Een filtratie-gebaseerde methode om hoogwaardige kernen uit kruisgebonden skeletspier voor chromatine immunoprecipitatie te bereiden
6 juli 2017
Wij presenteren een protocol op basis van filtratie om hoogwaardige kernen te isoleren van de cross-linked museskeletspier waarbij we de behoefte aan ultracentrifugatie hebben verwijderd, waardoor het gemakkelijk toepasbaar is. We laten zien dat chromatine bereid uit de kernen geschikt is voor chromatine immunoprecipitatie en waarschijnlijk chromatin immunoprecipitatie sequencing studies.
Het algemene doel van deze experimentele procedure is om de voorbereiding van hoogwaardige kernen uit gekruiste skeletspieren mogelijk te maken, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor chromatine-immunoprecipitatie-onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het spier- en circadiane veld, zoals genomische studies met behulp van spierweefsels en -cellen in circadiane of andere tijdsgevoelige context. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het onmiddellijke kruising van monsters mogelijk maakt en de op filtratie gebaseerde procedure kan betrouwbaar worden uitgevoerd om hoogwaardige kernen te isoleren met minimale myofibril-besmetting.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in skeletspieren, kan deze ook worden toegepast op andere systemen zoals hart- en gladde spieren. Weeg en hak skeletspieren uit achterpoten van ongeveer 20 weken oude C57 zwarte zes mannelijke muizen in ijskou fosfaatgebufferde zoutoplossing zoals eerder beschreven. Plaats het gehakte skeletspierweefsel in een 50 milliliter conische buis met 10 milliliter PBS op ijs.
Centrifugeer vervolgens het monster gedurende vijf minuten bij 300 keer g bij vier graden Celsius. Verwijder voorzichtig het PBS-supernatant door aspiratie. Schat het pelletvolume in elke 50 milliliter buis in door referentiebuizen te gebruiken met één, twee, drie en vier milliliters water.
Voeg zeven volumes ijskou 1% formaldehyde en PBS toe en homogeniseer de monsters op ijs met behulp van een sondeweefselhomogenisator. Kruis vervolgens het monster door het gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te incuberen. Kwets de kruisingsreactie door één molair glycine toe te voegen tot een eindconcentratie van 0,125 molair, gevolgd door incubatie gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.
Na centrifugering van het monster gedurende vijf minuten bij 3.000 keer g bij vier graden Celsius, verwijdert u het supernatant via aspiratie. Spoel het pellet door het op te schorsen in 10 milliliters ijskou basisbuffer met vers toegevoegde proteaseremmers. Centrifugeer het monster opnieuw en verwijder voorzichtig het supernatant door aspiratie.
Schors vervolgens het pellet in zes milliliter lysisbuffer met vers toegevoegde proteaseremmers. Breng het monster over in een voorgekoelde 15 milliliter Dounce-homogenisator en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Dounce homogeniseer elk monster op ijs met 15 langzame slagen met een losse stamper, gevolgd door 15 slagen met een strakke stamper om de kernen vrij te maken.
De volgende filtratie-stappen zijn de sleutel tot isolatie van hoogwaardige kernen. Filter het homogenaat door een celzeef en spoel af met vier milliliters lysisbuffer. Centrifugeer vervolgens de monsters gedurende 10 minuten bij 1.000 keer g bij vier graden Celsius.
Schors het pellet in vijf milliliter ijskou basisbuffer en Dounce 10 keer met een strakke stamper om de kernen vrij te maken. Filter vervolgens de suspensie door een celzeef en spoel de buis af met twee milliliter basisbuffer en filter opnieuw. Herhaal de filtratie met celzeefjes met geleidelijk verkleinende poriëngrootte.
Centrifugeer ten slotte gedurende 10 minuten bij 1.000 keer g bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en schors het pellet in 500 microliters basisbuffer voordat u opnieuw centrifugeert. Gooi het supernatant weg en bewaar het pellet op min 80 graden Celsius.
Ontdooi de monsters in 500 microliters SDS-lysisbuffer en schors met voorzichtig pipetteren. Breng de nucleïnezuur-DNA-suspensie over in een glazen fles op ijs. Het kiezen van de juiste sonicatieplatform en -conditie is cruciaal voor chromatinevoorbereiding uit geïsoleerde kernen.
Voer de sonicatie uit met gefocuste uitbarstingen van ultrasone akoestische energie van een schijfvormige transducer met behulp van de instellingen die in het tekstprotocol zijn beschreven. Breng het gesoniceerde chromatine over in een 1,5 milliliter buis. Centrifugeer vervolgens gedurende 15 minuten bij 12.000 keer g en breng het supernatant over in een nieuwe buis.
Breng vervolgens 50 microliters van het gesoniceerde monster over in een nieuwe 1,5 milliliter buis voor omgekeerde kruising gedurende de nacht bij 65 graden Celsius. Het verzamelen van de DNA-monsters wordt beschreven in de volgende sectie. Na evaluatie van de sonicatie en kwantificering zoals beschreven in het tekstprotocol, verdeel het ontdooide chromatine in ongeveer 100 tot 120 microgram per buis.
Verdun vervolgens het chromatine één op tien met immunoprecipitatiebuffer. Voeg vervolgens 40 microliters van een 50%-slurry van BSA voorgeblokkeerde eiwit HE-agarose of IgY-kralen toe en incubeer gedurende drie uur bij vier graden Celsius op een roterende mixer. Na centrifugering van het monster gedurende 10 minuten bij 1.000 keer g, breng voorzichtig het supernatant over in nieuwe buizen.
Voeg vervolgens antilichamen toe bij één microgram antilichaam per 25 tot 100 microgram chromatine DNA. Roteer gedurende de nacht bij vier graden Celsius en ongeveer 15 rpm. Voeg vervolgens 10 microliters BSA voorgeblokkeerde eiwit HE-agarose of IgY-kralen toe en meng.
Roteer de kralensuspensie gedurende twee uur in de koude kamer. Was vervolgens de kralen met RIPA-buffer gevolgd door hoog-zoutbuffer, lithiumchloridebuffer en Tris EDTA zoals beschreven in het tekstprotocol. Na het wassen, elueer het DNA van de kralen door eerst gedurende één minuut bij 1.000 keer g te centrifugeren en voorzichtig het supernatant te verwijderen.
Schors de kralen met 50 microliters elutiebuffer. Incubeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 65 graden Celsius. Na incubatie, centrifugeer gedurende vijf minuten bij 12.000 keer g.
Verwijder het supernatant en voeg nogmaals 50 microliters elutiebuffer toe voordat u nogmaals gedurende vijf minuten bij 12.000 keer g centrifugeert. Het uiteindelijke elutievolume zal 100 microliters zijn. Om de omgekeerde kruising uit te voeren en DNA-elutie uit te voeren, incubeer eerst het eluteerde chromatine gedurende de nacht bij
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een op filtratie gebaseerd protocol voor het isoleren van hoogwaardige kernen uit cross-linked skeletspierweefsel van muizen. De methode elimineert de noodzaak voor ultracentrifugatie, waardoor het toegankelijker wordt voor onderzoekers. Het bereide chromatine is geschikt voor chromatine-immunoprecipitatie-studies.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Spierfysiologie
Achtergrond
- Belang van hoogwaardige kernen in genomische studies.
- Toepassing in circadian en tijdgevoelige onderzoek.
- Mogelijkheid voor inzichten in skelet-, hart- en gladde spiersystemen.
- Minimalisatie van myofibrillencontaminatie in monsters.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het isoleren van kernen uit skeletspierweefsel.
- Om chromatine-immunoprecipitatie-studies te vergemakkelijken.
- Om het begrip van spierweefsel in verschillende biologische contexten te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Vermalen skeletspierweefsel van de achterpoot van C57 zwarte zes mannelijke muizen.
- Gebruik van ijskoud fosfaatgebufferd zoutwater voor weefselbehoud.
- Implementatie van een op filtratie gebaseerde procedure voor kernisolatie.
- Doel op minimale besmetting tijdens het proces.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van hoogwaardige kernen uit skeletspierweefsel.
- Bereid chromatine is geschikt voor immunoprecipitatie-studies.
- Methode toont potentie voor bredere toepassingen in spieronderzoek.
- Aangetoond betrouwbaarheid en gebruiksgemak vergeleken met traditionele methoden.
Conclusies
- Het op filtratie gebaseerde protocol is effectief voor kernisolatie.
- Het biedt een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers in de spierbiologie.
- Toekomstige studies kunnen deze methode toepassen voor verschillende spiertypes.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolation of high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle is a critical bottleneck for chromatin immunoprecipitation (ChIP) and genomic studies in muscle biology. This filtration-based protocol enables reproducible preparation of nuclei with minimal myofibril contamination, supporting robust interrogation of protein-DNA interactions in time-sensitive and circadian contexts. The method enhances predictive confidence and workflow continuity for discovery-stage and translational muscle research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of chromatin-protein interactions in muscle tissue under physiological conditions.
- Supports mechanistic de-risking by preserving native DNA-protein complexes during nuclei isolation.
- Facilitates functional target validation for transcription factors and epigenetic regulators in muscle systems.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, high-quality nuclei preparations for downstream ChIP and sequencing assays.
- Improves assay reproducibility by minimizing myofibril contamination and sample variability.
- Enables quantitative evaluation of protein-DNA binding dynamics across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by allowing analysis of circadian and time-sensitive chromatin states in muscle tissue.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation for muscle-targeted therapeutics.
- Facilitates integration with next-generation sequencing for biomarker and pathway discovery.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling reliable chromatin analysis from early mechanistic studies to translational research in muscle biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of transcription factor binding and chromatin state in muscle tissue.
- Screening: Delivers reproducible nuclei preparations for ChIP and sequencing assay readiness.
- Analytics: Provides quantitative outputs via qPCR and sequencing for comparative analysis of binding events.
- Translational Research: Enables time-sensitive studies relevant to circadian biology and muscle disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable nuclei isolation workflow for multiple muscle tissue types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in chromatin-protein interaction studies and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes nuclei isolation, improving reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making by providing robust, high-quality input for downstream genomic assays.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of muscle-targeted discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, cross-linking, and filtration-based nuclei isolation.
- Needs access to sonication platforms, filtration devices, and qPCR or sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility across studies.
- Adaptable to other muscle types, including cardiac and smooth muscle, with protocol optimization.
- Sample integrity and temperature control are critical for consistent nuclei quality.
