Detectie van residuele Donor Erythroid voorlopercellen na hematopoietische stamceltransplantatie voor patiënten met Hemoglobinopathieën

Het algemene doel van deze procedure is het monitoren van chimerisme in de context van stamceltransplantatie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het transplantatieveld, zoals de ingestappelijkheid van de hematopoëtische stamceltransplantatie bij patiënten met hemoglobinopathieën. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het flowcytometrie-gebaseerde cel sortering, een kolom-informatie-assay en een daaropvolgende analyse van short tandem repeats combineert om de proliferatie en differentiatie van progenitoren in het erytroïde compartiment te beoordelen.

De implicaties van deze techniek reiken verder dan de therapie bij afstoting van een transplantaat, omdat het kan helpen bij het identificeren van patiënten die vatbaar zijn voor een terugval van de ziekte en bij het initiëren van daaropvolgende immunomodulerende strategieën. Bovendien kan het worden toegepast in toekomstige klinische studies, stamcelonderzoek en het ontwerp van klinische trials voor huidtherapie. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien het proces moeilijk aan te leren is en moet worden uitgevoerd door getraind personeel.

Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Elisabeth Hoflehner, een technicus in mijn laboratorium. Begin met het maken van een enkelcel-suspensie van het beenmergmonster voor vetkleuring. Plaats hiervoor een celzeef met het beenmerg en schroef deze op een centrifugebuis.

Gebruik de zuiger van de spuit om stukjes weefsel door het gaas te drukken. Om al het materiaal op te vangen, spoelt u met enkele milliliters suspensiebuffer. Voeg drie milliliters gradiëntmedium toe aan een centrifugebuis en breng de enkelcel-suspensie er voorzichtig in laagjes op aan.

Centrifugeer de buis bij 550 G bij 20 °C gedurende 30 minuten, met de acceleratie ingesteld op negen en de deceleratie op nul. Verwijder de bovenste laag met plasma en bloedplaatjes met de pipet, waarbij u ervoor zorgt dat de laag mononucleaire cellen op de interface ongestoord blijft. Overbreng deze laag mononucleaire cellen naar een centrifugeerbuis.

Was vervolgens de cellen met 10 milliliters suspensiebuffer. Centrifugeer de buis bij 250 G bij vier degree celsius gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in twee milliliters compleet isokov's modified dulbecco's medium door middel van pipetteren.

Om de celconcentratie met een hemocytometer te bepalen, plaatst u 95 µL 2% trypaanblauw-kleuring in een 96-wellplaat. Voeg vijf µL celconcentratie toe, meng goed en incubeer gedurende een korte tijd bij kamertemperatuur. Vul de hemocytometer en observeer deze onder een microscoop.

Tel alleen de gekleurde levensvatbare cellen. Centrifugeer daarna de celsuspensie bij 250 G bij 25 °C gedurende 10 minuten. Gebruik om de FC-receptor te blokkeren 2,5 µg blok per 100 µL.

Incubeer 10 tot 15 minuten op ijs. Voeg de combinatie van vooraf getitreerde monoclonale antilichamen toe die geschikt is voor het gebruikte volume om de cellen te kleuren. Incubeer 20 minuten in het donker bij vier graden celsius.

Was de cellen met drie milliliter kleuringsbuffer en centrifugeer deze vervolgens. Nadat de celconcentratie is aangepast, wordt de celsuspensie overgebracht naar een standaard flowcytometriebuisje door deze via een 70 microliter cell strainer te pipetteren om aggregaten te verwijderen. Stel vervolgens de celsorter en de software in en optimaliseer deze volgens de instructies van de fabrikant.

Stel een template in met een bivariate plot om de forward scatter (FSC) en side scatter (SSC) weer te geven. Om de celpopulatie van interesse op schaal te plaatsen, worden de cellen door de sorter geleid en worden FSC en SSC aangepast. Begin met het vastleggen van de gegevens voor de buis met de negatieve controle, leg daarna de gegevens voor elke buis met compensatiecontrole voor enkelvoudige kleuring vast en bereken de compensatie.

Daarna worden de experimentele monsters op een bivariant FSC, SSC-stippendiagram weergegeven om zowel lymfocyten als myeloïde cellen op te nemen. Door de verschillende FSC-signalen te vergelijken, worden dubletten en aggregaten uitgesloten. Visualiseer vervolgens de enkelvoudige cellen die CD45 en CD36 tot expressie brengen op een bivariant stippendiagram.

CD45-positieve events vertegenwoordigen leukocyten en hun progenitoren. CD45-negatieve en CD36-positieve events vertegenwoordigen erythroïde progenitoren. Om CD36-positieve en CD45-positieve cellen te definiëren, gebruikt u gating-tools en visualiseert u vervolgens de CD45-positieve events en een andere dot plot waarin de CD34- en SSC-parameters worden weergegeven.

Gebruik vervolgens gating-tools om de CD34-positieve cellen of leukocytprogenitoren en de SSC-high cellen of myeloïde cellen in verschillende differentiatiestadia te definiëren. Selecteer daarna de gates voor sortering in externe opvangbuisjes. Ga tot slot verder met de cel sortering bij four degree celsius tot het gewenste aantal cellen is verkregen.

Verdun de cellen door compleet IMDM-medium toe te voegen, aangevuld met humaan recombinant erytropoëtine of EPO. Overbreng 300 µL van de verdunde cellen naar drie mL H4434-medium en incubeer dit gedurende vijf minuten onder schudden bij kamertemperatuur. Plaats vervolgens één mL cel-suspensie in elk van de drie 35 mm petrischalen.

Plaats twee van de kweekschalen samen met een derde schaal gevuld met water in een plaat van 100 millimeter. Kweek deze cellen in een bevochtigde incubator bij 37 degree celsius, met 5%carbon dioxide gedurende 14 dagen. Gebruik een geïnverteerde microscoop bij een 40x vergroting en de kweekschaal gemarkeerd met een score-raster om de koloniën te scoren op basis van hun morfologie.

Classificeer de colony forming units of CFU's in multipotente progenitorcellen, granulocyten-monocyten-progenitorcellen, burst forming unit erythroïde cellen en colony forming unit erythroïde cellen. Begin hiermee door de cellen uit de fax of de CFU-assayplaat te herstellen volgens het tekstprotocol en ga vervolgens over tot DNA-extractie. Gebruik na het centrifugeren van de cellen een geautomatiseerd instrument voor bloed-DNA-isolatie om nucleïnezuren uit de pellet te isoleren.

Meet de DNA-concentratie met behulp van een fluorometer. Bereid de monsters voor volgens de instructies van de fabrikant en plaats het monster vervolgens in de monsterkamer van de fluorometer. Voeg verdund DNA toe aan een mengsel van DNA-polymerase, de primer-set en het reactiemengsel om een PCR-reactie op te zetten volgens de handleiding.

Voeg pre-transplantatie-DNA van donor en ontvanger toe, evenals nucleasevrij water als negatieve controle, waarbij 9947A dient als positieve controle. Voeg voor de analyse van de PCR-resultaten 10 µL gedenatureerde DNA-monsters toe aan de wells van een reactieplaat met 96 wells. Seal de plaat, centrifugeer kort en plaats de plaat op ijs.

Megakaryocyt-erythroïde progenitoren werden gesorteerd als een populatie die positief is voor CD36 en negatief voor het CD45-antigeen. Daarnaast werden CD45-positieve en CD34-positieve cellen geïdentificeerd als lymfoïde myeloïde precursoren, en CD45-positieve cellen met een hoog SSC-signaal als mature myeloïde cellen. De zuiverheid van de erythroïde progenitorcellen na sortering was meer dan 85% en de zuiverheid van de myeloïde cellen was meer dan 95%. Beenmergcellen die waren gescheiden met CD34-specifieke magnetische beads werden gedurende 14 dagen gekweekt.

Sommige van deze cellen lijken te prolifereren, te differentiëren en koloniën te vormen. Stimulatie met verschillende concentraties EPO verhoogde de vorming van opvallend rode erytroïde koloniën. PCR-analyse van short tandem repeats of STR's die specifiek zijn voor recipiënt- en donor-DNA kan chimerisme in cellen detecteren.

Met deze methode is de hoeveelheid recipient- versus donor-DNA succesvol bepaald in cellen verkregen uit de celsortering van beenmergcellen, alsook in cellen verkregen uit de clonogene assay. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in vier uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat deze techniek gestandaardiseerd moet worden en moet worden uitgevoerd door adequaat getraind personeel.

Na deze procedure kunnen residuele donor-afgeleide erytroïde progenitorcellen verder worden geanalyseerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het selectieve voordeel voor genetisch gecorrigeerde erytroïde stamcellen. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van stamceltransplantatie om de proliferatie en differentiatie van progenitoren in het erytroïde compartiment te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe de engraftment na stamceltransplantatie bij patiënten met hemoglobinopathieën kan worden gemonitord.