Aangepaste Terminal Restriction Fragment Analyse voor het kwantificeren van telomere lengte met behulp van in-gel hybridisatie
July 10th, 2017
In dit artikel wordt een gedetailleerd protocol voor het kwantificeren van telomere lengte met behulp van een gewijzigde terminal restrictie fragment analyse besproken die snelle en efficiënte directe meting van telomere lengte biedt. Deze techniek kan toegepast worden op een verscheidenheid aan celbronnen van DNA voor het kwantificeren van telomere lengte.
Het algemene doel van deze procedure is om de lengte van telomeren in eukaryotische cellen te bepalen met behulp van een aangepaste versie van een telomeerrestrictiefragmentanalyseprocedure, zoals beschreven door Doctors Jerry W.Shay, Woodring Wright en collega's. Door gegevens over de telomeerlengte te verstrekken, kan de procedure vragen beantwoorden over celbiologie, gedragsgeneeskunde, epidemiologie en infectieziekten, over de effecten van leeftijd, stress, medicamenteuze behandelingen en infecties. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een directe meting in kilobasen van de gemiddelde telomeerlengte in een verscheidenheid aan cellen biedt.
De genomische DNA-monsters die geanalyseerd moeten worden, werden uit cellen geëxtraheerd met behulp van een commercieel DNA-extractiekit zoals beschreven in het tekstprotocol. Voer de vertering van het genomische DNA uit in een eindvolume van 20 tot 40 microliter. Combineer het volgende in elke microcentrifugebuis: drie microgram genomisch DNA; 10x DNA verteringsbuffer; één microliter Rsa1 restrictie-enzym; één microliter Hinf1 restrictie-enzym; en steriel, gedeïoniseerd water tot het eindvolume.
Centrifugeer kort om ervoor te zorgen dat alle componenten op de bodem van de buis zijn. Incubeer de verteringen gedurende minimaal 16 uur bij 37 graden Celsius. Begin deze procedure door 0,6% agaroseoplossing te bereiden zoals beschreven in het tekstprotocol.
Bereid het gelelektroforesesysteem voor op gelgieten. Bevestig de eindpoorten aan de gelgietlade. Zodra de agarosegeloplossing is afgekoeld tot 50 graden Celsius, giet deze in de gelgietlade, plaats een kegel in de gel en laat de gel 45 minuten onbedekt op kamertemperatuur uitharden.
Verwijder de eindpoorten van de gietlade en verwijder de kam uit de gel. Vul het gelelektroforesesysteem met elektroforesepuffer tot de vullijn, waarbij u ervoor zorgt dat de gel volledig ondergedompeld is in de buffer. Laad de putjes van het gel met de DNA-monsters, waarbij u een lege put tussen de monsters laat.
Voeg 10 microliter van een DNA-ladder toe aan de putjes aan de tegenovergestelde uiteinden van het gel. Laat de gelelektroforese 30 minuten op 150 volt lopen om het DNA snel in het gel te bewegen. Na 30 minuten, zet de spanning op 57 volt en laat het 18 tot 24 uur lopen.
Nadat het gel 18 tot 24 uur heeft gelopen, zet de elektroforesebron uit en verwijder de gelgietlade met het gel uit de elektroforesebuffer. Snijd de bovenste rechterhoek van het gel af om als referentie te dienen voor de oriëntatie van het gel. Snijd een stuk filterpapier op een maat iets groter dan het gel.
Plaats het filterpapier op het gel in een gietlade en laat het papier het overtollige oplossing op het gel opzuigen. Verwijder voorzichtig de luchtbellen tussen het filterpapier en het gel, door een pipet als roller te gebruiken om de bubbels door de zijkanten uit te persen. Verwijder het gel uit de gietlade door het gel en het filterpapier om te draaien zodat het papier onder het gel komt te liggen.
Breng het gel met het filterpapier over naar een geldroger en bedek het gel met plasticfolie. Verwijder alle luchtbellen tussen de plasticfolie en het gel met behulp van een pipet als roller. Droog het gel gedurende twee uur bij 50 graden Celsius.
Zodra het gel is opgedroogd, verwijder de plasticfolie en breng het gel en het filterpapier over naar een glazen schaal met 250 milliliter gedeïoniseerd water. Verwijder voorzichtig het filterpapier en incubeer het gel 15 minuten op kamertemperatuur. Leg het gel op een 12 bij 12 inch nylon gaas.
Rol het nylon gaas en gel samen en zorg ervoor dat het gel niet in contact komt met zichzelf. Plaats het gaas en gel in een hybridisatiebuis. Combineer 100 milliliter 5x SSC en 12 microliter groen fluorescerende nucleïnezuurkleurstof en plaats in de hybridisatiebuis.
Incubeer gedurende 30 minuten bij 42 graden Celsius in een hybridisatieoven met rotatie. Bescherm de oplossing tegen licht. Verwijder na 30 minuten het nylon gaas en gel uit de hybridisatiebuis.
Rol open en plaats plat in een glazen schaal met 250 milliliter gedeïoniseerd water. Verwijder voorzichtig het nylon gaas. Maak een afbeelding van het gel met een fosforimager met de aangegeven instellingen.
Bereid de radioactieve telomeerprobe voor volgens de voorschriften van de faciliteit voor het omgaan met radioactiviteit. Combineer in de microcentrifugebuis het volgende: twee microliter telomeerprobe; 2,5 microliter 10x polynucleotidylkinasereactiebuffer; drie microliter ATP gelabeld op de gammafosfaatgroep met P32; vier microliter T4 polynucleotidylkinase; en DNase-vrij, steriel, gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 20 microliter. Centrifugeer de buis kort.
Incubeer de buis in een waterbad bij 37 graden Celsius gedurende een uur. Centrifugeer de buis kort en incubeer bij 65 graden Celsius gedurende 20 minuten om de reactie te stoppen. Laad de radioactieve probeoplossing in een voorbereide G25 chromatografiekolom en centrifugeer gedurende twee minuten bij 700 keer g.
Bewaar het filtraat, dat de radioactieve telomeerprobe bevat. Plaats het gel in een glazen schaal met 250 milliliter denaturerende oplossing en incubeer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Verwijder de denaturerende oplossing en vervang door 250 milliliter steriel, gedeïoniseerd water.
Incubeer gedurende 10 minuten op een orbitale schudder bij kamertemperatuur. Verwijder het gedeïoniseerd water. Vervang door 250 milliliter neutralisatieoplossing en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
Rol het gel op in een nylon gaas en plaats het in de hybridisatiebuis. Voeg 20 milliliter van de hybridisatieoplossing toe en incubeer in een hybridisatieoven bij 42 graden Celsius gedurende 10 minuten met rotatie. Verwijder na 10 minuten de hybridisatieoplossing en vervang door 20 milliliter verse hybridisatieoplossing.
Voeg de volledige telomeerprobe toe en incubeer in een hybridisatieoven bij 42 graden Celsius met rotatie overnacht
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het kwantificeren van telomeerleiding met behulp van een gewijzigde terminale restrictiefragmentanalyse. De methode maakt snelle en efficiënte directe meting van telomeerleiding mogelijk in verschillende celtypen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Genetica
- Gedragsgeneeskunde
Achtergrond
- Telomeren zijn cruciaal voor de stabiliteit van chromosomen.
- Inzicht in telomeerleiding kan inzichten bieden in veroudering en ziekte.
- Het protocol is gebaseerd op gevestigde methoden van toonaangevende onderzoekers.
- Het kan worden toegepast op verschillende bronnen van genomisch DNA.
Doel van het onderzoek
- Telomeerleiding meten in eukaryote cellen.
- De effecten van verschillende factoren zoals leeftijd en stress op telomeerleiding onderzoeken.
- Een betrouwbare methode bieden voor onderzoekers in aanverwante vakgebieden.
Gebruikte methoden
- Extractie van genomisch DNA uit cellen met behulp van een commercieel kit.
- Vertering van DNA met specifieke restrictie-enzymen.
- Meting van telomeerleiding in kilobasen.
- Toepassing van de methode op verschillende celtypen.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol levert directe metingen van telomeerleiding.
- Resultaten kunnen studies in epidemiologie en infectieziekten informeren.
- De verkregen gegevens kunnen helpen bij het begrijpen van de impact van medicamenteuze behandelingen.
- Bevindingen dragen bij aan de bredere kennis van celbiologie.
Conclusies
- De gewijzigde analyse biedt een robuuste methode voor telomeerleidingmeting.
- Het verbetert het begrip van telomeerdynamiek in verschillende biologische contexten.
- De techniek is toepasbaar in een breed scala aan onderzoeksgebieden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative telomere length measurement is critical for de-risking early discovery programs focused on cellular aging, genome stability, and stress response. The modified terminal restriction fragment (TRF) analysis with in-gel hybridization provides direct, absolute kilobase readouts, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. This capability enables robust portfolio triage and informs translational continuity across diverse cell models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Direct kilobase quantification of telomere length enables functional interrogation of aging and genome maintenance pathways.
- Supports biological de-risking by providing mechanistic evidence for target engagement and pathway modulation.
- Facilitates predictive confidence in early-stage target validation and prioritization decisions.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, quantitative telomere length assays for downstream compound screening workflows.
- Enables reproducible measurement across cell types, supporting assay standardization and platform scalability.
- Provides robust quantitative outputs for reliable compound evaluation and comparative analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns telomere length as a translational biomarker for disease-relevant models and preclinical studies.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by enabling direct measurement in primary and immortalized cells.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative biomarker data.
Pipeline & Workflow Integration
This modified TRF analysis integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing, assay development, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Provides direct evidence for telomere dynamics in response to genetic or pharmacological perturbations.
- Screening: Delivers standardized, quantitative telomere length outputs suitable for high-confidence screening campaigns.
- Analytics: Generates reproducible, absolute measurements for cross-condition and cross-sample comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by supporting biomarker-driven model selection.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, validated workflow for telomere quantification across multiple programs and cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in telomere biology studies.
- Operational Value: Standardizes telomere measurement, improving reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing robust biomarker data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of programs targeting genome stability and aging pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology and safe handling of radioisotopes.
- Needs access to gel electrophoresis, hybridization ovens, and phosphorimaging infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for sample preparation and quantification.
- Adaptable to various eukaryotic cell models with appropriate DNA input and assay controls.
- Signal intensity and background correction are critical for reliable quantification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
Genomic DNA Digestion
1:39
Genomic DNA Gel Electrophoresis
2:56
Gel Fluorescent Imaging and Hybridization
5:17
Hybridization with Telomere Probe
7:36
Gel Washing, Phospher Screen Exposure, and Radio Imaging
9:08
Results: Telomere Length is Quantified by a Modefied Terminal Restriction Fragment Analysis
10:28
Conclusion
