Een Morfometrische en cellulaire analysemethode voor de lymfkliertest mandibulaire Condyle

Het algemene doel van dit experiment is om de effecten van compressiebelasting in het mandibulaire condylaire kraakbeen van muizen te observeren met behulp van morfometrische metingen in röntgenfoto's en histologische analyse. Deze metrieken kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de structurele en cellulaire veranderingen binnen de mandibulaire condyl van knaagdieren. Het belangrijkste voordeel van de hier getoonde techniek is dat deze kan worden gebruikt om andere kleine bot- of gewrichtsstructuren bij dieren te analyseren.

Zorg voor geïsoleerde, gedissecteerde kaken van muizen die klaar zijn voor gebruik voor dit protocol. Plaats de kaken in een röntgenkabinet op een Petrischaal. Maak vervolgens röntgenfoto's bij 26 kilovolt gedurende vijf seconden.

Open nu de afbeeldingen in de analyse-software om morfometrische metingen uit te voeren. Gebruik eerst de eenheidsknop om de schaalbalk in te stellen. Selecteer vervolgens zes anatomische punten met markerstijl 2.

Selecteer eerst de meest posterieure punten van het mandibulaire condylus als punt één. Selecteer vervolgens het incisura-proces voor punt twee. Selecteer daarna het diepste punt van de incisura mandibulae voor punt drie.

Select vervolgens het diepste punt in de holte van de ramus mandibulae, punt vier, en selecteer daarna het meest anterieure punt van het condylaire gewrichtsvlak, punt vijf. Selecteer nu het meest posterieure punt van het condylaire gewrichtsvlak als punt zes en ga verder met het uitvoeren van lengtemetingen met behulp van de lengte-tool. Gebruik vervolgens de tool voor loodrechte lijnen van punt drie naar vier om de lengte van de condylkop te meten, wat de lengte is van de loodlijn van punt één naar de lijn tussen de punten drie en vier.

Meet vervolgens de mandibulaire lengte, tussen punt één en twee. Meet tot slot de breedte van de condylkop, die zich tussen punt vijf en zes bevindt. Kopieer de meetlijst aan de rechterkant van het scherm om de gegevens op te slaan.

Voordat de gefixeerde, maar niet gedecalciëerde mandibels worden ingebed, moeten ze een nacht weken in 30 procent sucrose in PBS. Dissecteer de volgende dag alle overtollige zachte weefsels weg en snijd voorzichtig de mandibulaire condylus uit. Plaats de monsters vervolgens in plastic mallen, waarbij het mediale oppervlak van de condylus tegen de bodem van de mal rust en het monster parallel aan de onderkant van de mal ligt.

Dompel ze vervolgens onder in inbedhars en koel de hars af met een stuk droogijs. Vul de mallen daarna aan met meer inbedhars. Verplaats ze naar koud dimethylbutan, gekoeld door een vriezer of door droogijs.

Bewaar de monsters na het koelen bij -20 °C of -80 °C voor het maken van coupes. Om de expressie van Col10a1 in de MCC van sagittale coupes van de condylen te kwantificeren, opent u de histologische beelden in een softwarepakket voor beeldanalyse en selecteert u het gebied van interesse met de lasso-tool. In dit geval wordt het MCC-gebied geselecteerd.

Noteer het aantal pixels in het gebied, zoals vermeld in het histogramvak. Selecteer vervolgens de rode Col10a1-pixels door het kleurberik aan te passen. Gebruik het pipet-instrument om een rode pixel in de afbeelding te selecteren en klik op OK. Noteer daarna het aantal rode pixels in het gebied, zoals vermeld in het histogramvak.

Het fractie deel rode pixels in het gebied vertegenwoordigt de hoeveelheid Col10a1-expressie. Kwantificeer nu, met behulp van dezelfde basistechniek, de TRAP-activiteit in de MCC en het subchondrale bot. Selecteer eerst het kraakbeen in de subchondrale botregio's als de te analyseren gebieden en noteer het totaal aantal pixels.

Select vervolgens de gele pixels die door het ELF97-substraat zijn gegenereerd. Noteer het aantal positieve pixels en bereken de fractie TRAP-positieve pixels. Kwantificeer nu de EDU-positieve cellen die in het blauw zijn tegengekleurd met DEPI.

Select opnieuw het gebied van interesse en kwantificeer vervolgens de blauwe pixels daarin. Gebruik deze methode ook om het aantal EdU-positieve pixels in hetzelfde gebied te bepalen. Morfometrische metingen van muizen, die waren onderworpen aan compressieve TMJ-belasting, toonden aan dat de belasting de lengte van de onderkaak en de condylkop significant verhoogde.

Desalniettemin leidde belasting niet tot een significante verandering in de breedte van de condylus. Kwantificering van de collageenverdeling onthulde een significante toename in de expressie van Col10a1 en de MCC van de condyli bij de belaste dieren. Aan de andere kant was de expressie van Col2a1 niet veel anders dan bij de controlegroep.

De TRAP-activiteit nam toe in de subchondrale regio van de condylen en bij belaste muizen, evenals de sub-proliferatie. EDU-kleuring geeft het aantal prolifererende cellen aan. De proteoglycaanverdeling in de MCC werd gekwantificeerd door de met toluidineblauw gekleurde oppervlakte en de afstandskaart te evalueren.

Er was een significante toename in de afstandskaarting in de MCC van de condylen van de belaste groep. Het met proteoglycaan gekleurde gebied vertoonde echter geen statistisch significant verschil tussen de groepen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe de cellulaire en structurele veranderingen in de mandibulaire condylus van knaagdieren geanalyseerd moeten worden.