Herprogrammering van de primaire vruchtwater en membraan cellen pluripotent in Xeno-vrij voorwaarden
27 november 2017
Dit protocol beschrijft de herprogrammering van de primaire vruchtwater vloeistof en membraan mesenchymale stamcellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen met gebruikmaking van een niet-integratie van episomal in volledig chemisch gedefinieerde voorwaarden. Procedures van extractie, cultuur, herprogrammering en karakterisering van de resulterende geïnduceerde pluripotente stamcellen door strenge methoden zijn gedetailleerd.
Het algemene doel van deze procedure is om efficiënt geïnduceerde pluripotente stamcellen af te leiden door middel van episomale herprogrammering van twee verschillende soorten foetale stamcellen. Deze methode kan helpen om een bron van pluripotente stamcellen te leveren voor weefsel engineering, ziektemodellering, fundamenteel onderzoek of longitudinale studies. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de herprogrammering en de rijping van iPSC's plaatsvinden in chemisch gedefinieerde omstandigheden, terwijl ze vroeg beschikbaar zijn voor mogelijke pediatrische celtherapieën.
Deze procedure wordt gedemonstreerd door Steven McClellan, de hoofdonderzoeker, en mijzelf. Verkrijg placenta's zo snel mogelijk na de geboorte. Snijd een segment van negen vierkante centimeter van het amnion af en was het in een centrifugebuis van 50 milliliter met 30 milliliter PBS aangevuld met antibioticum, antimycotische oplossing.
Verwijder bloedstolsels uit de membranen en gebruik vervolgens een paar fijne scalpels om de membranen in een steriele 10-centimeter weefselkweekschaal in fijne stukjes te snijden. Gebruik de scalpelbladen om de gehakte membraanweefselmassa over te brengen naar een weefseldissociatiebuis met 4,7 milliliter RPMI-1640-medium. Meng in de dissociatie-enzymen.
Monteer de buis op de weefseldissociator en voer programma h_tumor_01 uit. Incubeer vervolgens de buis gedurende 30 minuten op een schuddende platform op 37 graden Celsius. Verdun de suspensie verder met 35 milliliter RPMI-1640 en breng aan op een 70-micron zeef geplaatst boven een centrifugebuis van 50 milliliter.
Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 200 keer g bij kamertemperatuur. Na het weggegooien van het supernatant, resuspendeer de pellet in vijf milliliter RPMI-1640 en tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Zaai de cellen in celclusters met een dichtheid van ongeveer 10.000 cellen per vierkante centimeter in weefselkweekflacons met vers bereid AFMC-medium aangevuld met antibioticum, antimycotische oplossing.
Oogst laagpassagenummer amnionvocht en membraan stamcellen voor herprogrammering uit één T75-fles door twee milliliter celafscheidingsenzym toe te voegen aan de cellagen. Incubeer gedurende vijf tot acht minuten op 37 graden Celsius. Na centrifugatie bij 200 keer g gedurende 45 minuten, resuspendeer de pellet in één milliliter PBS en meng goed om serumcomponenten weg te wassen.
Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Pas vervolgens de celdichtheid aan tot 100.000 cellen per milliliter PBS en verdeel in vier 1,5-milliliter microcentrifugebuisjes. Plaats de microcentrifugebuisjes in vijf-milliliter polystyreenbuisjes om centrifugatie in een reguliere slinger te kunnen uitvoeren en centrifugeer gedurende vier minuten bij 200 keer g bij kamertemperatuur.
Na het centrifugeren, keer de buisjes om en gooi het supernatant in een afvalcontainer weg en voer vervolgens een extra centrifugatiestap uit bij 200 keer g gedurende drie minuten. Na het centrifugeren, gebruik een 200-microliter pipette om voorzichtig de resterende vloeistof uit de buisjes te zuigen. Plaats de transfectietips, buis, resuspensiebuffer en elektrolytische buffer in de weefselkweekkast.
Breng het transfectieapparaat dichtbij zodat de buisstation direct in de kast kan worden geplaatst. Vul één transfectiebuis met drie milliliter elektrolytische buffer en monteer de buis in de station door deze helemaal in de gleuf te duwen. Haal eerder bereide aliquoten van reprogrammeringsplasmidoplossing uit de opslag op min 80 graden Celsius en laat ze op kamertemperatuur in de kweekkast ontdooien.
Stel de transfectieparameters op het apparaat in om één puls van 40 milliseconden bij 950 volt af te geven. Resuspendeer de pellet met 100.000 cellen in 10 microliter resuspensiebuffer. Voeg snel 1/10 van de reprogrammeringsplasmidoplossing toe aan de resuspendeerde cellen.
Monteer de transfectietip op de transfectiepipet. Zuig vervolgens de celsuspensie voorzichtig in de transfectietip zonder luchtbellen te vormen. Breng de transfectiepipet in de transfectiebuis.
En druk op de startknop op het scherm van het transfectieapparaat. Wacht tot het schermbericht over het succes van de transfectie. Verwijder vervolgens onmiddellijk de pipet uit de buis.
Spuit de suspensie in één putje van de doelzes-putjesplaat. Meng met het medium van een naburige put en verdeel de suspensie gelijkmatig in beide putten. Herhaal de transfectie voor elke microcentrifugebuis met cellen.
Begin met het toevoegen van 30 microliter 0,5 millimolair EDTA en PBS aan vijf PCR-buisjes. Laad vervolgens een tip op een 10-microliterpipet ingesteld op twee microliter. Houd de pipettetip onder een hoek bij de kolonie rand en schraap voorzichtig en geleidelijk de hele kolonie van het oppervlak.
Zuig onmiddellijk de hele kolonie in de pipettetip en breng het over in één van de voorbereide PCR-buisjes met EDTA. Na het herhalen van het proces met vier andere koloniën, incubeer gedurende vier tot zes minuten op kamertemperatuur. Gebruik een grotere pipettetip om elke celsuspensie voorzichtig op en neer te pipetten om de kolonie in kleinere klonters te breken.
Vermijd het creëren van een enkele celsuspensie. Plateer vervolgens de suspensie direct in de doelput van een recombinant vitronectin-gecoate 24-putjesplaat. Na het herhalen van het proces voor de resterende koloniën, incubeer gedurende drie tot zes dagen.
Na vier tot zes dagen, wanneer de koloniën zijn gegroeid en compact zijn geworden, was de cellagen met 300 microliter 0,5 millimolair EDTA en aspibeer onmiddellijk. Voeg vervolgens nog eens 300 microliter toe en incubeer gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Na het aspibren van het EDTA, stel een pipet van één milliliter op capaciteit in, monteer op één milliliter breed-boorgespuit en zuig E8-medium op van de doelput van een vitronectin-gecoate zes-putjesplaat.
Spuit een straal van het medium in één putje van de bronplaat om de iPSC-cultuur af te wassen. Breng vervolgens de suspensie over in de doelput en
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de efficiënte afleiding van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) uit foetale stamcellen met behulp van een niet-integrerende episomale aanpak. Het proces vindt plaats in volledig chemisch gedefinieerde omstandigheden, waardoor het geschikt is voor verschillende toepassingen in onderzoek en therapie.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Stamcellenbiologie
- Regeneratieve geneeskunde
- Weefselengineering
Achtergrond
- Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) zijn waardevol voor onderzoeks- en therapeutische doeleinden.
- De methode maakt herprogrammering mogelijk zonder te integreren in het gastheergenoom.
- Het gebruik van foetale stamcellen kan de efficiëntie van iPSC-generatie verbeteren.
- Deze aanpak is bijzonder relevant voor pediatrische toepassingen.
Doel van het onderzoek
- Om iPSC's af te leiden van primaire vruchtwater en membraan mesenchymale stamcellen.
- Om een betrouwbare bron van pluripotente stamcellen te bieden voor verschillende toepassingen.
- Om de haalbaarheid van de methode in een gecontroleerde omgeving aan te tonen.
Gebruikte methoden
- Extractie van vruchtwater en membraan mesenchymale stamcellen.
- Kweek van de geëxtraheerde cellen in gedefinieerde omstandigheden.
- Herprogrammering van cellen met behulp van een niet-integrerende episomale methode.
- Karakterisering van de resulterende iPSC's door middel van strenge methoden.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle herprogrammering van foetale stamcellen tot iPSC's.
- Demonstratie van de efficiëntie van de methode in een laboratoriumomgeving.
- Karakterisering bevestigde de pluripotentie van de afgeleide iPSC's.
- Mogelijke toepassingen in weefselengineering en ziektemodellering.
Conclusies
- De episomale herprogrammeringsmethode is effectief voor het genereren van iPSC's.
- Deze aanpak kan doorbraken in regeneratieve geneeskunde vergemakkelijken.
- Verdere studies kunnen het therapeutische potentieel van deze iPSC's onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Reprogramming primary amniotic fluid and membrane cells to pluripotency under xeno-free, chemically defined conditions advances the reliability and scalability of iPSC generation for biopharma R&D. This approach enables early-stage access to pluripotent lines for tissue engineering, disease modeling, and pediatric cell therapy research, while supporting portfolio strategies that require standardized, animal-free workflows. The method's rigorous characterization pipeline enhances predictive confidence and reduces biological risk at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of developmental pathways using patient-relevant pluripotent cells.
- Supports biological de-risking by providing well-characterized, non-integrating iPSC lines.
- Facilitates predictive confidence in target validation through stringent pluripotency assessment.
Screening & Assay Development
- Provides a renewable source of standardized pluripotent cells for downstream differentiation protocols.
- Enables assay reproducibility and quantitative readouts via defined culture and marker validation.
- Supports scalable screening platforms by eliminating animal-derived components.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling derivation of disease-relevant cell types.
- Ensures continuity from discovery to preclinical validation through robust iPSC characterization.
- Reduces reliance on animal testing by leveraging bioinformatic pluripotency assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This xeno-free iPSC derivation method integrates from early discovery through preclinical research, supporting lead identification and translational studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification using pluripotent lines derived from fetal sources.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Employs flow cytometry, confocal imaging, and transcriptional profiling for rigorous line validation.
- Translational Research: Enables preclinical modeling and tissue engineering with clinically relevant, animal-free iPSC lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized workflow for pluripotent cell generation across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage research.
- Operational Value: Standardizes iPSC generation with scalable, xeno-free protocols and robust quality controls.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by minimizing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of cell-based therapy and disease modeling programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, reprogramming, and pluripotency assessment.
- Demands access to defined media, recombinant substrates, and advanced analytical instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- May require adaptation for different fetal or patient-derived cell sources.
- Strict biosafety protocols are essential when handling untested human tissues.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Isolation of Primary Mesenchymal Stem Cells from Human Amnion
2:31
Harvesting Cultured Amniotic Fluid Stem Cells and Amniotic Membrane Stem Cells
3:47
Transfection with Reprogramming Plasmids
5:35
Picking Fully Reprogrammed Colonies for Clonial Expansion
6:43
Clonal Expansion and Maturation of iPSCs
7:47
Results: Morphological Progression of Cells During Reprogramming
8:43
Conclusion
