Zeer Multiplexed, Superresolutie Imaging van T-cellen Met behulp van madSTORM

Het algemene doel van dit imaging-protocol is om meerdere eiwitten in een geactiveerde T-cel te visualiseren met behulp van single molecule localisation microscopy. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de T-celactivatie, zoals de distributie op single-molecule niveau van TC- of microclustercomponenten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een grotere multiplexing mogelijk maakt dan bereikt kan worden met huidige supervised solution microscopy-methoden.

Begin met het direct conjugeren van antilichamen met Alexa 647-kleurstof, met behulp van de Alexa 647 antibody labeling kit, volgens het labelingsprotocol van de fabrikant. Centrifugeer de gelabelde antilichamen vijf minuten bij 20.800 ×g. Verzamel na centrifugatie het supernatant om de geaggregeerde antilichamen te verwijderen. Coat vervolgens A12 cover slip chambers gedurende 15 minuten met 250 µL 0,1% poly-l-lysine.

Zuig vervolgens de oplossing af zonder te spoelen en droog de kamers 30 minuten lang bij 65 degree celsius. Bereid een verdunning van 100 nanometer fluorescerende nanodiamanten of FNDs voor in PBS; test verschillende verdunningen om er zeker van te zijn dat er voldoende FNDs in elk veld zichtbaar zullen zijn. Vortex de verdunde FNDs gedurende één minuut.

Sonicate vervolgens het FND-supernatans gedurende 30 seconden bij een hoge vermogensinstelling. Incubeer het gesonicate FND-supernatans in een met poly-l-lyzine gecoate A12-dekglaaskamer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Na het vijfmaal wassen van de kamer met 1x PBS, wordt de FND-gecoate kamer gevisualiseerd met behulp van 647 nanometer laser-excitatie op de turf-microscoop.

Gebruik een 100x objectief met een gezichtsveld van 61 bij 61 micron. Bij een passende verdunning van de FND's zouden idealiter vier tot 10 individuele FND's zichtbaar moeten zijn in het gezichtsveld, waarbij in elk kwadrant van het beeldveld ten minste één FND aanwezig is. Zodra de juiste dichtheid van FND's is bereikt, voegt u 250 microliters anti-CD3 antilichaam toe aan elke put.

Incubeer de kamer gedurende één uur bij 37 °C of overnacht bij 4 °C. Verwijder na incubatie de oplossing uit de wells en voeg 1x PBS toe voor 30 seconden. Herhaal deze wasstap vijf keer.

Centrifugeer één milliliter Jurkat T-cellen bij 800 ×g gedurende zes minuten. Jurkat T-cellen dienen idealiter een concentratie van 0,5 tot één miljoen cellen per milliliter te hebben vóór het centrifugeren. Resuspendeer de cellen in 300 µL 1x HBS-oplossing.

Voeg ondertussen 150 µL 1x HBS-oplossing toe aan elke put van de kamer en incubeer 15 minuten bij 37 °C. Voeg vervolgens 50 µL van de resuspendeerde Jurkat T-cellen toe aan elke put en incubeer drie minuten bij 37 °C. Voeg daarna 300 µL 4% paraformaldehyde toe aan elke put en incubeer 30 minuten bij 37 °C.

Na drie keer wassen met 1x PBS worden de cellen gepermeabiliseerd door 250 microliters 0,1% Triton x-oplossing toe te voegen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na drie aanvullende wasbeurten met 1x PBS wordt 250 microliters 1% visgelatine-oplossing aan elke well toegevoegd gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Ten slotte worden de cellen nog drie keer gewassen met 1x PBS.

Voeg 200 µL gelabelde antilichamen met een concentratie van 0,1 tot 0,5 µg/mL toe aan de gefixeerde cellen gedurende één uur bij kamertemperatuur. Nadat de cellen vijf keer zijn gewassen met 1x PBS, wordt er één mL STORM-buffer toegevoegd en wordt de kamer afgedekt met een glazen dekglas om blootstelling te beperken. Gebruik klemmen op de microscooptafel om de kamer met het dekglas op positie te houden.

Deze stap is cruciaal voor grootschalige multiplexing, aangezien hetzelfde gezichtsveld aanwezig moet blijven na meerdere ronden van wassen en incubatie. Lokaliseer met een lage lasersterkte van 647 nanometer in turf-modus een gekleurde cel met ten minste drie FND's in het gezichtsveld. Verhoog de lasersterkte van 647 nanometer en neem de beelden op.

Typische parameters kunnen worden gevonden in het tekstprotocol. Was de cellen vijf keer met 1x tris-gebufferde zoutoplossing of 1x TBS. Voeg vervolgens één milliliter elutiebuffer toe en incubeer een minuut bij kamertemperatuur.

Herhaal de elutie drie keer. Gebruik de exacte elutiecondities en het aantal elutiespoelingen dat nodig is om het signaal te verwijderen, zoals gespecificeerd voor elk antilichaam. Was de cellen vervolgens drie keer met 1x TBS en voeg één milliliter 1x PBS toe.

Een correcte uitvoering van deze elutiestap resulteert in de verwijdering van eerder gebonden antilichamen en maakt een hogere efficiëntie mogelijk voor daaropvolgende antilichaamlabeling. Het is belangrijk om TBS te gebruiken voor wasbeurten om precipitatie tussen de elutiestappen te minimaliseren. Bleek de cellen fotochemisch met een 647 nanometer laser op hoog vermogen, met een 405 nanometer laser bij twee tot vijf milliwatts om Alexa 647-kleurstoffen in de donkere toestand foto-activeren.

Wacht tot al het resterende signaal van het niet-geëlutueerde antilichaam is gefotobleekt. Normaal gesproken duurt dit twee tot vijf seconden laserblootstelling. Neem monsterbeelden op, gebruikmakend van de STORM-instellingen na illusie en fotobleken, om de verwijdering van het signaal te bevestigen.

Voeg vervolgens 250 µL 4% paraformaldehyde toe gedurende 15 minuten. Dit voorkomt reverse cross-linking van gefixeerde moleculen in de cel. Was de cellen drie keer met 1x PBS.

Herhaal deze stappen voor de sequentiële labeling van meerdere targets. Voer ten slotte driftcorrectie en uitlijning van de multiplexe beeldstacks uit zoals beschreven in het tekstprotocol. De sequentiële illusie- en standmethode werd gebruikt om het multiplexe MET STORM-beeld van microclusters en andere structuren in een geactiveerde Jurkat T-cel te produceren.

De uiteindelijke MET STORM-afbeelding is gecorrigeerd voor drift en uitlijning, met behulp van gemiddelde fiduciale correctie en FND-fiduciale markers. Hier worden single molecule localisation microscopy-afbeeldingen getoond van een enkele FND gelokaliseerd in 30.000 beeldenframes vóór en na driftcorrectie met gemiddelde fiduciale correctie. Op dezelfde wijze worden hier single molecule localisation microscopy-afbeeldingen getoond van een geactiveerde Jurkat T-cel gekleurd met anti-gefosforyleerd SLP76-antilichamen en FND-fiduciale markers, vóór en na driftcorrectie met gemiddelde fiduciale correctie.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u multiplexed superresolutie-beeldvorming van eiwitten in een geactiveerde T-cel uitvoert met MET STORM. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in drie uur per multiplexing-ronde worden uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het preparaat in dezelfde positie op de microscooptafel moet blijven.

Dit kan worden gedaan met behulp van objectklemmen. Vergeet niet dat werken met onze gemodificeerde STORM-buffer extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals ademhalingsbescherming en veiligheidsbrillen altijd moeten worden getroffen tijdens het uitvoeren van deze procedure.