Hoge resolutie smeltende PCR voor Complement Receptor 1 Lengte Polymorfisme Genotypering: Een Innovatief Gereedschap voor Alzheimer's Ziekte Geneesbaarheid Beoordeling
18 juli 2017
Hier beschrijven we een innovatieve methode om complementaire receptor 1 (CR1) lengte polymorfismen te bepalen voor gebruik bij verschillende toepassingen, met name de beoordeling van de gevoeligheid voor ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD). Deze methode kan nuttig zijn om de rol van CR1-isoformen beter te begrijpen bij de pathogenese van AD.
Het algemene doel van deze methode is om complement receptor 1 lengtepolymorfismen te genotyperen voor gebruik bij de beoordeling van vatbaarheid voor ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer, om de rol van CR1-isovormen in ziektepathogenese beter te begrijpen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van de neurowetenschappen, zoals de pathogenese van de ziekte van Alzheimer. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het geen verse bloedmonsters vereist en dat het eenvoudiger, goedkoper, sneller en daarom toepasbaar is op grotere populaties.
We kregen het idee voor deze methode toen we de uitdagingen herkenden bij het uitvoeren van Western blots met betrekking tot de benodigde tijd en de behoefte aan verse bloedmonsters. Pipetteer 20 microliters van proteinase K in de bodem van een buisje van 1,5 milliliter. Voeg vervolgens 200 microliters monster toe aan de buis.
Voeg 200 microliters lysebuffer toe aan het monster. Meng door middel van pulseren voor 15 seconden. Na het mengen, incubeer gedurende 10 minuten in een waterbad bij 56 graden Celsius.
Centrifugeer de buis van 1,5 milliliter kort om de druppels van de binnenkant van het deksel te verwijderen. Voeg vervolgens 100 microliters ethanol toe aan het monster. Meng opnieuw door middel van pulseren voor 15 seconden voordat u de buis opnieuw kort centrifugeert.
Breng het mengsel vervolgens voorzichtig aan op de membraankolom in een opvangbuisje van twee milliliter. Sluit het deksel zonder de rand nat te maken en centrifugeer gedurende één minuut bij 6.000 maal G. Plaats de membraankolom in een schone opvangbuis van twee milliliter en gooi de buis met het filtraat weg.
Open voorzichtig de membraankolom en voeg 500 microliters wasbuffer een toe zonder de rand nat te maken. Sluit het deksel en centrifugeer gedurende één minuut bij 6.000 maal G. Plaats vervolgens de membraankolom in een schone opvangbuis van twee milliliter en gooi de buis met het filtraat weg.
Na het voorzichtig openen van de membraankolom, voeg 500 microliters wasbuffer twee toe zonder de rand nat te maken. Sluit het deksel en centrifugeer gedurende drie minuten bij 20.000 maal G. Plaats vervolgens de membraankolom in een nieuwe opvangbuis van twee milliliter en centrifugeer opnieuw.
Na centrifugatie plaats de membraankolom in een schone buis van 1,5 milliliter en gooi de opvangbuis met het filtraat weg. Open voorzichtig de membraankolom en voeg 200 microliters gedistilleerd water toe. Incubeer de kolom gedurende vijf minuten op kamertemperatuur voordat u centrifugeert bij 6.000 maal G gedurende één minuut.
Om het HRM-PCR-protocol uit te voeren, verdun eerst de DNA-monsters in buisjes van 1,5 milliliter met water tot een concentratie van 10 nanogram per microliter. Verdun vervolgens de ontdooide primeroplossingen in buisjes van 1,5 milliliter met water tot dezelfde concentratie van zes micromolar. Ontdooi de HRM-PCR-kitoplossingen en meng voorzichtig door te vortexen om ervoor te zorgen dat alle inhoud wordt hersteld.
Centrifugeer de drie flacons met enzymatische mengsels met DNA-bindende kleurstof, magnesiumchloride en water kort in een microcentrifuge voordat u ze opent. Bereid in een buisje van 1,5 milliliter bij kamertemperatuur de PCR-mix voor voor een reactie van 120 microliter zoals beschreven in het tekstprotocol. Meng voorzichtig door te vortexen.
Het is van cruciaal belang dat u met aandacht en toepassing werkt volgens goede praktijken in de moleculaire biologie. Pipetteer 19 microliters van de PCR-mix in elk putje van een witte multi-well plaat. Voeg één microliter van de concentratie-aangepaste DNA-template toe en sluit vervolgens de witte multi-well plaat af met afdichtfolie.
Centrifugeer de witte multi-well plaat gedurende één minuut bij 1.500 maal G in een standaard swing-bucket centrifuge met een rotor voor multi-well platen met geschikte adapters. Laad de witte multi-well plaat in het HRM-PCR-instrument. Start het HRM-PCR-programma met de PCR-condities die in het tekstprotocol zijn te vinden.
Na de HRM-PCR-reactie voert u HRM-analyse uit om de CR1-lengtepolymorfie te bepalen zoals beschreven in het tekstprotocol. Fusiecurven werden geanalyseerd met behulp van de software na het smelten met hoge resolutie van de PCR-gederiveerde amplicons van het genomische DNA van proefpersonen met verschillende CR1-isovormen. De resultaten zijn curven die proefpersonen onderscheiden op basis van hun allotypische CR1-expressiefenotypen.
Zoals getoond door de twee presentatiemodi, genormaliseerde en verschoven smeltcurven en genormaliseerde en temp-verschoof verschilplot, zijn de curveprofielen verdeeld volgens de CR1-ster drie, CR1-ster één groep, de CR1-ster één, CR1-ster twee groep, de CR1-ster één groep, de CR1-ster twee groep en de CR1-ster twee, CR1-ster vier groep. Deze curven komen overeen met de CR1-lengtepolymorfie-allelen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de CR1-lengtepolymorfie eenvoudig kunt genotyperen volgens perfecte curven verkregen door HRM-PCR.
Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen vanwege de behoefte aan referentiemonsters van reeds bekende CR1-lengtegenotypen. Wanneer beheerst, kan deze techniek in vier uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om dezelfde concentratie voor elk DNA-monster te gebruiken.
Na deze procedure kunnen andere methoden zoals conische DNA-sequencing worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het vinden van een nieuw bekende private SNP. Na deze ontwikkeling baant deze techniek een weg voor onderzoekers op het gebied van populatiegenetica om de selectieve druk van pathogenen in CR1-lengtepolymorfie te onderzoeken. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de vatbaarheid voor pathogenese van de ziekte van Alzheimer, kan deze ook worden toegepast op andere ziektestudies zoals system
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuwe methode voor het genotyperen van lengtepolymorfismen van complementreceptor 1 (CR1), wat kan helpen bij het beoordelen van de vatbaarheid voor ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD). De techniek is voordelig omdat er geen verse bloedmonsters nodig zijn en deze efficiënter is voor grotere populaties.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Genetica
- Pathologie
Achtergrond
- CR1-isovormen zijn betrokken bij de pathogenese van de ziekte van Alzheimer.
- Inzicht in lengtepolymorfismen van CR1 kan aanwijzingen geven over de vatbaarheid voor de ziekte.
- Traditionele methoden zoals Western blots hebben beperkingen, waaronder de noodzaak van verse monsters.
- Deze methode is erop gericht om deze uitdagingen te overwinnen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het genotyperen van CR1-lengtepolymorfismen.
- Het beoordelen van de relatie tussen CR1-isovormen en de vatbaarheid voor de ziekte van Alzheimer.
- Het faciliteren van onderzoek naar populatiegenetica met betrekking tot CR1-polymorfismen.
Gebruikte methoden
- Monsterbereiding met behulp van proteinase K en lysisbuffer.
- High-resolution melting PCR (HRM-PCR) voor genotypering.
- Analyse van fusiecurves om CR1-expressiefenotypes te onderscheiden.
- Toepassing van de methode op diverse ziektestudies buiten de ziekte van Alzheimer.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een efficiënte genotypering van CR1-lengtepolymorfismen mogelijk.
- De resultaten tonen duidelijke smeltcurveprofielen die overeenkomen met verschillende CR1-allelen.
- De toepasbaarheid op grotere populaties zonder verse monsters is aangetoond.
- Potentieel voor verder onderzoek naar andere ziekten, zoals systemische lupus erythematosus en malaria.
Conclusies
- Deze innovatieve methode vergroot het inzicht in de rol van CR1 bij ziekten.
- Het biedt een praktische benadering voor grootschalige genetische studies.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar diverse ziekten die beïnvloed worden door CR1-polymorfismen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Genotypering van lengtepolymorfismen in complementreceptor 1 (CR1) maakt mechanistische risicoreductie bij de doelwitvalidatie voor de ziekte van Alzheimer mogelijk door de expressie van isovormen te koppelen aan pathways voor de klaring van amyloïde-bèta. Deze high-resolution melting PCR-methode biedt voorspellend vertrouwen voor het onderzoeken van therapeutische hypothesen zonder dat verse monsters nodig zijn, wat schaalbare screening in populatiegenetische studies ondersteunt. De aanpak verbetert de translationele continuïteit van ontdekking naar preklinische beoordeling van CR1-gemedieerde vatbaarheid voor de ziekte.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de correlatie tussen het polymorfisme in de lengte van CR1 en de capaciteit voor amyloïd-bèta fagocytose te analyseren.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie van complement-gemedieerde targets mogelijk met behulp van gearchiveerd DNA, waardoor de afhankelijkheid van verse biospecimens wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door de distributie van isovormen te kwantificeren die geassocieerd zijn met een veranderde complementregulatie in neurodegeneratieve pathways.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve HRM-curveratio's die CR1-allotypen onderscheiden voor betrouwbare genotypering in grote cohorten.
- Operationele waarde: Standaardiseert de detectie van ampliconen via de vergelijking van invariante en variante fragmenten, wat de reproduceerbaarheid tussen laboratoria waarborgt.
- Schaalbaarheid: Toepasbaar op populatiestudies vanwege de lage kosten, minimale inputvereisten en compatibiliteit met high-throughput PCR-platforms.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Legt een verband tussen het genotyperen van CR1-isovormen en pathofysiologische mechanismen bij de ziekte van Alzheimer en andere immuun-gemedieerde aandoeningen.
- Preklinische continuïteit: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door modellen te stratificeren op basis van profielen van het CR1-lengtepolymorfisme.
- Mechanistische risicoreductie: Verduidelijkt het potentieel voor target-engagement door het identificeren van proefpersonen met een veranderde CR1-gemedieerde klaring van pathogene peptiden.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie door genetisch gedefinieerde cohorten te leveren voor mechanistische screening en biomarker-uitlijning.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van de rol van CR1 bij de klaring van immuuncomplexen en neuro-inflammatoire pathways.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten voor de beoordeling van het effect van verbindingen in op CR1 gestratificeerde monsters.
- Analytica: Genereert op HRM gebaseerde ratio-metingen die statistische vergelijking van genotype-fenotype-associaties mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt genetische stratificatie met preklinische validatie van complement-gerichte therapieën, uitsluitend wanneer dit wordt ondersteund door bronmateriaal.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar genotyperingsplatform dat toepasbaar is op meerdere ziektegebieden buiten Alzheimer, inclusief infectieuze en auto-immuunziekten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in doelwitvalidatie via mechanische koppeling van CR1-isovormen aan ziektepathogenese.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid mogelijk gemaakt door closed-tube HRM-PCR en minimale monsterverwerking.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door verminderde biologische onzekerheid bij target engagement en modulatie van signaalpaden.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van complement-modulerende kandidaten op basis van genetisch gedefinieerde susceptibiliteitsprofielen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in PCR-optimalisatie en high-resolution melting curve-analyse.
- Afhankelijkheid van toegang tot HRM-geschikte instrumentatie en gevalideerde referentiegenotypen voor een nauwkeurige allel-identificatie.
- Noodzaak voor standaardisatie tussen teams van DNA-kwantificering en primer-verdunningsprotocollen om interlaboratorium-consistentie te waarborgen.
- Overwegingen voor adaptatie omvatten validatie over diverse monstertypen (bijv. bloed, speeksel) terwijl consistente amplicon-ratio's worden gehandhaafd.
- Praktische beperking: De nauwkeurigheid van de methode is afhankelijk van de beschikbaarheid van referentiemonsters met bekende CR1-lengtegenotypen voor de interpretatie van de curve.
