Name: MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Leer mRNA interactome capture voor post-transcriptionele genregulatie in Arabidopsis thaliana bladmesofylprotoplasten. Deze methode identificeert mRNA-bindende eiwitten via UV-crosslinking in fysiologische omstandigheden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen het laboratorium van prof. Joris Winderickx, die de UV-verknopingsapparaat heeft voorzien van de conventionele UV-lamp. KG wordt ondersteund door het onderzoeksfonds KU Leuven en erkent steun van FWO-subsidie ​​G065713N.

De auteurs hebben niets te onthullen.

We hebben succesvol mRNA interactome capture toegepast, ontwikkeld voor gist en menselijke cellen, om blad mesofyl protoplasten te planten. Bladmacofylcellen zijn de belangrijkste aardweefsel in plantenblaadjes. Het grote voordeel van deze methode is dat het in vivo verknoping gebruikt om de eiwitten uit een fysiologische omgeving te ontdekken. In dit protocol presenteren we voornamelijk een aantal geoptimaliseerde experimentele condities ( bijvoorbeeld het aantal protoplas...

Eukaryoten gebruiken meerdere RNA biogenese regulerende pathways om cellulaire biologische processen te behouden. Onder de bekende typen RNA is mRNA zeer divers en draagt ​​de coderingscapaciteit van eiwitten en hun isoformes 1. De PTGR-weg leidt de fatsussen van pre-mRNAs 2 , 3 . RBP&#39;s uit verschillende genfamilies regelen de regulering van RNA, en in PTGR leiden specifieke mRBPs mRNAs door directe fysieke interacties, die functionele mRNP&#39;s vormen. Daarom is het identificeren en karakteriseren van mRBP&#39;s en hun mRNP&#39;s van cruciaal belang om de regulering van cellulaire mRNA-metabolisme 2 te begrijpen. In de afgelopen drie decennia zijn diverse in vitro methoden - waaronder RNA-elektroforetische mobiliteitsverschuiving (REMSA) -assays, systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijkingstests (SELEX) gebaseerd op bibliotheek-afgeleide constructen, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radioactief gemerk of kwantitatiefFluorescentie-RNA-bindingsbepalingen, röntgenkristallografie en NMR-spectroscopie 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 - zijn op grote schaal toegepast op studies van RBP&#39;s, voornamelijk uit zoogdiercellen. De resultaten van deze studies van zoogdieren RBP&#39;s kunnen worden gezocht via de RNA-bindende Protein DataBase (RBPDB), die de gepubliceerde waarnemingen 10 verzamelt . Hoewel deze in vitro benaderingen krachtige tools zijn, bepalen ze de gebonden RNA-motieven uit een bepaald RNA-pool van sequenties en zijn daarom beperkt in hun vermogen om nieuwe doel RNA&#39;s te ontdekken. Hetzelfde geldt voor berekeningsstrategieën om genoom-brede RBP&#39;s te voorspellen, die zijn gebaseerd op het behoud van eiwitsequentie en structuur 15 . Om dit te overwinnen is een nieuwe experimentele methode haS is vastgesteld die het mogelijk maakt om de RNA-motieven te identificeren die een RBP van belang heeft, alsmede voor de bepaling van de precieze plaats van binding. Deze methode, genaamd &quot;verknoping en immunoprecipitatie&quot; (CLIP), bestaat uit in vivo UV-verknoping gevolgd door immunoprecipitatie 11 . Vroege studies hebben aangetoond dat fotoactivering van DNA- en RNA-nucleotiden kan optreden bij excitatie UV-golflengten groter dan 245 nm. De reactie door thymidine lijkt gunstig te zijn (rang in volgorde van verminderde fotoreactiviteit: dT&gt; dC&gt; rU&gt; rC, dA, dG) 12 . Door gebruik te maken van UV-licht met een golflengte van 254 nm (UV-C) werd geconstateerd dat covalente bindingen tussen RNA-nucleotiden en eiwitresiduen worden gecreëerd bij slechts enkele Astromen (Å). Het fenomeen wordt dus de &quot;nul-lengte&quot; verknoping van RNA en RBP genoemd. Dit kan gevolgd worden door een strikte zuivering procedure<html> Duur met weinig achtergrond 13 , 14 . Een complementaire strategie voor CLIP is het combineren van in vivo UV-verknoping met eiwitidentificatie om het landschap van RBP&#39;s te beschrijven. Een aantal van dergelijke genoomwijdte mRNA gebonden proteomen zijn geïsoleerd uit gistcellen, embryonale stamcellen (ESC&#39;s) en menselijke cellijnen ( dwz HEK293 en HeLa) met behulp van deze nieuwe experimentele aanpak, genaamd &quot;mRNA interactome capture&quot; 18 , 19 , 20 , 21 . De methode bestaat uit in vivo UV-verknoping gevolgd door mRNP zuivering en MS-gebaseerde proteomics. Door deze strategie toe te passen, zijn veel nieuwe &quot;maanlichtende&quot; RBP&#39;s die niet-kanonieke RBD&#39;s bevatten, ontdekt en is het duidelijk geworden dat meer eiwitten RNA-bindende capaciteiten hebben dan eerder werd verondersteld&quot;&gt; 15 , 16 , 17. Het gebruik van deze methode zorgt voor nieuwe toepassingen en voor de mogelijkheid om nieuwe biologische vragen te beantwoorden bij het onderzoeken van RBP&#39;s. Bijvoorbeeld, heeft een recente studie het behoud van het mRNA gebonden proteome onderzocht (de kern RBP Proteome) tussen gist en menselijke cellen 22 . Plant RBP&#39;s zijn al gebleken betrokken te zijn bij groei en ontwikkeling ( bijv . In de posttranscriptie regulatie van bloeitijd, de circadiaanse klok en genuitdrukking in mitochondriën en chloroplasten) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . Bovendien worden ze gedacht aan functies in de cellulaire processen die reageren op abiotische stressen ( bijvoorbeeld koud, droogte, saLinheid en absciszuur (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34 . Er zijn meer dan 200 voorspelde RBP genen in het Arabidopsis thaliana genoom, gebaseerd op RNA herkenningsmotief (RRM) en K homologie (KH) domein sequentie motieven; In rijst zijn ongeveer 250 genoteerd 35 , 36 . Het is opmerkelijk dat veel voorspelde RBP&#39;s uniek zijn voor planten ( bijv. Geen metazoan-orthologen tot ongeveer 50% van de voorspelde Arabidopsis- RBP&#39;s die een RRM-domein bevatten) 35 , wat suggereert dat veel nieuwe functies kunnen dienen. De functies van de meeste voorspelde RBP&#39;s blijven uncharacterized 23 . De isolatie van mRNA gebonden proteomen uit Arabidopsis geëtolideerde zaailingen, bladweefsel, gekweekte wortelcellen en bladmemofyl protoplasten door het gebruik vanMRNA interactome capture is recentelijk gerapporteerd 38 , 39 . Deze studies tonen het sterke potentieel om in de nabije toekomst systematisch de functionele RBP&#39;s in planten te catalogeren. Hier presenteren we een protocol voor mRNA interactome capture van plant protoplasten (dat wil zeggen cellen zonder celwanden). Arabidopsis thaliana blad mesofyl protoplasten zijn het belangrijkste type bladcel. De geïsoleerde protoplasten zorgen voor optimale toegang van UV licht aan de cellen. Dit celtype kan gebruikt worden in analyses die transient eiwitten voor functionele karakterisering 40 , 41 uitdrukken. Bovendien is protoplasting toegepast op verscheidene andere plantencelsoorten en soorten 42 , 43 , 44 ( bijv. Petersson et al ., 2009; Bargmann en Birnbaum, 2010; en Hong et al ., 2012). &lt;P class = &quot;jove_content&quot;&gt; De methode omvat in totaal 11 stappen ( figuur 1A ). Arabidopsis blad mesofyl protoplasten worden eerst geïsoleerd (stap 1) en worden vervolgens UV bestraald om verknoopte mRNPs (stap 2) te vormen. Wanneer protoplasten worden gelicht onder denatureringsomstandigheden (stap 3), worden de verknoopte mRNP&#39;s in lysis / bindingsbuffer vrijgegeven en door oligo-d (T) 25 kralen (stap 4) getrokken. Na verscheidene ronden strengende wassen worden de mRNP&#39;s gezuiverd en verder geanalyseerd. De gedenatureerde peptiden van mRBPs worden verteerd door eiwitase K voordat de verknoopte mRNA&#39;s worden gezuiverd en de RNA-kwaliteit wordt geverifieerd door qRT-PCR (stappen 5 en 6). Na behandeling met RNase en eiwitconcentratie (stap 7) wordt de proteïnekwaliteit geregeld door SDS polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) en zilverkleuring (stap 8). Het verschil in eiwitbandpatronen kan gemakkelijk worden geïllustreerd tussen een verknoopt monster (CL) en een niet-verknoopt monster (niet-CL;Het negatieve controle monster van protoplasten die niet aan UV-bestraling worden blootgesteld). De identificatie van eiwitten wordt bereikt door middel van MS-gebaseerde proteomics. De eiwitten uit het CL-monster worden gescheiden door eendimensionale polyacrylamidegelelektroforese (1D-PAGE) om mogelijke achtergrondverontreiniging te verwijderen, &quot;in-gel gedigereerd&quot; in korte peptiden met behulp van trypsine, en worden gezuiverd (stap 9). Nano reverse-phase vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (nano-LC-MS) maakt het mogelijk de hoeveelheid definitieve eiwitten in het mRNA gebonden proteome te bepalen (stap 10). Tenslotte worden de geïdentificeerde mRBP&#39;s gekenmerkt en gecatalogiseerd met behulp van bioinformatische analyse (stap 11).

<table><tbody><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.8 M Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M1902-500G</td><td>Primary isotonic Enzyme solution &amp; MMg solution</td></tr><tr><td>2 M KCl</td><td>MERCK</td><td>Art. 4935</td><td>Primary isotonic Enzyme solution &amp; W5 buffer</td></tr><tr><td>0.2 M MES (pH 5.7) (4-morpholineethanesulfonic acid)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M2933</td><td>Primary isotonic Enzyme solution, W5 buffer &amp; MMg solution, Filtration sterilization</td></tr><tr><td>Cellulase R10</td><td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td><td>CELLULASE &ldquo;ONOZUKA&rdquo; R-10, 10 g</td><td>Final isotonic enzyme solution</td></tr><tr><td>Macerozyme R10</td><td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td><td>MACEROZYME R-10, 10g</td><td>Final isotonic enzyme solution</td></tr><tr><td>10% (w/v) BSA (Bovine Serum Albumin)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A7906-100G</td><td>Final isotonic enzyme solution &amp; Filtration sterilization</td></tr><tr><td>1 M CaCl2</td><td>Chem-Lab NV</td><td>CL00.0317.1000</td><td>Final isotonic enzyme solution, W5 buffer &amp; Digestion buffer</td></tr><tr><td>1 M NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/3160/60</td><td>W5 buffer</td></tr><tr><td>2 M MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td>MMg solution</td></tr><tr><td>1 M LiCl (Lithium Chloride)</td><td>Acros</td><td>199885000</td><td>Lysis/binding buffer, Wash buffer 1, Wash buffer 2 &amp; Low salt buffer</td></tr><tr><td>5% (w/v) LiDS (Lithium Dodecyl Sulphate)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>L4632-25G</td><td>Lysis/binding buffer, Wash buffer 1 &amp; Filtration sterilization</td></tr><tr><td>1 M DTT (Dithiothreitol)</td><td>Thermo Fisher Scientific Wash buffer 1 &amp; Wash buffer 2</td><td>307866</td><td>Lysis/binding buffer,</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl))</td><td>Acros &amp; Fisher Chemical</td><td>167620010 &amp; H/1200/PB15</td><td>Lysis/binding buffer, Wash buffer 1, Wash buffer 2, Low salt buffer &amp; Elution buffer</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>ED-500G</td><td>Lysis/binding buffer, Wash buffer 1, Wash buffer 2, Low salt buffer &amp; Elution buffer</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>MERCK</td><td>8.22184.0500</td><td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td></tr><tr><td>0.1 M NaOH</td><td>VWR PROLABO CHEMICALS</td><td>28244.295</td><td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td></tr><tr><td>1x PBS (pH 7.4) (Phosphate Buffered Saline) containing (NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)</td><td>Fisher Chemical, MERCK, Sigma-aldrich &amp; SAFC</td><td>S/3160/60, Art. 4935, 71640-250G &amp; 60230</td><td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td></tr><tr><td>Proteinase K solution (2 &mu;g/&mu;L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11789020</td><td>Protein digestion</td></tr><tr><td>Loading dye</td><td>Invitrogen</td><td>LC5925</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>qPCR master mix</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td>qRT-PCR assay</td></tr><tr><td>RNase Cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2286</td><td>RNA digestion</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>322415</td><td>Gel fixation and gel destaining</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-aldrich</td><td>537020</td><td>Gel fixation and gel destaining</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20278</td><td>Gel staining</td></tr><tr><td>1 M NH4HCO3 (Ammonium bicarbonate) &nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>09830-500G</td><td>Gel hydration &amp; Digestion buffer</td></tr><tr><td>CH3CN (Acetonitrile)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>34851-100ML</td><td>Gel dehydration &amp; Peptide dissolving solution</td></tr><tr><td>IAA (Iodoacetic acid)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>I4386-10G</td><td>Alkylating agent</td></tr><tr><td>TFA (Trifluoroacetic acid)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>302031-10X1ML</td><td>Peptide dissolving solution</td></tr><tr><td>FA (Formic acid)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>06554-5G</td><td>Peptide extraction</td></tr><tr><td>Trypsin solution (6 ng/&mu;L)</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td>Digestion buffer</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soil</td><td>Peltracom</td><td>LP2D</td><td>Plant growth</td></tr><tr><td>Vermiculite 3</td><td>Sibli AS</td><td>05VERMICULIET</td><td>Plant growth</td></tr><tr><td>Petri dish (150 x 20 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1184.500</td><td>Carrier for protoplast suspension</td></tr><tr><td>0.22 &mu;m filter</td><td>Millipore</td><td>SE2M229104</td><td>Homogenization of final isotonic enzyme solution</td></tr><tr><td>Razorblade</td><td>Agar Scientific</td><td>T585</td><td>Rosette leaf strips</td></tr><tr><td>35-75 &mu;m nylon mesh</td><td>SEFAR NITEX</td><td>74010</td><td>Protoplast suspension filtration</td></tr><tr><td>50 mL round bottom tubes</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T1918-10EA</td><td>Carrier for protoplast suspension</td></tr><tr><td>Hemocytometer (B&uuml;rker hemocytometer)</td><td>MARIENFELD</td><td>650030</td><td>Protoplast cell counting</td></tr><tr><td>UV crosslinking apparatus (

mrna interactome capture van plant protoplasts

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-bindende eiwitten (RBP&#39;s) bepalen de fates van RNA&#39;s. Zij nemen deel aan alle RNA biogenese pathways en dragen bij tot post-transcriptie gene regulatie (PTGR) van messenger RNAs (mRNAs). In de afgelopen jaren zijn een aantal mRNA gebonden proteomen uit gist- en zoogdiercellijnen succesvol geïsoleerd door gebruik te maken van een nieuwe methode genaamd &quot;mRNA interactome capture&quot;, die het mogelijk maakt om mRNA-bindende eiwitten (mRBP&#39;s) te identificeren. Direct vanuit een fysiologische omgeving. De werkwijze bestaat uit in vivo ultraviolette (UV) verknoping, aftrek en zuivering van messenger ribonucleoproteïne complexen (mRNPs) door oligo (dT) kralen, en de daaropvolgende identificatie van de verknoopte eiwitten door middel van massaspectrometrie (MS). Heel recent, door dezelfde methode toe te passen, zijn verschillende planten mRNA gebonden proteomen gelijktijdig gerapporteerd uit verschillende Arabidopsis weefsel bronnen: geëtolideerde zaailingen, bladweefsel,Blad mesofyl protoplasten, en gekweekte wortelcellen. Hier presenteren wij de geoptimaliseerde mRNA interactome capture methode voor Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten, een celtype dat dient als een veelzijdig hulpmiddel voor experimenten die diverse cellulaire assays omvatten. De voorwaarden voor optimale eiwitopbrengst omvatten de hoeveelheid startweefsel en de duur van UV-bestraling. In het mRNA gebonden proteoom verkregen uit een middelgrote experiment (10 7 cellen) bleek dat RBP&#39;s die op RNA-bindende capaciteit beschikten, te oververtegenwoordigd waren en veel nieuwe RBP&#39;s werden geïdentificeerd. Het experiment kan opgeschaald worden (10 9 cellen), en de geoptimaliseerde methode kan toegepast worden op andere plantencel typen en soorten om in grote mate te isoleren, te catalogeren en mRNA-gebonden proteomen te vergelijken.

We hebben een karakteristieke halo waargenomen die de kralenpelletje in het CL-monster omsluit, in wasstap 4.3 met wasbuffer 2 ( Figuur 1B ). Hoewel het niet is onderzocht, kan dit fenomeen waarschijnlijk worden verklaard door de interferentie van verknoopte mRNP complexen met kraal aggregatie tijdens de magnetische opname waardoor een meer diffuus aggregaat wordt gevormd. Het geeft aan dat de oligo-d (T) 25 kraalvangst effectief was <sup class="x...

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Het algemene doel van deze geoptimaliseerde mRNA-interactoomcaptuur is het isoleren en identificeren van een aan mRNA gebonden proteoom uit plantencellen. Deze methode wordt toegepast op mesofylprotoplasten uit bladeren van Arabidopsis thaliana, een celtype dat als veelzijdig hulpmiddel wordt gebruikt in diverse cellulaire assays. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van post-transcriptionele genregulatie, zoals het ontdekken en begrijpen van de rol van RNA-bindende eiwitten in plantenboodschappers.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een plantmessenger op een gebonden proteoom direct vanuit de fysiologische omgeving kan isoleren en identificeren. Deze methode kan dus inzicht verschaffen in het messenger-RNA-gebonden eiwit uit mesofylprotoplasten van arabidopsisbladeren. Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals protoplasten of weefsels van andere planten.We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we merkten dat deze succesvol was toegepast op gist en zoogdiercellijnen. Isoleer mesofylprotoplasten uit arabidopsisbladeren voor twee verschillende monsters, zoals beschreven in het tekstprotocol. Bewaar het controlemonster dat niet UV-gecrosslinkt zal worden, of het non-CL monster, op ijs.Breng de protoplast-suspensie die gecrosslinkt moet worden, of het CL-monster, over naar een grote petrischaal. Voeg 30 milliliters ijskoude MMG-oplossing toe aan de schaal om het oppervlak te bedekken en verspreid de cellen door voorzichtig te pipetteren. Bedek de petrischaal met aluminiumfolie bij transport naar het UV-crosslinking-apparaat.Plaats de geopende petrischaal onmiddellijk in een UV-crosslinking-apparaat. Zorg ervoor dat de afstand tussen de schaal en de UV-lamp acht centimeter bedraagt en bestraal de monster vervolgens gedurende één minuut. Verdeel daarna snel de protoplastsuspensie vanuit de petrischaal over twee nieuwe ronde 50 milliliter buizen.Spoel de bodem van de schaal met nog eens vijf milliliter van de ijskoude MMG-oplossing om de resterende protoplasten te verzamelen. Verdeel de suspensie over de twee buisjes. Centrifugeer vervolgens de non-CL en de twee CL-monsterbuisjes bij 100 ×g bij vier graden celsius gedurende vijf minuten.Nadat het supernatant is weggegooid, plaatst u de buis met het niet-CL pellet opnieuw op ijs. Voeg 10 milliliters ijskoude MMG-oplossing toe aan elke CL-monsterbuis en schud de buizen voorzichtig om de pellets opnieuw te suspenderen. Nadat de twee monsters zijn samengevoegd in één 50 milliliter ronde bodembuis, centrifugeert u deze bij 100 ×g bij vier graden celsius gedurende vijf minuten.Blijf na het verwijderen van het supernatant de pellet op ijs bewaren. Voeg vervolgens negen milliliters ijskoude lysis-bindingsbuffer toe aan de celpellet van elk monster. Lyseer de protoplasten door ongeveer twintig keer op en neer te pipetteren, totdat de oplossing een homogene lichtgroene kleur heeft.Passeren het protoplastlysaat voor homogenisatie twee keer door een glazen spuit van 50 milliliter met een smalle naald, en incuberen het lysaat vervolgens tien minuten op ijs. Bevriezen de monsters in vloeibare stikstof en bewaren bij -80 °C voor maximaal drie weken. Nadat de buis met bevroren protoplastlysaat bij kamertemperatuur is ontdooid, dient de buis op ijs te worden bewaard. Verdeel aliquoten van 1,8 milliliter oligo-d(T)magnetische kraaltjes over zes nieuwe microcentrifugebuisjes van twee milliliter met ronde bodem die op ijs zijn geplaatst. Was de Bead-suspensie in elk buisje met 600 microliter lysis-bindingsbuffer door kortstondig op en neer te pipetteren en roteer de kraaltjes vervolgens gedurende twee minuten op een rotator. Houd de kraaltjes op ijs.Plaats vervolgens alle zes buizen met de beads voor ten minste drie minuten in een magnetisch rek om voldoende tijd te geven voor volledige magnetische vangst. Wanneer de beads volledig zijn gevangen, wordt de suspensie helder. Verwijder daarna het supernatant uit alle zes buizen en voeg onmiddellijk negen milliliter protoplastlysaat toe in aliquoten.Meng de beads met het lysaat door te pipetteren totdat de suspensie er bruin en homogeen uitziet. Incubeer de buisjes één uur bij vier graden celsius onder zachte rotatie. Plaats de buisjes na incubatie gedurende drie minuten terug in het magnetische rek.Wanneer alle beads tegen de wand van de buisjes zijn vastgezet, verzamelt u het supernatant dat het protoplastlysaat bevat in zes nieuwe ronde microcentrifugebuisjes van twee milliliter. Voeg vervolgens 1,5 milliliter ijskoud wasbuffer één toe aan elk buisje met beads en resuspendeer de beads door te pipetteren. Na een minuut voorzichtig roteren plaatst u de buisjes drie minuten lang terug in het magnetische rek.Verwijder het supernatant en herhaal deze wasstap één keer. Herhaal dezelfde wasprocedure tweemaal met gebruik van 1,5 milliliters ijskoud wasbuffer twee. Als de mRNP's efficiënt uit het protoplastlysaat zijn geïsoleerd, moet er een halo zichtbaar zijn rond het pellet met beads in de CL-monsters.Herhaal ten slotte de wasprocedure eenmaal met 1,5 milliliters ijskoude buffer met laag zoutgehalte. Voeg na het wassen 500 microliters elutiebuffer toe aan elke buis en resuspendeer de beads voorzichtig door te pipetteren. Incubeer drie minuten bij 50 graden celsius om de poly-A-staart RNA's vrij te maken.Resuspendeer de kraaltjes voorzichtig door één keer te pipetteren en plaats de buisjes gedurende vijf minuten bij vier graden celsius terug in het magnetische rek. Draag de eluenten uit alle zes de buisjes over naar een conische buis van 15 milliliter die op ijs staat en voeg deze samen. Dit levert ongeveer drie millimeters eluent op.De kwaliteit en kwantiteit van RNA kan onmiddellijk worden bepaald met een spectrofotometer. Bereid de oligo-d(T)-beads voor hergebruik door ze twee keer te wassen met één milliliter ijskoud elutiebuffer. Was ze daarna met één milliliter ijskoud lysis-bindingsbuffer om de zoutconcentratie terug te brengen naar 500 millimolair.Gebruik deze gewassen oligo-d(T)-beads om de bindings-, was- en elutieprocedures voor nog twee ronden te herhalen. Hiermee worden de poly-A-staart-RNA's uit het protoplastlysaat verwijderd, wat resulteert in een totaal van negen milliliter eluaat per monster. De beads kunnen worden bewaard en voor een maximum van drie experimenten worden gebruikt.Om de RNA-kwaliteit te testen, worden de UV-gecrosslinkte eiwitten digested met een proteinase K-oplossing volgens het tekstprotocol. Zuiver vervolgens het RNA met behulp van de RNA-purificatiekit om eventuele resterende contaminanten te verwijderen. Na purificatie zijn de monsters klaar voor de RNA-kwaliteitstest met qRT-PCR.Begin met het behandelen van acht milliliters van elk monster met 100 units van een RNAse-cocktail die RNAse A en RNAse T1 bevat. Na kort vortexen worden de monsters gedurende één uur bij 37 °C geïncubeerd. Om mRNA-bindende eiwitten, of mRBP's, te concentreren, worden de monsters gefilterd met behulp van centrifugale filtereenheden. Elk monster levert 75 µL op met twee µg eiwit.Bevries de monsters bij -80 °C voor langdurige bewaring. Om een SDS-PAGE-gel uit te voeren, mengt u 25 µL van elk geconcentreerde monster met 15 µL 2X laadkleurstof en verhit u de monsters gedurende vijf minuten bij 95 °C. Breng de monsters en een eiwitmarker aan op een SDS-PAGE-gel met een stapelgel van 5% en een scheidingsgel van 12%.Was vervolgens de gel twee keer met ultrapuur water gedurende vijf minuten per wasbeurt. Gebruik een commerciële zilverkleuringskit om de gel te kleuren. Als er een voldoende aantal startprotoplasten is gebruikt, zullen de eiwitbanden binnen vijf minuten zichtbaar worden.Om de mRBP's verder te testen, worden de peptiden gezuiverd uit een tweede 1D-pagegel zoals uitgelegd in het tekstprotocol. Deze gezuiverde peptiden kunnen nu worden geanalyseerd via nano reverse-phase vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en kwalitatieve en kwantitatieve proteomica. Na capture met oligo-d(T)-beads toonde qRT-PCR significant hogere niveaus aan van poly ubiquitine 10 referentie-mRNA vergeleken met 18S rRNA.Aangezien oligo-d(T)-beads alleen binden aan RNA met een poly-A-staart, suggereert dit dat mRNA's zijn verrijkt in het eluaat. De capture van mRBP's door oligo-d(T)-beads wordt verder geëvalueerd met een zilvergekleurde SDS-PAGE-gel. De gel laat een significant hogere eiwithoeveelheid zien in het UV-gecrosslinkte CL-monster vergeleken met het niet-gecrosslinkte non-CL-monster.De duur van de UV-bestraling kan de efficiëntie van de crosslinking beïnvloeden. Deze met zilver gekleurde SDS-PAGE-gel bevestigt dat één of drie minuten UV-bestraling de optimale conditie is, met de sterkste bandintensiteiten. In totaal werden 325 eiwitten geïdentificeerd via kwantitatieve proteomics-analyse.225 van deze eiwitten lagen onder het significantieniveau vanwege de lage abundantie van peptiden voor elk eiwit, met een hoge variabiliteit in peptide-intensiteiten. Omdat ze echter allemaal kwalitatief alleen in CL-monsters werden gedetecteerd, werden ze allemaal als positieve resultaten beschouwd. Deze 325 eiwitten werden verder ingedeeld in drie categorieën: ribosomale eiwitten, belangrijkste RBP's en kandidaat-RBP's.De kandidaat-RBP's missen conventionele RNA-bindende domeinen en de meeste van hun rollen zijn nog niet gevalideerd, wat wijst op mogelijke nieuwe functies in de RNA-regulatie. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in één week worden uitgevoerd indien dit op de juiste wijze gebeurt. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van moleculaire regulatieroutes in planten om het genoombrede messenger RNA-gebonden proteoom in cellen en weefsels van dicotylen en monocotylen te verkennen.

mrna-interactome-capture-from-plant-protoplasts

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Het testen van eiwit-eiwit interacties is onmisbaar voor dissectie van eiwitten functionaliteit. Hier introduceren we...

Eiwit Membraan Overlay Test: een protocol om interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten Test In vitro</em

We hebben een techniek ontwikkeld om eiwit-eiwit interacties in planten te testen. Een geel fluorescerend eiwit (YFP) wordt opgesplitst in twee niet-overlappende fragmenten. Elk fragment is gekloond in-frame aan een gen van belang via de Gateway-systeem, waardoor de expressie van fusie-eiwitten. Reconstitutie van YFP-signaal treedt alleen op wanneer de lijkschouwing eiwitten met elkaar omgaan.

Detectie van eiwit interacties in Plant met behulp van een Gateway-compatibele Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) Systeem

We beschrijven hier een protocol voor de zuivering en karakterisering van plantaardig eiwit complexen. We zien dat door immunoprecipitatie een eiwit in een complex, zodat we kunnen zijn post-translationele modificaties en zijn interactie partners identificeren.

Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

Vorming van eiwitcomplexen in vivo kan worden gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie complementatie. Interactie partners gefuseerd aan complementaire delen van fluorescente labels en tijdelijk tot expressie gebracht in tabaksbladeren, waardoor een opnieuw fluorescentiesignaal op nabijheid van de twee eiwitten.

Eiwit-eiwit interacties gevisualiseerd door Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie in Protoplasten en Bladeren Tabak

Chromatine immunoprecipitatie is een krachtige techniek voor de identificatie van DNA-bindingsplaatsen van Arabidopsis eiwitten in vivo. Deze procedure omvat chromatine verknoping en fragmentatie, selectieve immunoprecipitatie met antilichamen tegen het eiwit van belang en qPCR analyse van gebonden DNA. We beschrijven een eenvoudige ChIP assay geoptimaliseerd voor Arabidopsis planten.

Chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van Arabidopsis eiwit-DNA interacties<em&gt; In Vivo</em

Dit manuscript beschrijft een gemakkelijke en snelle experimentele procedure voor het bepalen van de eiwit-eiwitinteractie gebaseerd op de meting van luciferase activiteit.

Luciferase complementatie Imaging Assay in Nicotiana benthamiana bladeren voor Transient bepalen eiwit-eiwit interactie Dynamics

Eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet interacties zijn cruciaal voor alle cellulaire functies. Hierin beschrijven we een protocol waarmee parallelle analyse van deze interacties met een eiwit van keuze. Ons protocol is geoptimaliseerd voor de plant celculturen en affiniteit zuivering combineert met massa spectrometrie gebaseerde eiwitten en metaboliet detectie.

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Hier beschreven is een nabijheid etikettering methode voor de identificatie van interactie partners van de TIR domein van de NLR immuunreceptor in Nicotiana benthamiana bladweefsel. Ook is een gedetailleerd protocol voor de identificatie van interacties tussen andere eiwitten van belang met behulp van deze techniek in Nicotiana en andere plantensoorten.

TurboID-Based Proximity Labeling voor in Planta Identificatie van Protein-Protein Interaction Networks

Het vertalen van ribosoomaffiniteitszuivering (TRAP) biedt de mogelijkheid om ontwikkelingsprogramma's te ontleden met minimale verwerking van organen en weefsels. Het protocol levert hoogwaardig RNA op uit cellen die zijn gericht op een groene fluorescerende eiwit (GFP)-gelabelde ribosomalsubunit. Downstream analysetools, zoals qRT-PCR of RNA-seq, onthullen weefsel- en celtypespecifieke expressieprofielen.

Het vertalen van Ribosome Affinity Purification (TRAP) om Arabidopsis thaliana Root Development te onderzoeken op een cell type-specifieke schaal

De haalbaarheid en effectiviteit van high-throughput scRNA-seq-methoden luiden een eencellig tijdperk in plantenonderzoek in. Hier wordt een robuuste en complete procedure gepresenteerd voor het isoleren van specifieke Arabidopsis thaliana wortelceltypen en de daaropvolgende transcriptoombibliotheekconstructie en -analyse.

Isolatie en transcriptoomanalyse van plantenceltypen

Leer mRNA interactome capture voor post-transcriptionele genregulatie in Arabidopsis thaliana bladmesofylprotoplasten. Deze methode identificeert mRNA-bindende eiwitten via UV-crosslinking in fysiologische omstandigheden.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

Meer video's verkennen