Name: Zeer Multiplexed, Superresolutie Imaging van T-cellen Met behulp van madSTORM (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Leer zeer multiplexed superresolutiebeeldvorming van T-cellen met madSTORM. Deze methode maakt visualisatie van meerdere eiwitten mogelijk met hogere resolutie dan traditionele microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We bedanken Xufeng Wu voor toegang tot de STORM-microscoop. Dit onderzoek werd ondersteund door het Intramuraal Onderzoeksprogramma van het NCI-Centrum voor Kankeronderzoek en het National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI).

Voorzichtigheid: Raadpleeg al de relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) voor gebruik. Verscheidene van de in dit protocol gebruikte chemicaliën zijn giftig en kankerverwekkend. Gebruik alstublieft alle passende veiligheidspraktijken bij het uitvoeren van het protocol, inclusief het gebruik van technische controles (dampkoker, handschoenkoffer) en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, broek met volledige lengte, gesloten schoenen). 1. Multiplexed Imaging of Activated T Cells <ol><li> Direct geconjugeerde antilichamen met Alexa-647 (A647) kleurstof met behulp van de Alexa 647 antilichamen etikettering kit. Volg het etiketteringsprotocol van de fabrikant. OPMERKING: Dialyse van antilichaamoplossing in 1x PBS wordt aanbevolen voor deze stap om de efficiëntie van antilichamen te vergroten. </li><li> Spin gelabelde antilichamen gedurende 5 minuten bij 20.800 rcf en verzamelen supernatant om geaggregeerde antilichamen te verwijderen. </li><li> Voorbereiding van fluorescerende nano-diamant bedekte deklagen <ol&gt; <li> Bedek 8-deksel dekselkamers (zie reagentielijst) met 250 μL 0,01% Poly-L-Lysine (PLL) gedurende 15 minuten, aspireren en droog bij 65 ° C gedurende 30 minuten. (Spoel nooit voor drogen.) </li><li> Bereid een verdunning van 100 nm FNDs in 1x PBS. Test diverse verdunningen om te verzekeren dat er genoeg FND&#39;s zijn, elk zichtveld in stap 1.2.7 (we gebruiken een 1: 200 verdunning van FND&#39;s die door de fabrikant zijn verstrekt). </li><li> Vortex de verdunde FND&#39;s gedurende 1 minuut. </li><li> Soniceer de FND supernatant gedurende 30 s bij een krachtige instelling. </li><li> Incubeer het sonicated FND supernatant in een PLL-gecoate 8-putjes deklaagkamer gedurende 30 minuten bij kamertemp. </li><li> Was 5x met 1x PBS en visualiseer de FND-gecoate kamer met behulp van 647 nm laser excitatie op de TIRF microscoop. Ideaal gezien zouden 4-10 individuele FND&#39;s zichtbaar moeten zijn in een gezichtsveld gezien de juiste verdunning van FND&#39;s in stap 1.2.2 (we gebruiken een 100X objectief met 256 x 256 camera pixel instelling om 61 x 61 μm zichtveld op te leveren) Met atMinstens één FND aanwezig in elk kwadrant van het beeldgebied. Als de FND&#39;s clusters lijken te zijn ( dwz FND&#39;s met een significant hoger signaal dan omgevende FND&#39;s en een puntverspreidingsfunctie groter dan 200 nm), centrifugeren FND&#39;s bij 6,800 rcf gedurende 1 min en herhaal de bekledingsprocedure met behulp van de FND supernatant. </li><li> Voeg 250 μl anti-CD3-antilichaam (10 μg / ml) in elke put toe en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C of overnacht bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de oplossing en voeg 1x PBS gedurende 30 seconden toe. Herhaal deze wasstap 5 keer (was 5x). </li></ol></li><li> Activatie van Jurkat T-cellen <ol><li> Spin 1 ml Jurkat T-cellen bij 800 rcf gedurende 6 min en resuspendeer in 300 μl 1x HBS-oplossing. Jurkat T-cellen dienen ideaal te zijn bij een concentratie van 0,5-1,0 x 10 6 cellen / ml alvorens te spinnen. 1x HBS-oplossing bestaat uit HEPES-bufferzout met 1% boviene serumalbumine zoals eerder beschreven 22 . </li><li> Voeg 150 μL toeVan 1x HBS oplossing in elke put en incuberen bij 37 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Voeg 50 μL geresuspendeerde Jurkat T-cellen aan elke put en incubeer gedurende 3 minuten bij 37 ° C. </li><li> Voeg 300 μl 4% paraformaldehyde toe aan elke put en incubeer gedurende 30 min bij 37 ° C. </li><li> Was 3x met 1x PBS. </li><li> Permeabiliseer cellen door 250 μl 0,1% Triton-X oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur toe te voegen. </li><li> Was 3x met 1x PBS. </li><li> Voeg 250 μL 1% visgelatineoplossing in 1x PBS toe aan elke putje gedurende 30 minuten bij kamertemp. </li><li> Was 3x met 1x PBS. </li></ol></li><li> Imaging geactiveerde Jurkat T-cellen met behulp van madSTORM <ol><li> Voeg 200 μl gemerkt antilichaam bij 0,1-0,5 μg / ml aan vaste cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Was 5x met 1x PBS. </li><li> Voeg 1 ml STORM buffer toe en bedek de kamer met een glazen deklaag om de blootstelling aan de lucht te beperken. De STORM buffer is eerder beschreven 10 . Wij raden ma aanKoning nieuwe STORM buffer voor elke ronde beeldvorming en draai de STORM buffer bij 20.800 rcf gedurende 2 minuten om precipitaten te verwijderen. </li><li> Gebruik een laag 647 nm laservermogen in de TIRF-modus, zoek een gekleurde cel met ten minste 3 FND&#39;s in het zichtveld. Om te helpen bij het lokaliseren van FND&#39;s kan gelijktijdige excitatie met 568 nm laser gebruikt worden om de helderheid van het FND-signaal te verhogen. OPMERKING: De prestatie van de gemiddelde fiduciale correctie beschreven in paragraaf 2.1 verbetert met het opnemen van meer FND&#39;s. </li><li> Verhoog 647 nm laservermogen en bekom beelden. We verwerven typisch 10.000 beelden bij 200 ms belichting, 125 mW 647 nm laser, 100X TIRF objectieflens (1,49 NA), 100X EM gain (5 MHz bij 16 bit, conversiewinst 1). Details van onze imaging setup zijn eerder beschreven 10 . </li><li> Was 5x met 1x TBS. </li><li> Voeg 1 ml o toeF-elueringsbuffer (3,5 M MgCl2, 20 mM PIPES, 0,1% Tween-20, pH 6,5) en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. </li><li> Herhaal elutie 3 keer. (Exacte elutieomstandigheden en het aantal elutiespoelingen die nodig zijn om het signaal te verwijderen moeten worden gecontroleerd op elk gebruikte antilichaam). </li><li> Was 3x met 1x TBS en voeg 1 ml 1x PBS toe. </li><li> Photobleach met 647 nm laser bij hoge vermogen (125 mW) met 405 nm laser bij 2-5 mW om foto&#39;s te activeren A647 kleurstoffen in donkere toestand. Wacht tot alle resterende signalen van niet-geëlueerde antilichamen gefotografeerd zijn. Dit duurt meestal 2-5 s van laserblootstelling. Het verkrijgen van voorbeeldbeelden (~ 100 frames) met behulp van de STORM instellingen in 1.3.5 na het elueren en fotolakken wordt aanbevolen om het verwijderen van het signaal te bevestigen. We gebruiken typisch 99,8% signaal door deze methode te gebruiken. We raden aan om de elutie-efficiëntie van elk antilichaam te testen voor gebruik in madSTORM zoals eerder getoond 10 . </li><li> Voeg 250 μl 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten toe. Dit prGebeurtenissen omgekeerde verknoping van vaste moleculen in de cel. </li><li> Was 3x met 1x PBS. </li><li> Herhaal stappen 1.3.1-1.3.12 voor opeenvolgende etikettering van meerdere doelen. Figuur 1 toont een samengesteld beeld van meerdere moleculen in een geactiveerde Jurkat T-cel die is verkregen met behulp van madSTORM. </li></ol></li></ol> 2. Drift Correctie en Uitlijning van Multiplexed Image Stacks <ol><li> Driftcorrectie van madSTORM beeldstapels <ol><li> Open afbeeldingen met behulp van ImageJ. We raden aan om de afbeeldingsbestanden om te zetten in een TIFF-formaat voordat u ImageJ opent. Gebruik rechthoek ROI om een ​​enkele FND te selecteren. Speel de tijdsverloop om ervoor te zorgen dat de FND zichtbaar is in elk frame van de beeldstapel. Gebruik Run Analyse in de ThunderSTORM plugin om de FND te lokaliseren. Voor de gemiddelde correctiefactor methode beschreven in 2.1.5 is het belangrijk dat een enkele FND gelokaliseerd is in elk beeldframe (dat wil zeggen dat het aantal geïdentificeerde pieken e moet zijnKwalificeren naar het aantal frames). </li><li> Als de FND niet in elk frame is geïdentificeerd, selecteer een andere FND. Als meerdere pieken zich in een enkel frame bevinden, verwijder dan de piek die het meest afwijkt van de vorige pieken. </li><li> Herhaal 2.1.2 voor elke FND in de beeldstapel. Houd er rekening mee dat sommige FND&#39;s niet in het drijfcorrectieproces moeten worden opgenomen, zodat ze kunnen dienen als een onafhankelijke meter voor drijfcorrectie precisie zoals beschreven in stap 2.1.7. </li><li> Voor snellere, minder nauwkeurige driftcorrectie, gebruik dan de kruiscorrelatie- of fiduciale correctiealgoritmen die in ThunderSTORM zijn opgenomen om de FND-beelden te corrigeren. Gewoonlijk gebruiken we 100 bakken, 5 vergrotingen en 0,1 trajectvergrotingsfactor voor cross correlatie en 10 maximale afstand, 0,1 min markering zichtbaarheid ratio en 0,01 traject-gladingsfactor voor fiduciale correctie. Kruiskorrelatie en fiduciale correctie geven een correctiebestand op dat kan worden toegepast op andere FND&#39;s om de drijfcorrectie precisie te testen. </li><li> Voor strengere nauwkeuriger drijfcorrectie gebruik dan het gemiddelde fiduciale correctie (AFC) algoritme zoals eerder beschreven 10 . Dit proces vereist geen optimalisatie van parameters en levert hogere lokalisatie precisie dan voorspeld door SMLM lokalisatie algoritmen. Een gemiddelde drijfcorrectie vereist echter minstens 4 FND&#39;s en dat de FND&#39;s in elk frame van de beeldstapel gelokaliseerd moeten worden. AFC-driftcorrectie presteert beter met het opnemen van meer FND&#39;s, omdat een groot aantal gelokaliseerde FND&#39;s het vervormende effect van een uitloperpiek in een bepaald kader zal verminderen. </li><li> Plaats alle puntverdelingsfuncties in de beeldstapel met behulp van ThunderSTORM zoals eerder beschreven 10 . We gebruiken gewoonlijk pixelformaat van 100 nm, foto-elektronen per A / D-telling van 4,28, basisniveau A / D-telling van 100, EM-winst van 100, PSF: Geïntegreerde Gaussische lokalisatie, 5 pixel montageradius, maximale waarschijnlijkheidsmetode en 1,3 Pixel initiële sigma.</li><li> Breng de drijfcorrectiefactor die van FND&#39;s is aangeleverd, aan op lokalisaties van de gehele beeldstapel. Controleer het uiteindelijke beeld visueel om de juiste drijfcorrectie te verzekeren ( Figuur 2 ). De resulterende drijfcorrectiefactor moet onafhankelijk worden getest op FND&#39;s die niet in de AFC-procedure zijn opgenomen om het niveau van drijfcorrectie precisie te meten. De precisie van drijfgerichte onafhankelijke FND&#39;s zou dicht bij de gemiddelde precisie / onzekerheidswaarde moeten zijn, berekend uit het lokalisatiealgoritme dat in stap 2.1.6 werd gebruikt. </li><li> Herhaal stappen 2.1.1-2.1.7 voor de madSTORM-beeldstapels van achtereenvolgens gemerkte antilichamen. Houd er rekening mee dat het identificeren van dezelfde set FND&#39;s in elke madSTORM-beeldstap kritiek is voor de volgende uitlijningsprocedure. </li></ol></li><li> Uitlijning van madSTORM afbeeldingen <ol><li> Bereken de centroid positie van de Drift Corrected FNDs in elk MadSTORM beeld. Om dit te doen, vind de gemiddelde x en y-as poSitions voor elke gelokaliseerde FND, en gemiddelde de gemiddelde x en y posities van alle FND&#39;s in elke madSTORM afbeelding. Het gedetailleerde algoritme voor deze stap is eerder beschreven 10 . Richt sequentiële madSTORM afbeeldingen uit met behulp van de centroidposities van FND fiducial markers. Om de uitlijning uit te voeren, bereken de compensatie tussen twee gelokaliseerde madSTORM-beelden door de centroidpositie van FND&#39;s in het tweede madSTORM-beeld van de eerste af te trekken. Vervolgens de verrekeningsbedrag van alle locaties in de tweede madSTORM-afbeelding aftrekken. </li><li> We raden aan om het eerste madSTORM-beeld te gebruiken als referentiebeeld en om deze uitlijningstap te herhalen tussen de eerste en de derde, de eerste en de vierde . Test de nauwkeurigheid van de uitlijning door de afweging tussen FND&#39;s die niet in het uitlijningsproces zijn opgenomen, te meten. Grote offsets kunnen aanwijzen dat verschillende sets FND&#39;s werden gebruikt bij het berekenen van de centroidposities van sequentiële madSTORM beelden. </li><li> Zo ja, stappen 2.2.1-2.2.2 shouLd worden herhaald met dezelfde set FND&#39;s om uitlijning uit te voeren. OPMERKING: Aangepaste codes voor zowel de AFC-drijfcorrectie als de uitlijningsprocedures worden verstrekt. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).</li>
<li>Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+localization+analysis+for+single-molecule+tracking+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Rieger, B., Stallinga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lateral+and+axial+localization+uncertainty+in+super-resolution+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">The lateral and axial localization uncertainty in super-resolution light microscopy.</a> Chemphyschem. 15 (4), 664-670 (2014).</li>
<li>Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnanometre+single-molecule+localization%2C+registration+and+distance+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements.</a> Nature. 466 (7306), 647-651 (2010).</li>
<li>Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%3A+a+method+for+superresolution+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging.</a> Cold Spring Harb Protoc. (6), 498-520 (2013).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((madSTORM%3A+a+superresolution+technique+for+large-scale+multiplexing+at+single-molecule+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">madSTORM: a superresolution technique for large-scale multiplexing at single-molecule accuracy.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3591-3600 (2016).</li>
<li>Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+super-resolution+imaging+with+photo-switchable+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes.</a> Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Erdelyi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+chromatic+offset+in+multicolor+super-resolution+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Correcting chromatic offset in multicolor super-resolution localization microscopy.</a> Opt Express. 21 (9), 10978-10988 (2013).</li>
<li>Gerdes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+single-cell+analysis+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11982-11987 (2013).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+cellular+super-resolution+imaging+with+DNA-PAINT+and+Exchange-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT.</a> Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).</li>
<li>Nanguneri, S., Flottmann, B., Horstmann, H., Heilemann, M., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tomographic+super-resolution+fluorescence+imaging+of+serially+sectioned+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tomographic super-resolution fluorescence imaging of serially sectioned thick samples.</a> PLoS One. 7 (5), e38098(2012).</li>
<li>Schubert, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+proteome+topology+and+function+by+automated+multidimensional+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy.</a> Nat Biotechnol. 24 (10), 1270-1278 (2006).</li>
<li>Tam, J., Cordier, G. A., Borbely, J. S., Sandoval Alvarez, A., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-talk-free+multi-color+STORM+imaging+using+a+single+fluorophore%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-talk-free multi-color STORM imaging using a single fluorophore.</a> PLoS One. 9 (7), e101772(2014).</li>
<li>Valley, C. C., Liu, S., Lidke, D. S., Lidke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+superresolution+imaging+of+multiple+targets+using+a+single+fluorophore%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sequential superresolution imaging of multiple targets using a single fluorophore.</a> PLoS One. 10 (4), e0123941(2015).</li>
<li>Hoebe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+light-exposure+microscopy+reduces+photobleaching+and+phototoxicity+in+fluorescence+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging.</a> Nat Biotechnol. 25 (2), 249-253 (2007).</li>
<li>Kiuchi, T., Higuchi, M., Takamura, A., Maruoka, M., Watanabe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multitarget+super-resolution+microscopy+with+high-density+labeling+by+exchangeable+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multitarget super-resolution microscopy with high-density labeling by exchangeable probes.</a> Nat Methods. 12 (8), 743-746 (2015).</li>
<li>Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+agonist+MHC-peptide+complex-dependent+T+cell+receptor+microclusters+as+scaffolds+for+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling.</a> J Exp Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).</li>
<li>Sarkar, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wide-field+in+vivo+background+free+imaging+by+selective+magnetic+modulation+of+nanodiamond+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Wide-field in vivo background free imaging by selective magnetic modulation of nanodiamond fluorescence.</a> Biomed Opt Express. 5 (4), 1190-1202 (2014).</li>
</ol>

We hebben niets om te onthullen.

De sequentiële multiplexing, driftcorrectie, en uitlijningsprocedures in madSTORM maken het mogelijk om nauwkeurige, hoogmultiplexeerde visualisatie van heterogene structuren in cellen toe te staan. 10 Bovendien vermijdt madSTORM de beperkingen van multi-color STORM, zoals chromatische aberratie en suboptimale fotowisseling / emissie eigenschappen van niet-ver rode kleurstoffen 9 , 12 . Aangezien de elutiestap sterische interferentie sign...

Een verscheidenheid aan superresolutie microscopie technieken zijn ontwikkeld om de diffractie grens van lichtmicroscopie (~ 200 nm) te overwinnen. Onder deze is een categorie technieken genaamd single molecule localization microscopy (SMLM), waaronder foto-activering lokalisatie microscopie (PALM) en stochastische optische reconstructie microscopie (STORM). SMLM technieken delen in het gebruik van fluorophoren die kunnen worden omgeschakeld tussen aan (fluorescerende) en off (donker / foto-geschakeld) staten, waardoor sequentiële lokalisatie van fluorescentie uit enkele moleculen 1 , 2 , 3 . Door zijn compatibiliteit met commercieel verkrijgbare kleurstoffen en microscopen is direct STORM (dSTORM) uitgegroeid tot een algemeen aanvaarde SMLM techniek 4 . DSTORM kan routinematig ~ 10 nm lokalisatie precisie bereiken, gedefinieerd als de onzekerheid bij het berekenen van het middelpunt van een diffractieIon-beperkte puntverdeling functie (PSF). Ondanks de hoge nauwkeurigheid die is geschat met behulp van lokalisatiealgoritmen 5 , 6 , 7 , is de nauwkeurige bepaling van de werkelijke locatie van enkele moleculen gehinderd door een aantal problemen. Ten eerste, mechanische beweging van de microscoopfase tijdens beeldverwerving voegt aanzienlijke onzekerheid toe aan de nauwkeurigheid van lokalisatie. Aangezien SMLM beelden worden verkregen over duizenden time-lapse frames, kunnen nano-schaalbewegingen van de microscoopfase de precisie van de uiteindelijke superresolutiebeeld 8 aanzienlijk in gevaar brengen. Voor het compenseren van de stadiumbeweging tijdens de beeldverzameling wordt de stadiumdrift algemeen geraamd uit regressiegebaseerde montage van binnenste lokalisaties van de afbeelding zelf (kruiscorrelatie) of sequentiële lokalisaties van fiduciale markeringen (fiduciale correctie) 1 , 9 . HowevEr zijn deze methoden nodig voor het optimaliseren van meerdere parameters voor elke beeldstapel en kunnen niet rekening houden met stadiumbewegingen op korte tijdschalen zoals mechanische trillingen. Gouden nanodeeltjes en multicolor fluorescerende kralen zijn gebruikt als fiduciale markers in SMLM, maar ze zijn niet fotostabiel en resulteren in een aanzienlijk lagere precisie na drijfcorrectie dan de stikstofcentrale fluorescerende nano-diamanten (FND&#39;s) gebruikt In madSTORM 10 . Naast de diffractiegrens wordt de lichtmicroscopie verder beperkt door spectrale grenzen. Gelijktijdige visualisatie van meerdere doelen vereist fluorescerende probes met niet-overlappende spectrale profielen, waarbij de fluorescentie gebaseerde lichtmicroscopie in het algemeen beperkt wordt tot 6 kleuren en SMLM tot 2-3 kleuren 4 , 11 , 12 . Bovendien veroorzaakt niet-lineaire chromatische aberratie verkeerde aanpassing van veelkleurige beelden, wHiervoor zijn uitgebreide uitlijningsprocedures nodig met behulp van multi-colored fiducial markers 8 , 13 . Om deze grenzen te overwinnen hebben eerdere studies meerdere doelen getoond door gebruik te maken van herhalende photobleaching of chemische quenching van achtereenvolgens gebonden fluorophoren 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Hoewel deze methoden de spectrale grenzen van microscopie kunnen overwinnen, is fluorescentiebleken bekend dat het een toxisch proces 20 is , en langdurig bleken of blussen kunnen ongewenste neveneffecten veroorzaken, zoals verlies van verknoping. Bovendien kan de accumulatie van fluorescerende probes leiden tot sterische blokkering van bindingsplaatsen in het monster, het voorkomen van grootschalige multiplexing en robuuste targeting van epitopen. Om dergelijke sterische interferentie te vermijden, is een recente sTudy bereikt multiplexing met behulp van stochastische uitwisseling van vrij diffuus eiwitfragmenten 21 . Terwijl deze methode een dichte etikettering van cellulaire structuren mogelijk maakt, vereist het uitgebreide biochemische bereiding om peptidefragmenten te isoleren, geen enkele molecuulposities kan isoleren en niet gemakkelijk grootschalige multiplexing vergemakkelijken met gebruik van commercieel verkrijgbare probes. We presenteren een gedetailleerd videoprotocol dat de sequentiële binding en elutie van fluorescente antilichamen voor multiplexed, antilichaamgrootte beperkte dSTORM (madSTORM) imaging, en het gebruik van fluorescerende nano-diamanten om nauwkeurige drijfcorrectie en uitlijning te bereiken, beschrijft.

<table><tbody><tr><td>8 well coverslip chamber</td><td>Lab-tek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Poly-L-Lysine oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>NV-100 nm Fluorescerende Nano-diamant</td><td>Adamas</td><td>Red FND</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3&epsilon; antilichaam</td><td>BD Biosciences</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>Rund serum albumine, Fractie V</td><td>KSE Scientific</td><td>98-100P</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>10% Paraformaldehyde</td><td>EMS</td><td>15712</td><td>Carcinogeen</td></tr><tr><td>Gelatine uit verswatervishuid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647 antilichaamlabelingkit</td><td>Thermo Fisher</td><td>A20186</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138924</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154</td><td>Zeer giftig, luchtgevoelig</td></tr><tr><td>Cysteamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td>Zeer giftig</td></tr><tr><td>Cyclooctatetraeen 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138924</td><td>Zeer giftig, luchtgevoelig</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3210</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3385</td><td></td></tr></tbody></table>

zeer multiplexed, superresolutie imaging van t-cellen met behulp van madstorm

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogene cellulaire structuren met behulp van single molecule lokalisatie microscopie is gehinderd door onvoldoende lokalisatie precisie en multiplexing vermogen. Met behulp van fluorescerende nano-diamant fiduciale markers beschrijven we de drijfcorrectie- en uitlijningsprocedures die nodig zijn om hoge precisie te verkrijgen in single-molecule lokalisatiemicroscopie. Daarnaast wordt een nieuwe multiplexingstrategie, madSTORM, beschreven waarin meerdere molecules in dezelfde cel worden geteeld met behulp van sequentiële binding en elutie van fluorescerende antilichamen. MadSTORM wordt aangetoond op een geactiveerde T-cel om de locaties van verschillende componenten te visualiseren in een membraan gebonden, multi-eiwitstructuur genaamd de T-celreceptor microcluster. Daarnaast wordt de toepassing van madSTORM als een algemeen hulpmiddel voor het visualiseren van multi-eiwitstructuren besproken.

De sequentiële elutie- en kleurmethode werd gebruikt voor het produceren van het multiplexed madSTORM beeld van microclusters en andere structuren in een geactiveerde Jurkat T-cel ( Figuur 1 , controle-uitlijnen). Elk pseudo-gekleurd beeld vertegenwoordigt één ronde van madSTORM-beeldvorming, verkregen in stappen 1.1.1 tot 1.3.13. Zoals eerder beschreven 10 , moet het zichtveld worden gecontroleerd voor residueel signaal van eerdere, ...

We tonen een methode aan om meerdere molecuelen te identificeren binnen heterogene nano-structuren bij nauwkeurige molecuul nauwkeurigheid, met behulp van sequentiële binding en elutie van fluorescent gelabelde antilichamen.

Zeer Multiplexed, Superresolutie Imaging van T-cellen Met behulp van madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Het algemene doel van dit imaging-protocol is om meerdere eiwitten in een geactiveerde T-cel te visualiseren met behulp van single molecule localisation microscopy. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de T-celactivatie, zoals de distributie op single-molecule niveau van TC- of microclustercomponenten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een grotere multiplexing mogelijk maakt dan bereikt kan worden met huidige supervised solution microscopy-methoden.Begin met het direct conjugeren van antilichamen met Alexa 647-kleurstof, met behulp van de Alexa 647 antibody labeling kit, volgens het labelingsprotocol van de fabrikant. Centrifugeer de gelabelde antilichamen vijf minuten bij 20.800 ×g. Verzamel na centrifugatie het supernatant om de geaggregeerde antilichamen te verwijderen. Coat vervolgens A12 cover slip chambers gedurende 15 minuten met 250 µL 0,1% poly-l-lysine.Zuig vervolgens de oplossing af zonder te spoelen en droog de kamers 30 minuten lang bij 65 degree celsius. Bereid een verdunning van 100 nanometer fluorescerende nanodiamanten of FNDs voor in PBS; test verschillende verdunningen om er zeker van te zijn d

highly-multiplexed-super-resolution-imaging-of-t-cells-using-madstorm

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De compartimentering van eiwitten, hetzij binnen het plasma membraan of in de intracellulaire locaties is een regulerend mechanisme die sterk kunnen beïnvloeden signalering resultaten, vandaar dat te begrijpen signalering is het van belang het bestuderen van de ruimtelijke en temporele gedrag van de betrokken eiwitten. We beschrijven hier een TIRF microscopie gebaseerde systeem om signaaltransductie in T-cellen te bestuderen, maar is breed toepasbaar.

Een TIRF Microscopie Techniek voor Real-time, gelijktijdige beeldvorming van de TCR en de bijbehorende signaaleiwitten

We beschrijven de bereiding van drie monsters en hoe ze kunnen worden gebruikt voor het optimaliseren en de prestatie van microscopen STORM beoordelen. Met behulp van deze voorbeelden laten we zien hoe ruwe data te verwerven en vervolgens te verwerken tot super-resolutie beelden te verwerven in cellen van ongeveer 30-50 nm resolutie.

Test Monsters voor het optimaliseren van STORM superresolutietechnieken

Hoge-resolutie intravitale beeldvorming met verbeterd contrast tot 120 urn diepte lymfklieren van volwassen muizen wordt bereikt door ruimtelijk moduleren van de excitatie patroon van een multi-focale twee-foton microscoop. In 100 micrometer diepte gemeten we resoluties van 487 nm (lateraal) en 551 nm (axiaal), waardoor verstrooiing en diffractie grenzen omzeilen.

Hoogst vastbesloten Intravitale Striped-verlichting Microscopie van Germinal Centers

Om stromingssnelheden en directionaliteit van filamenteus-actine bij de T-cel immunologische synaps te onderzoeken, wordt live-cell superresolutie beeldvorming gecombineerd met totale interne reflectiefluorescentie en gekwantificeerd met behulp van ruimte-tijdelijke beeldcorrelatiespectroscopie.

Corticale actine Flow in T-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd Afbeelding Correlatie Spectroscopie van Structured Verlichting Microscopie Gegevens

Het algemene doel van deze methodiek is geven de optimale proefomstandigheden van monstervoorbereiding Beeldacquisitie en wederopbouw om uit te voeren van 2D dubbele dSTORM kleurenafbeeldingen van microtubuli en intermediaire filamenten in vaste...

Imaging Intermediaire filamenten en microtubuli met 2-dimensionale directe stochastische optische wederopbouw microscopie

Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe rooster Light-Sheet Microscopie te gebruiken om vierdimensionaal visualiseren oppervlakte receptor dynamiek in levende cellen. Hier worden T-celreceptoren op CD4+ primaire T-cellen weergegeven.

Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie

Dit protocol beelden zowel de immunologische Synapse vorming en de daaropvolgende gepolariseerde secretoire verkeer naar de immunologische Synapse. Celconjugaten werden gevormd tussen een superantigen-gepulseerde Raji-cel (optredend als een antigeen-presentercel) en een Jurkat-kloon (optredend als effector helper T lymfocyten).

Imaging van de humane immunologische SYNAPS

Chip-based superresolutie optische microscopie is een nieuwe benadering van fluorescentiemicroscopie en biedt voordelen in kosteneffectiviteit en doorvoer. Hier worden de protocollen voor chip voorbereiding en beeldvorming getoond voor TIRF microscopie en lokalisatie gebaseerde super-resolution microscopie.

High-throughput totale interne reflectie fluorescentie en directe stochastische optische reconstructie microscopie met behulp van een Photonic chip

Hier beschrijven we een eenvoudige en toegankelijke strategie voor het visualiseren, kwantificeren en in kaart brengen van immuuncellen in formaline-vaste paraffine-ingebedde tumorweefselsecties. Deze methodologie combineert bestaande beeldvormings- en digitale analysetechnieken met als doel de multiplexingcapaciteit en multiparameteranalyse van beeldvormingstesten uit te breiden.

Visualisatie, kwantificering en mapping van immuuncelpopulaties in de tumormicro-omgeving

Multiplexed barcoding beeldanalyse heeft onlangs de karakterisering van de tumormicro-omgeving verbeterd, waardoor uitgebreide studies van celsamenstelling, functionele toestand en cel-celinteracties mogelijk zijn. Hierin beschrijven we een kleurings- en beeldvormingsprotocol met behulp van de barcodering van oligonucleotide-geconjugeerde antilichamen en cyclusbeeldvorming, waardoor het gebruik van een hoogdimensionale beeldanalysetechniek mogelijk is.

Multiplexed Barcoding beeldanalyse voor immunoprofiling en ruimtelijke kartering in de eencellige analyse van paraffineweefselmonsters

Dit rapport beschrijft een geautomatiseerd protocol voor multiplex immunofluorescentie (mIF)-assays op een geautomatiseerde objectglaaskleuring. Het demonstreert de hoge reproduceerbaarheid van ruimtelijke proteomics op standaard high-throughput weefselautostainers en fluorescentiebeeldvormers met hele objectglaasjes, wat ideaal is voor aangepaste mIF-assays op een groot aantal weefselglaasjes in translationeel onderzoek.

High-throughput geautomatiseerde multiplex immunofluorescentietesten voor translationeel onderzoek

Leer zeer multiplexed superresolutiebeeldvorming van T-cellen met madSTORM. Deze methode maakt visualisatie van meerdere eiwitten mogelijk met hogere resolutie dan traditionele microscopie.

Zeer Multiplexed, Superresolutie Imaging van T-cellen Met behulp van madSTORM

Meer video's verkennen