MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

Het algemene doel van deze geoptimaliseerde mRNA-interactoom-opvang is om een mRNA-gebonden proteoom uit plantencellen te isoleren en te identificeren. Deze methode wordt toegepast op arabidopsis thaliana bladmesofiel protoplasten, een celtype dat als veelzijdig hulpmiddel wordt gebruikt in verschillende cellulaire analyses. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van post-transcriptionele gen-regulatie-implantaten, zoals het ontdekken en begrijpen van de rol van plantaardige boodschapper RNA-bindende eiwitten.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een plantenboodschapper kan isoleren en identificeren op een gebonden proteoom direct uit de fysiologische omgeving. Dus deze methode kan inzicht geven in het boodschapper RNA-gebonden eiwit van aribidopsis bladmesofiel protoplasten. Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals andere plantenprotoplasten of weefsels.

We hadden eerst het idee voor deze methode toen we merkten dat het met succes was toegepast op gist en zoogdiercellijnen. Isoleren van arabidopsis bladmesofiel protoplasten voor twee verschillende monsters, zoals beschreven in het tekstprotocol. Bewaar het controlemonster dat niet zal worden UV-gecrosslinked, of non-CL-monster op ijs.

Breng de protoplastensuspensie die gecrosslinked zal worden, of CL-monster naar een grote petrischaal. Voeg 30 milliliter ijskoude MMG-oplossing toe aan de schaal om het oppervlak te bedekken en verspreid de cellen door voorzichtig te pipetteren. Bedek de petrischaal met aluminiumfolie wanneer deze naar het UV-gecrosslinkingtoestel wordt getransporteerd.

Plaats de geopende petrischaal onmiddellijk in een UV-gecrosslinkingtoestel. Zorg ervoor dat de afstand tussen de schaal en de UV-lamp acht centimeter is en bestraal vervolgens het monster gedurende één minuut. Giet daarna snel de protoplastensuspensie van de petrischaal in twee nieuwe 50 milliliter ronde bodembuizen.

Was de bodem van de schaal met een extra vijf milliliter van de ijskoude MMG-oplossing om de rest van de protoplasten te verzamelen. Verdeel de suspensie tussen de twee buizen. Centrifugeer vervolgens de non-CL en twee CL-monsterbuizen gedurende vijf minuten bij 100 keer g bij vier graden Celsius.

Na het weggooien van de supernatant, plaats de buis met de non-CL-pellet terug op ijs. Voeg 10 milliliter ijskoude MMG-oplossing toe aan elke CL-monsterbuis en schud de buizen voorzichtig om de pellets opnieuw te suspenderen. Nadat de twee monsters in één 50 milliliter ronde bodembuis zijn gecombineerd, centrifugeer gedurende vijf minuten bij 100 keer g bij vier graden Celsius.

Na het weggooien van de supernatant, bewaar de pellet op ijs. Voeg vervolgens negen milliliter ijskoude lysis-bindingsbuffer toe aan het celpellet van elk monster. Lyse de protoplasten door ongeveer twintig keer op en neer te pipetteren, tot de oplossing een homogene lichtgroene kleur heeft.

Voor homogenisatie, passeer het protoplastenlysaat twee keer door een 50 milliliter glazen spuit met een smalle naald en incubeer vervolgens het lysaat op ijs gedurende tien minuten. Bevries de monsters in vloeibare stikstof en bewaar ze bij min 80 graden Celsius gedurende maximaal drie weken. Na het ontdooien van de buis met bevroren protoplastenlysaat op kamertemperatuur, houd de buis op ijs.

Geef 1,8 milliliter oligo-d(T)magnetische kralen in zes nieuwe twee milliliter ronde bodem microcentrifugebuizen geplaatst op ijs. Was de kralensuspensie in elke buis met 600 microliters lysis-bindingsbuffer door kort op en neer te pipetteren en roteren de kralen voorzichtig gedurende twee minuten op een rotator. Bewaar de kralen op ijs.

Plaats vervolgens alle zes buizen met de kralen in een magnetisch rek gedurende minimaal drie minuten om voldoende tijd te geven voor de volledige magnetische opvang. Wanneer de kralen volledig zijn opgevangen, zal de suspensie helder worden. Gooi vervolgens het supernatant weg van alle zes buizen en geef onmiddellijk negen milliliter protoplastenlysaat erin.

Meng de kralen met lysaat door te pipetteren totdat de suspensie bruin en homogeen lijkt. Incubeer de buizen gedurende één uur bij vier graden Celsius met voorzichtig draaien. Na incubatie, plaats de buizen terug in het magnetische rek gedurende drie minuten.

Wanneer alle kralen aan de zijkant van de buizen zijn opgevangen, verzamel de supernatant met het protoplastenlysaat in zes nieuwe twee milliliter ronde bodem microcentrifugebuizen. Voeg vervolgens 1,5 milliliter ijskoud wasbuffer één toe aan elke buis met kralen en suspendeer de kralen opnieuw door te pipetteren. Na voorzichtig draaien gedurende één minuut, plaats de buizen terug in het magnetische rek gedurende drie minuten.

Gooi het supernatant weg en herhaal deze wasstap eenmaal. Gebruik 1,5 milliliter ijskoud wasbuffer twee en herhaal dezelfde wasprocedure tweemaal. Als de mRNP's efficiënt zijn geïsoleerd uit het protoplastenlysaat, zou er een halo zichtbaar moeten zijn rond de kralenpellet in het CL-monster.

Herhaal tenslotte de wasprocedure eenmaal met 1,5 milliliter ijskoude lage zoutbuffer. Voeg na het wassen 500 microliters elutiebuffer toe aan elke buis en suspendeer de kralen voorzichtig opnieuw door te pipetteren. Incubeer gedurende drie minuten bij 50 graden Celsius om de poly-A-staartige RNA's vrij te geven.

Suspendeer de kralen voorzichtig opnieuw door te pipetteren en plaats de buizen terug in het magnetische rek gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Breng en combineer eluenten uit alle zes buizen over in een 15 milliliter kegelvormige bodembuis geplaatst op ijs. Dit zal ongeveer drie millimeter eluent opleveren.

De kwaliteit en hoeveelheid RNA kan onmiddellijk worden bepaald met behulp van een spectrofotometer. Bereid de oligo-d(T)kralen voor om opnieuw te worden gebruikt door ze twee keer te wassen met één milliliter ijskoude elutiebuffer. Was ze vervolgens met één milliliter ijskoude lysis-bindingsbuffer om de zoutconcentratie terug te brengen naar 500 millimolar