Toepassing van geautomatiseerde beeldgeleide patchclamp voor de studie van neuronen in hersenschijven
31 juli 2017
Dit protocol beschrijft hoe u automatische beeldgeleide patch-clamp experimenten kunt uitvoeren met behulp van een systeem dat onlangs is ontwikkeld voor standaard in vitro elektrofysiologie apparatuur.
Het algemene doel van deze technologie is om computervisie te gebruiken om fluorescerende cellen automatisch te detecteren en geautomatiseerde patch clamp van deze cellen uit te voeren in acute herfsneden. Deze methode kan helpen om belangrijke moeilijkheden in het gebied van patch clamp elektrofysiologie te overwinnen, zoals identificatie, targeting en patch clamp van fluorescerend gelabelde cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het automatisch patch pipets, fluorescerende cellen kan detecteren en de stappen kan integreren met automatische patch clamp.
Deze innovatie verhoogt de experimentele doorvoer aanzienlijk. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar therapie of diagnose van neurologische aandoeningen, omdat hoge doorvoer beeldgestuurde automatische patch clamp kan worden gebruikt voor farmacologische screenings in meer fysiologische neuronale preparaten. Deze methode kan ook worden toegepast op andere in vitro preparaten, zoals neuronaal organel typisch, of slice culturen, gedissocieerde neuronen en alle andere niet-neuronale cellen.
Om deze procedure te beginnen, zet u de versterker, microscoopcontroller en de manipulatorcontroller aan. Voer vervolgens Autopatcher IG met python uit vanuit een opdrachtregelterminal door eerst de map te wijzigen waarin Autopatcher IG is geïnstalleerd. Typ vervolgens Python Autopatcher_IG.
PYW in de opdrachtregelterminal en druk op de enter-toets. Vul daarna alle glazen pipet met interne oplossing en laad deze op de hoofdtrap. Beweeg de pipettip naar het microscoopbeeldveld en breng deze in focus.
Als de numerieke toetsen gebruikt worden om de manipulatoren in de microscooptrap te verplaatsen, werkt u de coördinaten bij door op Z op het toetsenbord te drukken. De primaire calibratie zet de hoek en de afstand van de beweging door de manipulator om in het microscoopcoördinatenstelsel. De manipulator beweegt in drie richtingen met vooraf ingestelde afstand en de software detecteert de coördinaten van de pipettip binnen het microscoopbeeldveld.
Klik op de start calibratie knop op de hoofd GUI voor de bijbehorende eenheid waarop de pipet is geladen. Sla vervolgens de calibratie op door te klikken op save calibratie onderaan de hoofd GUI. Deze primaire calibratie hoeft alleen eenmaal uitgevoerd te worden, tenzij de fysieke organisatie van de rig wordt gewijzigd.
Plaats in deze stap een herfsnede in het midden van de opnamekamer. Stabiliseer de herfsnede met een slice hold down of een harp. Om de fluorescerende cel te detecteren, zoekt u het gebied van belang onder de viervoudige vergroting.
Beweeg vervolgens de microscooptrap door de modus klik om te bewegen in te schakelen en klik op het midden van het gebied van belang. Gebruik alternatief de toetsen om de microscooptrap te verplaatsen. Schakel vervolgens naar de hoge vergrotingslens en pas de focus aan door de microscoop in de Z-as te bewegen met behulp van RF op de toetsen.
De software stuurt de microscoop en de camera om een reeks beelden op verschillende diepten te maken. Vervolgens worden deze beelden onderworpen aan computervisie verwerking om fluorescerend gelabelde cellen te vinden. Het uiteindelijke resultaat is een lijst van gedetecteerde celcoördinaten.
Klik op de cel detecteer knop op de hoofd GUI kolom eenheid nul. Als de LED of laserlichtbron van de setup niet kan worden bediend door het TTL signaal, schakel dan handmatig de LED of laser in. Schakel de LED of laser uit indien nodig.
Er verschijnt een lijst met celcoördinaten in de memory posities GUI. Verwijder ongewenste cellen uit de lijst door op de X knop naast de coördinaten te klikken. Als doelcellen niet fluorescerend gelabeld zijn, klikt u op muis modus op de hoofd GUI.
Klik vervolgens op de cel van belang, er verschijnt een gele stip met een nummer op de cel en de coördinaten van de cel verschijnen in de memory posities GUI. Om secundaire calibratie uit te voeren om de pipet offset coördinaten te detecteren, vult u 1/3 van een glazen pipet met interne oplossing. Laad vervolgens de pipet op de pipet houder die aan de hoofdtrap is bevestigd.
Gebruik bij lage vergroting één en twee op de toetsen om te schakelen tussen eenheid één en eenheid twee. Breng de pipet in het beeldveld en pas de focus aan met behulp van de toetsen. Laad vervolgens de primaire calibratie in door op load calibratie te klikken.
Schakel de microscooplens naar hoge vergroting en klik 40 keer op de hoofd GUI. Breng de pipettip naar het centrum. Klik vervolgens op de secundaire calibratie knop op de hoofd GUI, onder de eenheid die in gebruik is.
Om een doelcel te patchen, klikt u op de patch control knop om de patch control GUI te openen. Klik op de naar knop naast de cel van belang op de coördinatenlijst in de memory positie GUI. Klik vervolgens op de CTM knop van de eenheid in de hoofd GUI om beweging mogelijk te maken.
Klik op de cel van belang om de pipettip naar de cel te bewegen. Vanwege de mechanische beperking van de manipulator, wanneer er langer dan 500 micrometer wordt gereisd, kan er een lichte positioneringsfout optreden. Om een grote mechanische positioneringsfout te voorkomen, moet secundaire calibratie worden uitgevoerd in de buurt van de doelcel.
Gebruik vervolgens de eenheid één geselecteerde knop om het inputsignaal tussen de twee eenheden te schakelen. Klik op de patch knop op de patch control GUI. Automatisch patchen begint en de druk en weerstand kunnen worden bewaakt op de patch control GUI.
Het automatische patching algoritme bewaakt de weerstand en controleert de druk door een reeks logica lussen, om een gigaseal te vormen. Een pop-up venster meldt de vorming van een gigaseal. Het systeem maakt gebruik van weerstandsverandering om cel-oppervlakte contact te herkennen.
In het geval dat het cel-oppervlakte contact niet tijdig wordt gedetecteerd, gebruikt u de volgende knop om het patchstadium te laten voortschrijden terwijl u in dezelfde automatische patchbeproeving blijft. Bedien het automatische proces op elk gewenst moment door te klikken op de respectieve knoppen op de patch control GUI. Selecteer vervolgens ja om in te breken met gecombineerde Zap en zuiging.
Selecteer alternatief nee om in te breken met alleen zuiging. Bewaar vervolgens het experiment patch log. Deze figuur toont de geselecteerde loca
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het uitvoeren van automatische, beeldgestuurde patch-clamp experimenten met behulp van geavanceerde computer vision-technologie. Deze aanpak verhoogt de efficiëntie bij het identificeren en targeten van fluorescentielabel-gekleurde cellen in acute hersensnijden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Elektrofysiologie
- Neurowetenschappen
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Patch-clamp electrofysiologie is cruciaal voor het bestuderen van neuronale activiteit.
- Het identificeren en targeten van specifieke cellen kan uitdagend zijn.
- Geautomatiseerde technieken kunnen de experimentele doorvoer verbeteren.
- Fluorescente labeling helpt bij de identificatie van cellen.
Doel van de studie
- Om de detectie van fluorescente cellen voor patch-clamp-experimenten te automatiseren.
- Om de efficiëntie van elektrofysiologische opnames te verhogen.
- Om farmacologische screenings in neuronale preparaten te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Computer vision-technologie voor celdetectie.
- Geautomatiseerde patch-clamp opstelling voor registratie.
- Integratie van detectie- en registratieprocessen.
- Toepassing op diverse in vitro neuronale preparaten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle automatisering van celidentificatie en patch-clamping.
- Verhoogde doorvoer voor elektrofysiologische experimenten.
- Potentiële toepassingen in farmacologisch onderzoek.
- Veelzijdigheid in toepassing op verschillende celtypen.
Conclusies
- Deze techniek verhoogt de experimentele efficiëntie aanzienlijk.
- Het pakt cruciale uitdagingen in traditionele patch-clamp-methoden aan.
- De benadering heeft implicaties voor onderzoek naar neurologische aandoeningen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Geautomatiseerde beeldgestuurde patchclamp pakt de doorvoercapaciteitsbeperkingen in de neuronale elektrofysiologie aan, waardoor schaalbare functionele validatie van ionkanaal- en synaptische receptor-targets mogelijk wordt. Deze mogelijkheid ondersteunt vroege discovery-workflows door technische variabiliteit te verminderen en de datadichtheid voor lead-identificatiecampagnes te verhogen. De methode verbetert het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door kwantitatieve, reproduceerbare elektrofysiologische read-outs te leveren vanuit fysiologisch relevante neuronale preparaten.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door directe meting van de neuronale exciteerbaarheid en synaptische eigenschappen in fluorescentie-gelabelde cellen.
- Operationele waarde: Vermindert de afhankelijkheid van experts, waardoor de uitvoering van patch-clamp gestandaardiseerd wordt voor verschillende gebruikers en locaties.
- Voorspellende waarde: Verhoogt de dataopbrengst per experiment, wat bijdraagt aan de statistische strengheid bij studies naar target engagement en het werkingsmechanisme.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gestandaardiseerde neuronale preparaten die geschikt zijn voor downstream farmacologische en genetische screeningscampagnes.
- Kwantitatieve output: Biedt real-time metrieken voor weerstand en druk die geautomatiseerde detectie van seal-vorming en procesoptimalisatie mogelijk maken.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt gemultiplexte targeting van meerdere cellen per plakje, waardoor de experimentele dichtheid toeneemt zonder een proportionele toename van de operatortijd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Faciliteert de studie van neuronale fenotypes in acute hersensnijden, waarbij de natuurlijke circuits en de pathofysiologische context behouden blijven.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekkende elektrofysiologie en preklinische validatie door consistente resultaten over verschillende modelsystemen mogelijk te maken.
- Mechanische risicoreductie: Maakt directe beoordeling mogelijk van de effecten van verbindingen op de functie van ionkanalen en neuronale vuringpatronen in intact weefsel.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in discovery biology-workflows als een functionele validatiestap na de targetidentificatie en voorafgaand aan de lead-optimalisatie, waarbij elektrofysiologische bevestiging van target-engagement in native neuronale omgevingen wordt geboden.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door geautomatiseerde, hooggetrouwe registratie van neuronale activiteit als reactie op farmacologische of genetische verstoringen mogelijk te maken.
- Screening: Verbetert de reproduceerbaarheid en doorvoer van assays, waardoor systematische evaluatie van compound-bibliotheken op neuronale exciteerbaarheid en synaptische transmissie mogelijk wordt.
- Analytics: Levert kwantitatieve elektrofysiologische read-outs (bijv. spike-frequentie, inputresistentie, stroom-spanningsrelaties) die inzicht geven in structuur-activiteitsrelaties en targetselectiviteit.
- Translationeel Onderzoek: Behoudt de fysiologische relevantie door registraties uit neuronen in acute hersensneden, waarbij oorspronkelijke expressieprofielen en micro-omgevingssignalen behouden blijven.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare elektrofysiologische capaciteit die toepasbaar is over diverse neuroscience discovery-programma's die gericht zijn op ionkanalen, GPCR's en synaptische eiwitten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door directe, kwantitatieve meting van de neuronale functie in fysiologisch relevante preparaten.
- Operationele waarde: Verhoogt de experimentele doorvoer en vermindert variabiliteit via automatisering van celdetectie, targeting en de uitvoering van de patch.
- Strategische waarde: Maakt snellere go/no-go-beslissingen mogelijk door vroeg in de discovery-pipeline robuuste functionele gegevens te genereren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van bevestigde elektrofysiologische modulatie in ziekterelateerde neuronale circuits.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in elektrofysiologie, integratie van computervisie en het bedienen van micromanipulatoren voor de installatie en probleemoplossing van het systeem.
- Afhankelijk van stabiele fluorescentielabeling, een correcte voorbereiding van de patchpipetten en omgevingscontrole voor het behoud van gezonde slices.
- Vereist gestandaardiseerde softwareprotocollen en kalibratieprocedures om de reproduceerbaarheid tussen experimenten en gebruikers te garanderen.
- Aanpassing aan niet-neuronaire of gedissocieerde celtypen kan aanpassingen van de detectiealgoritmen en patch-parameters vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten mechanische positioneringsfouten bij grotere verplaatsingsafstanden en de afhankelijkheid van optimale signaal-ruisverhoudingen van fluorescentie voor betrouwbare celdetectie.
