Toepassing van geautomatiseerde beeldgeleide patchclamp voor de studie van neuronen in hersenschijven
July 31st, 2017
Dit protocol beschrijft hoe u automatische beeldgeleide patch-clamp experimenten kunt uitvoeren met behulp van een systeem dat onlangs is ontwikkeld voor standaard in vitro elektrofysiologie apparatuur.
Het algemene doel van deze technologie is om computervisie te gebruiken om fluorescerende cellen automatisch te detecteren en geautomatiseerde patch clamp van deze cellen uit te voeren in acute herfsneden. Deze methode kan helpen om belangrijke moeilijkheden in het gebied van patch clamp elektrofysiologie te overwinnen, zoals identificatie, targeting en patch clamp van fluorescerend gelabelde cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het automatisch patch pipets, fluorescerende cellen kan detecteren en de stappen kan integreren met automatische patch clamp.
Deze innovatie verhoogt de experimentele doorvoer aanzienlijk. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar therapie of diagnose van neurologische aandoeningen, omdat hoge doorvoer beeldgestuurde automatische patch clamp kan worden gebruikt voor farmacologische screenings in meer fysiologische neuronale preparaten. Deze methode kan ook worden toegepast op andere in vitro preparaten, zoals neuronaal organel typisch, of slice culturen, gedissocieerde neuronen en alle andere niet-neuronale cellen.
Om deze procedure te beginnen, zet u de versterker, microscoopcontroller en de manipulatorcontroller aan. Voer vervolgens Autopatcher IG met python uit vanuit een opdrachtregelterminal door eerst de map te wijzigen waarin Autopatcher IG is geïnstalleerd. Typ vervolgens Python Autopatcher_IG.
PYW in de opdrachtregelterminal en druk op de enter-toets. Vul daarna alle glazen pipet met interne oplossing en laad deze op de hoofdtrap. Beweeg de pipettip naar het microscoopbeeldveld en breng deze in focus.
Als de numerieke toetsen gebruikt worden om de manipulatoren in de microscooptrap te verplaatsen, werkt u de coördinaten bij door op Z op het toetsenbord te drukken. De primaire calibratie zet de hoek en de afstand van de beweging door de manipulator om in het microscoopcoördinatenstelsel. De manipulator beweegt in drie richtingen met vooraf ingestelde afstand en de software detecteert de coördinaten van de pipettip binnen het microscoopbeeldveld.
Klik op de start calibratie knop op de hoofd GUI voor de bijbehorende eenheid waarop de pipet is geladen. Sla vervolgens de calibratie op door te klikken op save calibratie onderaan de hoofd GUI. Deze primaire calibratie hoeft alleen eenmaal uitgevoerd te worden, tenzij de fysieke organisatie van de rig wordt gewijzigd.
Plaats in deze stap een herfsnede in het midden van de opnamekamer. Stabiliseer de herfsnede met een slice hold down of een harp. Om de fluorescerende cel te detecteren, zoekt u het gebied van belang onder de viervoudige vergroting.
Beweeg vervolgens de microscooptrap door de modus klik om te bewegen in te schakelen en klik op het midden van het gebied van belang. Gebruik alternatief de toetsen om de microscooptrap te verplaatsen. Schakel vervolgens naar de hoge vergrotingslens en pas de focus aan door de microscoop in de Z-as te bewegen met behulp van RF op de toetsen.
De software stuurt de microscoop en de camera om een reeks beelden op verschillende diepten te maken. Vervolgens worden deze beelden onderworpen aan computervisie verwerking om fluorescerend gelabelde cellen te vinden. Het uiteindelijke resultaat is een lijst van gedetecteerde celcoördinaten.
Klik op de cel detecteer knop op de hoofd GUI kolom eenheid nul. Als de LED of laserlichtbron van de setup niet kan worden bediend door het TTL signaal, schakel dan handmatig de LED of laser in. Schakel de LED of laser uit indien nodig.
Er verschijnt een lijst met celcoördinaten in de memory posities GUI. Verwijder ongewenste cellen uit de lijst door op de X knop naast de coördinaten te klikken. Als doelcellen niet fluorescerend gelabeld zijn, klikt u op muis modus op de hoofd GUI.
Klik vervolgens op de cel van belang, er verschijnt een gele stip met een nummer op de cel en de coördinaten van de cel verschijnen in de memory posities GUI. Om secundaire calibratie uit te voeren om de pipet offset coördinaten te detecteren, vult u 1/3 van een glazen pipet met interne oplossing. Laad vervolgens de pipet op de pipet houder die aan de hoofdtrap is bevestigd.
Gebruik bij lage vergroting één en twee op de toetsen om te schakelen tussen eenheid één en eenheid twee. Breng de pipet in het beeldveld en pas de focus aan met behulp van de toetsen. Laad vervolgens de primaire calibratie in door op load calibratie te klikken.
Schakel de microscooplens naar hoge vergroting en klik 40 keer op de hoofd GUI. Breng de pipettip naar het centrum. Klik vervolgens op de secundaire calibratie knop op de hoofd GUI, onder de eenheid die in gebruik is.
Om een doelcel te patchen, klikt u op de patch control knop om de patch control GUI te openen. Klik op de naar knop naast de cel van belang op de coördinatenlijst in de memory positie GUI. Klik vervolgens op de CTM knop van de eenheid in de hoofd GUI om beweging mogelijk te maken.
Klik op de cel van belang om de pipettip naar de cel te bewegen. Vanwege de mechanische beperking van de manipulator, wanneer er langer dan 500 micrometer wordt gereisd, kan er een lichte positioneringsfout optreden. Om een grote mechanische positioneringsfout te voorkomen, moet secundaire calibratie worden uitgevoerd in de buurt van de doelcel.
Gebruik vervolgens de eenheid één geselecteerde knop om het inputsignaal tussen de twee eenheden te schakelen. Klik op de patch knop op de patch control GUI. Automatisch patchen begint en de druk en weerstand kunnen worden bewaakt op de patch control GUI.
Het automatische patching algoritme bewaakt de weerstand en controleert de druk door een reeks logica lussen, om een gigaseal te vormen. Een pop-up venster meldt de vorming van een gigaseal. Het systeem maakt gebruik van weerstandsverandering om cel-oppervlakte contact te herkennen.
In het geval dat het cel-oppervlakte contact niet tijdig wordt gedetecteerd, gebruikt u de volgende knop om het patchstadium te laten voortschrijden terwijl u in dezelfde automatische patchbeproeving blijft. Bedien het automatische proces op elk gewenst moment door te klikken op de respectieve knoppen op de patch control GUI. Selecteer vervolgens ja om in te breken met gecombineerde Zap en zuiging.
Selecteer alternatief nee om in te breken met alleen zuiging. Bewaar vervolgens het experiment patch log. Deze figuur toont de geselecteerde loca
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het uitvoeren van automatische, beeldgestuurde patch-clamp experimenten met behulp van geavanceerde computervisietechnologie. Deze aanpak verbetert de efficiëntie van het identificeren en targeten van fluorescentie-gelabelde cellen in acute herfsnedes.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Elektrofysiologie
- Neurowetenschap
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Patch-clamp elektrofysiologie is cruciaal voor het bestuderen van neuronale activiteit.
- Het identificeren en targeten van specifieke cellen kan een uitdaging zijn.
- Geautomatiseerde technieken kunnen de experimentele doorvoer verbeteren.
- Fluorescentielabeling helpt bij de identificatie van cellen.
Doel van de studie
- Om de detectie van fluorescente cellen voor patch-clamp experimenten te automatiseren.
- Om de efficiëntie van elektrofysiologische opnames te verhogen.
- Om farmacologische screenings in neuronale preparaten te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Computervisietechnologie voor celdetectie.
- Geautomatiseerd patch-clamp opstel voor opname.
- Integratie van detectie- en opnameprocessen.
- Toepassing op verschillende in vitro neuronale preparaten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle automatisering van celidentificatie en patch-clamping.
- Verhoogde doorvoer voor elektrofysiologische experimenten.
- Potentiële toepassingen in farmacologisch onderzoek.
- Veelzijdigheid in toepassing op verschillende celtypen.
Conclusies
- Deze techniek verbetert de experimentele efficiëntie aanzienlijk.
- Het lost sleuteluitdagingen op in traditionele patch-clamp methoden.
- De aanpak heeft implicaties voor onderzoek naar neurologische stoornissen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Automated image-guided patch clamp addresses throughput limitations in neuronal electrophysiology, enabling scalable functional validation of ion channel and synaptic receptor targets. This capability supports early discovery workflows by reducing technical variability and increasing data density for lead identification campaigns. The method enhances predictive confidence in target validation by providing quantitative, reproducible electrophysiological readouts from physiologically relevant neuronal preparations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of neuronal excitability and synaptic properties in fluorescently labeled cells.
- Operational Value: Reduces reliance on expert operators, standardizing patch clamp execution across users and sites.
- Predictive Value: Increases data yield per experiment, supporting statistical rigor in target engagement and mechanism of action studies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized neuronal preparations suitable for downstream pharmacological and genetic screening campaigns.
- Quantitative Output: Provides real-time resistance and pressure metrics that enable automated seal formation detection and process optimization.
- Scalability: Supports multiplexed targeting of multiple cells per slice, increasing experimental density without proportional increases in operator time.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of neuronal phenotypes in acute brain slices, maintaining native circuitry and pathophysiological context.
- Translational Continuity: Bridges discovery electrophysiology with preclinical validation by enabling consistent readouts across model systems.
- Mechanistic De-risking: Allows direct assessment of compound effects on ion channel function and neuronal firing patterns in intact tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows as a functional validation step following target identification and preceding lead optimization, providing electrophysiological confirmation of target engagement in native neuronal environments.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling automated, high-fidelity recording of neuronal activity in response to pharmacological or genetic perturbations.
- Screening: Enhances assay reproducibility and throughput, allowing systematic evaluation of compound libraries on neuronal excitability and synaptic transmission.
- Analytics: Delivers quantitative electrophysiological readouts (e.g., spike frequency, input resistance, current-voltage relationships) that inform structure-activity relationships and target selectivity.
- Translational Research: Maintains physiological relevance by recording from neurons in acute brain slices, preserving native expression profiles and microenvironmental cues.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology capability applicable across neuroscience discovery programs targeting ion channels, GPCRs, and synaptic proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence through direct, quantitative measurement of neuronal function in physiologically relevant preparations.
- Operational Value: Increases experimental throughput and reduces variability via automation of cell detection, targeting, and patch execution.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions by generating robust functional data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on confirmed electrophysiological modulation in disease-relevant neuronal circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, computer vision integration, and micromanipulator operation for system setup and troubleshooting.
- Dependent on stable fluorescence labeling, appropriate patch pipette preparation, and environmental control for healthy slice maintenance.
- Necessitates standardized software protocols and calibration procedures to ensure reproducibility across experiments and users.
- Adaptation to non-neuronal or dissociated cell types may require adjustments to detection algorithms and patching parameters.
- Practical limitations include mechanical positioning errors at extended travel distances and dependency on optimal fluorescent signal-to-noise ratios for reliable cell detection.
