Aangepaste Terminal Restriction Fragment Analyse voor het kwantificeren van telomere lengte met behulp van in-gel hybridisatie

Het algemene doel van deze procedure is om de lengte van telomeren in eukaryotische cellen te bepalen met behulp van een aangepaste versie van een telomeerrestrictiefragmentanalyseprocedure, zoals beschreven door Doctors Jerry W.Shay, Woodring Wright en collega's. Door gegevens over de telomeerlengte te verstrekken, kan de procedure vragen beantwoorden over celbiologie, gedragsgeneeskunde, epidemiologie en infectieziekten, over de effecten van leeftijd, stress, medicamenteuze behandelingen en infecties. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een directe meting in kilobasen van de gemiddelde telomeerlengte in een verscheidenheid aan cellen biedt.

De genomische DNA-monsters die geanalyseerd moeten worden, werden uit cellen geëxtraheerd met behulp van een commercieel DNA-extractiekit zoals beschreven in het tekstprotocol. Voer de vertering van het genomische DNA uit in een eindvolume van 20 tot 40 microliter. Combineer het volgende in elke microcentrifugebuis: drie microgram genomisch DNA; 10x DNA verteringsbuffer; één microliter Rsa1 restrictie-enzym; één microliter Hinf1 restrictie-enzym; en steriel, gedeïoniseerd water tot het eindvolume.

Centrifugeer kort om ervoor te zorgen dat alle componenten op de bodem van de buis zijn. Incubeer de verteringen gedurende minimaal 16 uur bij 37 graden Celsius. Begin deze procedure door 0,6% agaroseoplossing te bereiden zoals beschreven in het tekstprotocol.

Bereid het gelelektroforesesysteem voor op gelgieten. Bevestig de eindpoorten aan de gelgietlade. Zodra de agarosegeloplossing is afgekoeld tot 50 graden Celsius, giet deze in de gelgietlade, plaats een kegel in de gel en laat de gel 45 minuten onbedekt op kamertemperatuur uitharden.

Verwijder de eindpoorten van de gietlade en verwijder de kam uit de gel. Vul het gelelektroforesesysteem met elektroforesepuffer tot de vullijn, waarbij u ervoor zorgt dat de gel volledig ondergedompeld is in de buffer. Laad de putjes van het gel met de DNA-monsters, waarbij u een lege put tussen de monsters laat.

Voeg 10 microliter van een DNA-ladder toe aan de putjes aan de tegenovergestelde uiteinden van het gel. Laat de gelelektroforese 30 minuten op 150 volt lopen om het DNA snel in het gel te bewegen. Na 30 minuten, zet de spanning op 57 volt en laat het 18 tot 24 uur lopen.

Nadat het gel 18 tot 24 uur heeft gelopen, zet de elektroforesebron uit en verwijder de gelgietlade met het gel uit de elektroforesebuffer. Snijd de bovenste rechterhoek van het gel af om als referentie te dienen voor de oriëntatie van het gel. Snijd een stuk filterpapier op een maat iets groter dan het gel.

Plaats het filterpapier op het gel in een gietlade en laat het papier het overtollige oplossing op het gel opzuigen. Verwijder voorzichtig de luchtbellen tussen het filterpapier en het gel, door een pipet als roller te gebruiken om de bubbels door de zijkanten uit te persen. Verwijder het gel uit de gietlade door het gel en het filterpapier om te draaien zodat het papier onder het gel komt te liggen.

Breng het gel met het filterpapier over naar een geldroger en bedek het gel met plasticfolie. Verwijder alle luchtbellen tussen de plasticfolie en het gel met behulp van een pipet als roller. Droog het gel gedurende twee uur bij 50 graden Celsius.

Zodra het gel is opgedroogd, verwijder de plasticfolie en breng het gel en het filterpapier over naar een glazen schaal met 250 milliliter gedeïoniseerd water. Verwijder voorzichtig het filterpapier en incubeer het gel 15 minuten op kamertemperatuur. Leg het gel op een 12 bij 12 inch nylon gaas.

Rol het nylon gaas en gel samen en zorg ervoor dat het gel niet in contact komt met zichzelf. Plaats het gaas en gel in een hybridisatiebuis. Combineer 100 milliliter 5x SSC en 12 microliter groen fluorescerende nucleïnezuurkleurstof en plaats in de hybridisatiebuis.

Incubeer gedurende 30 minuten bij 42 graden Celsius in een hybridisatieoven met rotatie. Bescherm de oplossing tegen licht. Verwijder na 30 minuten het nylon gaas en gel uit de hybridisatiebuis.

Rol open en plaats plat in een glazen schaal met 250 milliliter gedeïoniseerd water. Verwijder voorzichtig het nylon gaas. Maak een afbeelding van het gel met een fosforimager met de aangegeven instellingen.

Bereid de radioactieve telomeerprobe voor volgens de voorschriften van de faciliteit voor het omgaan met radioactiviteit. Combineer in de microcentrifugebuis het volgende: twee microliter telomeerprobe; 2,5 microliter 10x polynucleotidylkinasereactiebuffer; drie microliter ATP gelabeld op de gammafosfaatgroep met P32; vier microliter T4 polynucleotidylkinase; en DNase-vrij, steriel, gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 20 microliter. Centrifugeer de buis kort.

Incubeer de buis in een waterbad bij 37 graden Celsius gedurende een uur. Centrifugeer de buis kort en incubeer bij 65 graden Celsius gedurende 20 minuten om de reactie te stoppen. Laad de radioactieve probeoplossing in een voorbereide G25 chromatografiekolom en centrifugeer gedurende twee minuten bij 700 keer g.

Bewaar het filtraat, dat de radioactieve telomeerprobe bevat. Plaats het gel in een glazen schaal met 250 milliliter denaturerende oplossing en incubeer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Verwijder de denaturerende oplossing en vervang door 250 milliliter steriel, gedeïoniseerd water.

Incubeer gedurende 10 minuten op een orbitale schudder bij kamertemperatuur. Verwijder het gedeïoniseerd water. Vervang door 250 milliliter neutralisatieoplossing en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Rol het gel op in een nylon gaas en plaats het in de hybridisatiebuis. Voeg 20 milliliter van de hybridisatieoplossing toe en incubeer in een hybridisatieoven bij 42 graden Celsius gedurende 10 minuten met rotatie. Verwijder na 10 minuten de hybridisatieoplossing en vervang door 20 milliliter verse hybridisatieoplossing.

Voeg de volledige telomeerprobe toe en incubeer in een hybridisatieoven bij 42 graden Celsius met rotatie overnacht