootschalige multiplexing vergemakkelijken met gebruik van commercieel verkrijgbare probes. We presenteren een gedetailleerd videoprotocol dat de sequentiële binding en elutie van fluorescente antilichamen voor multiplexed, antilichaamgrootte beperkte dSTORM (madSTORM) imaging, en het gebruik van fluorescerende nano-diamanten om nauwkeurige drijfcorrectie en uitlijning te bereiken, beschrijft.

<table><tbody><tr><td>8 well coverslip chamber</td><td>Lab-tek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Poly-L-Lysine oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>NV-100 nm Fluorescerende Nano-diamant</td><td>Adamas</td><td>Red FND</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3&epsilon; antilichaam</td><td>BD Biosciences</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>Rund serum albumine, Fractie V</td><td>KSE Scientific</td><td>98-100P</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>10% Paraformaldehyde</td><td>EMS</td><td>15712</td><td>Carcinogeen</td></tr><tr><td>Gelatine uit verswatervishuid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647 antilichaamlabelingkit</td><td>Thermo Fisher</td><td>A20186</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138924</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154</td><td>Zeer giftig, luchtgevoelig</td></tr><tr><td>Cysteamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td>Zeer giftig</td></tr><tr><td>Cyclooctatetraeen 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138924</td><td>Zeer giftig, luchtgevoelig</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3210</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3385</td><td></td></tr></tbody></table>

zeer multiplexed, superresolutie imaging van t-cellen met behulp van madstorm

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogene cellulaire structuren met behulp van single molecule lokalisatie microscopie is gehinderd door onvoldoende lokalisatie precisie en multiplexing vermogen. Met behulp van fluorescerende nano-diamant fiduciale markers beschrijven we de drijfcorrectie- en uitlijningsprocedures die nodig zijn om hoge precisie te verkrijgen in single-molecule lokalisatiemicroscopie. Daarnaast wordt een nieuwe multiplexingstrategie, madSTORM, beschreven waarin meerdere molecules in dezelfde cel worden geteeld met behulp van sequentiële binding en elutie van fluorescerende antilichamen. MadSTORM wordt aangetoond op een geactiveerde T-cel om de locaties van verschillende componenten te visualiseren in een membraan gebonden, multi-eiwitstructuur genaamd de T-celreceptor microcluster. Daarnaast wordt de toepassing van madSTORM als een algemeen hulpmiddel voor het visualiseren van multi-eiwitstructuren besproken.

De sequentiële elutie- en kleurmethode werd gebruikt voor het produceren van het multiplexed madSTORM beeld van microclusters en andere structuren in een geactiveerde Jurkat T-cel ( Figuur 1 , controle-uitlijnen). Elk pseudo-gekleurd beeld vertegenwoordigt één ronde van madSTORM-beeldvorming, verkregen in stappen 1.1.1 tot 1.3.13. Zoals eerder beschreven 10 , moet het zichtveld worden gecontroleerd voor residueel signaal van eerdere, ...

We tonen een methode aan om meerdere molecuelen te identificeren binnen heterogene nano-structuren bij nauwkeurige molecuul nauwkeurigheid, met behulp van sequentiële binding en elutie van fluorescent gelabelde antilichamen.

Zeer Multiplexed, Superresolutie Imaging van T-cellen Met behulp van madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Het algemene doel van dit imaging-protocol is om meerdere eiwitten in een geactiveerde T-cel te visualiseren met behulp van single molecule localisation microscopy. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de T-celactivatie, zoals de distributie op single-molecule niveau van TC- of microclustercomponenten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een grotere multiplexing mogelijk maakt dan bereikt kan worden met huidige supervised solution microscopy-methoden.Begin met het direct conjugeren van antilichamen met Alexa 647-kleurstof, met behulp van de Alexa 647 antibody labeling kit, volgens het labelingsprotocol van de fabrikant. Centrifugeer de gelabelde antilichamen vijf minuten bij 20.800 ×g. Verzamel na centrifugatie het supernatant om de geaggregeerde antilichamen te verwijderen. Coat vervolgens A12 cover slip chambers gedurende 15 minuten met 250 µL 0,1% poly-l-lysine.Zuig vervolgens de oplossing af zonder te spoelen en droog de kamers 30 minuten lang bij 65 degree celsius. Bereid een verdunning van 100 nanometer fluorescerende nanodiamanten of FNDs voor in PBS; test verschillende verdunningen om er zeker van te zijn dat er voldoende FNDs in elk veld zichtbaar zullen zijn. Vortex de verdunde FNDs gedurende één minuut.Sonicate vervolgens het FND-supernatans gedurende 30 seconden bij een hoge vermogensinstelling. Incubeer het gesonicate FND-supernatans in een met poly-l-lyzine gecoate A12-dekglaaskamer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Na het vijfmaal wassen van de kamer met 1x PBS, wordt de FND-gecoate kamer gevisualiseerd met behulp van 647 nanometer laser-excitatie op de turf-microscoop.Gebruik een 100x objectief met een gezichtsveld van 61 bij 61 micron. Bij een passende verdunning van de FND's zouden idealiter vier tot 10 individuele FND's zichtbaar moeten zijn in het gezichtsveld, waarbij in elk kwadrant van het beeldveld ten minste één FND aanwezig is. Zodra de juiste dichtheid van FND's is bereikt, voegt u 250 microliters anti-CD3 antilichaam toe aan elke put.Incubeer de kamer gedurende één uur bij 37 °C of overnacht bij 4 °C. Verwijder na incubatie de oplossing uit de wells en voeg 1x PBS toe voor 30 seconden. Herhaal deze wasstap vijf keer.Centrifugeer één milliliter Jurkat T-cellen bij 800 ×g gedurende zes minuten. Jurkat T-cellen dienen idealiter een concentratie van 0,5 tot één miljoen cellen per milliliter te hebben vóór het centrifugeren. Resuspendeer de cellen in 300 µL 1x HBS-oplossing.Voeg ondertussen 150 µL 1x HBS-oplossing toe aan elke put van de kamer en incubeer 15 minuten bij 37 °C. Voeg vervolgens 50 µL van de resuspendeerde Jurkat T-cellen toe aan elke put en incubeer drie minuten bij 37 °C. Voeg daarna 300 µL 4% paraformaldehyde toe aan elke put en incubeer 30 minuten bij 37 °C.Na drie keer wassen met 1x PBS worden de cellen gepermeabiliseerd door 250 microliters 0,1% Triton x-oplossing toe te voegen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na drie aanvullende wasbeurten met 1x PBS wordt 250 microliters 1% visgelatine-oplossing aan elke well toegevoegd gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Ten slotte worden de cellen nog drie keer gewassen met 1x PBS.Voeg 200 µL gelabelde antilichamen met een concentratie van 0,1 tot 0,5 µg/mL toe aan de gefixeerde cellen gedurende één uur bij kamertemperatuur. Nadat de cellen vijf keer zijn gewassen met 1x PBS, wordt er één mL STORM-buffer toegevoegd en wordt de kamer afgedekt met een glazen dekglas om blootstelling te beperken. Gebruik klemmen op de microscooptafel om de kamer met het dekglas op positie te houden.Deze stap is cruciaal voor grootschalige multiplexing, aangezien hetzelfde gezichtsveld aanwezig moet blijven na meerdere ronden van wassen en incubatie. Lokaliseer met een lage lasersterkte van 647 nanometer in turf-modus een gekleurde cel met ten minste drie FND's in het gezichtsveld. Verhoog de lasersterkte van 647 nanometer en neem de beelden op.Typische parameters kunnen worden gevonden in het tekstprotocol. Was de cellen vijf keer met 1x tris-gebufferde zoutoplossing of 1x TBS. Voeg vervolgens één milliliter elutiebuffer toe en incubeer een minuut bij kamertemperatuur.Herhaal de elutie drie keer. Gebruik de exacte elutiecondities en het aantal elutiespoelingen dat nodig is om het signaal te verwijderen, zoals gespecificeerd voor elk antilichaam. Was de cellen vervolgens drie keer met 1x TBS en voeg één milliliter 1x PBS toe.Een correcte uitvoering van deze elutiestap resulteert in de verwijdering van eerder gebonden antilichamen en maakt een hogere efficiëntie mogelijk voor daaropvolgende antilichaamlabeling. Het is belangrijk om TBS te gebruiken voor wasbeurten om precipitatie tussen de elutiestappen te minimaliseren. Bleek de cellen fotochemisch met een 647 nanometer laser op hoog vermogen, met een 405 nanometer laser bij twee tot vijf milliwatts om Alexa 647-kleurstoffen in de donkere toestand foto-activeren.Wacht tot al het resterende signaal van het niet-geëlutueerde antilichaam is gefotobleekt. Normaal gesproken duurt dit twee tot vijf seconden laserblootstelling. Neem monsterbeelden op, gebruikmakend van de STORM-instellingen na illusie en fotobleken, om de verwijdering van het signaal te bevestigen.Voeg vervolgens 250 µL 4% paraformaldehyde toe gedurende 15 minuten. Dit voorkomt reverse cross-linking van gefixeerde moleculen in de cel. Was de cellen drie keer met 1x PBS.Herhaal deze stappen voor de sequentiële labeling van meerdere targets. Voer ten slotte driftcorrectie en uitlijning van de multiplexe beeldstacks uit zoals beschreven in het tekstprotocol. De sequentiële illusie- en standmethode werd gebruikt om het multiplexe MET STORM-beeld van microclusters en andere structuren in een geactiveerde Jurkat T-cel te produceren.De uiteindelijke MET STORM-afbeelding is gecorrigeerd voor drift en uitlijning, met behulp van gemiddelde fiduciale correctie en FND-fiduciale markers. Hier worden single molecule localisation microscopy-afbeeldingen getoond van een enkele FND gelokaliseerd in 30.000 beeldenframes vóór en na driftcorrectie met gemiddelde fiduciale correctie. Op dezelfde wijze worden hier single molecule localisation microscopy-afbeeldingen getoond van een geactiveerde Jurkat T-cel gekleurd met anti-gefosforyleerd SLP76-antilichamen en FND-fiduciale markers, vóór en na driftcorrectie met gemiddelde fiduciale correctie.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u multiplexed superresolutie-beeldvorming van eiwitten in een geactiveerde T-cel uitvoert met MET STORM. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in drie uur per multiplexing-ronde worden uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het preparaat in dezelfde positie op de microscooptafel moet blijven.Dit kan worden gedaan met behulp van objectklemmen. Vergeet niet dat werken met onze gemodificeerde STORM-buffer extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals ademhalingsbescherming en veiligheidsbrillen altijd moeten worden getroffen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

highly-multiplexed-super-resolution-imaging-of-t-cells-using-madstorm

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De compartimentering van eiwitten, hetzij binnen het plasma membraan of in de intracellulaire locaties is een regulerend mechanisme die sterk kunnen beïnvloeden signalering resultaten, vandaar dat te begrijpen signalering is het van belang het bestuderen van de ruimtelijke en temporele gedrag van de betrokken eiwitten. We beschrijven hier een TIRF microscopie gebaseerde systeem om signaaltransductie in T-cellen te bestuderen, maar is breed toepasbaar.

Een TIRF Microscopie Techniek voor Real-time, gelijktijdige beeldvorming van de TCR en de bijbehorende signaaleiwitten

This video demonstrates an in-situ fluorescence multispectral imaging technique to analyze different subpopulations of infiltrating T cells in tumor tissue. A renal cell carcinoma tissue cryosection is treated with antibodies to label CD8+ T cells that express specific inhibitory receptors and exhibit an immunotherapy-resistant phenotype. The labeled section is visualized using a multispectral microscope to identify the distinct CD8+ T cell subpopulations.

Multiplexed Immunofluorescence Imaging to Analyze Immunotherapy-Resistant T Cell Subpopulations

We beschrijven de bereiding van drie monsters en hoe ze kunnen worden gebruikt voor het optimaliseren en de prestatie van microscopen STORM beoordelen. Met behulp van deze voorbeelden laten we zien hoe ruwe data te verwerven en vervolgens te verwerken tot super-resolutie beelden te verwerven in cellen van ongeveer 30-50 nm resolutie.

Test Monsters voor het optimaliseren van STORM superresolutietechnieken

Hier beschrijven we een hoogwaardige vloeistofchromatografie-gekoppelde massaspectrometrie (HPLC-MS/MS) test om het immunosuppressivum tacrolimus in gedroogde bloedvlekken te kwantificeren met behulp van een eenvoudige handmatige eiwitprecipitatiestap en online kolomextractie.

Kwantificering van de Immunosuppressieve tacrolimus op opgedroogd bloed Spots Met behulp van LC-MS / MS

Om stromingssnelheden en directionaliteit van filamenteus-actine bij de T-cel immunologische synaps te onderzoeken, wordt live-cell superresolutie beeldvorming gecombineerd met totale interne reflectiefluorescentie en gekwantificeerd met behulp van ruimte-tijdelijke beeldcorrelatiespectroscopie.

Corticale actine Flow in T-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd Afbeelding Correlatie Spectroscopie van Structured Verlichting Microscopie Gegevens

Dit artikel schetst een protocol voor de detectie van een of meer plasma en/of intracellulaire membraaneiwitten grondtoestand uitputting (GSD) Super resolutie microscopie met zoogdiercellen. Hier bespreken we de voordelen en de overwegingen van het gebruik van dergelijke benaderingen voor de visualisatie en de kwantificering van cellulaire eiwitten.

Super resolutie beeldvorming van de uitputting van de grondtoestand in zoogdiercellen

Het algemene doel van deze methodiek is geven de optimale proefomstandigheden van monstervoorbereiding Beeldacquisitie en wederopbouw om uit te voeren van 2D dubbele dSTORM kleurenafbeeldingen van microtubuli en intermediaire filamenten in vaste...

Imaging Intermediaire filamenten en microtubuli met 2-dimensionale directe stochastische optische wederopbouw microscopie

Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe rooster Light-Sheet Microscopie te gebruiken om vierdimensionaal visualiseren oppervlakte receptor dynamiek in levende cellen. Hier worden T-celreceptoren op CD4+ primaire T-cellen weergegeven.

Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie

Chip-based superresolutie optische microscopie is een nieuwe benadering van fluorescentiemicroscopie en biedt voordelen in kosteneffectiviteit en doorvoer. Hier worden de protocollen voor chip voorbereiding en beeldvorming getoond voor TIRF microscopie en lokalisatie gebaseerde super-resolution microscopie.

High-throughput totale interne reflectie fluorescentie en directe stochastische optische reconstructie microscopie met behulp van een Photonic chip

Dit protocol beschrijft de procedure voor het uitvoeren van diepe, whole-cell single-molecule localization microscopy (SMLM) met behulp van een draaiende schijf confocale microscoop met optische fotonherplaatsing, waardoor DNA-PAINT-beeldvorming mogelijk is zonder de noodzaak van aangepaste optica of complexe verlichting.

Superresolutiebeeldvorming van hele cellen via DNA-PAINT op een draaiende schijf confocaal met optische fotonhertoewijzing

Dit protocol beschrijft de geavanceerde beeldvormingstoepassingen en het beheer van gedeelde middelen van een laser-scannend confocaal microscoopsysteem, geïntegreerd met een multiplexed arraydetector voor hoogresolutie cellulaire en subcellulaire beeldvorming. De workflow maakt multimodale beeldvorming mogelijk van confocaal tot superresolutie (~120 nm) binnen één platform, waardoor visualisatie op nanoschaal toegankelijker wordt.

Superresolutie beeldvorming en gedeeld beheer: een protocol voor confocale microscopie met multiplexdetectie

Leer zeer multiplexed superresolutiebeeldvorming van T-cellen met madSTORM. Deze methode maakt visualisatie van meerdere eiwitten mogelijk met hogere resolutie dan traditionele microscopie.

Zeer Multiplexed, Superresolutie Imaging van T-cellen Met behulp van madSTORM

Meer video's verkennen