Een filtratie-gebaseerde methode om hoogwaardige kernen uit kruisgebonden skeletspier voor chromatine immunoprecipitatie te bereiden

Het algemene doel van deze experimentele procedure is het mogelijk maken van de bereiding van hoogwaardige kernen uit gecrosslinkt skeletspierweefsel, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor chromatin immunoprecipitatie-studies. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het spier- en circadiane veld, zoals genomische studies met spierweefsels en -cellen in een circadiane of andere tijdgevoelige context. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het directe crosslinking van monsters mogelijk maakt en dat de op filtratie gebaseerde procedure betrouwbaar kan worden uitgevoerd om hoogwaardige kernen te isoleren met minimale contaminatie door myofibrillen.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in skeletspieren, kan zij ook worden toegepast op andere systemen, zoals hart- en gladde spieren. Weeg en snipper skeletspierweefsel uit de achterpoten, geïsoleerd van ongeveer 20 weken oude mannelijke C57 black six-muizen, in ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing zoals eerder beschreven. Plaats het gesnipperde skeletspierweefsel in een conische buis van 50 milliliter die 10 milliliter PBS bevat, op ijs.

Centrifugeer het monster vervolgens bij 300 ×g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder voorzichtig de PBS-supernatant via aspiratie. Schat het volume van de pellet in elke buis van 50 ml door referentiebuizen te gebruiken met één, twee, drie en vier milliliter water.

Voeg zeven volumes ijskoude 1% formaldehyde en PBS toe en homogeniseer de monsters op ijs met een probe-weefselhomogenisator. Crosslink vervolgens het monster door het 10 minuten bij kamertemperatuur te incuberen. Stop de crosslinking-reactie door toevoeging van één molair glycine tot een eindconcentratie van 0,125 molair, gevolgd door incubatie gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Na het centrifugeren van de sample bij 3.000 ×g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius, wordt het supernatant via aspiratie verwijderd. Spoel het pellet door het opnieuw te suspenderen in 10 milliliters ijskoude basisbuffer met vers toegevoegde protease-remmers. Centrifugeer de sample opnieuw en verwijder voorzichtig het supernatant via aspiratie.

Resuspendeer vervolgens het pellet in zes milliliter lysisbuffer met vers toegevoegde proteaseremmers. Breng het monster over naar een vooraf gekoelde Dounce-homogenisator van 15 milliliter en incubeer dit gedurende 10 minuten op ijs. Homogeniseer elk monster met de Dounce-homogenisator op ijs door 15 langzame slagen met een losse stamper uit te voeren, gevolgd door 15 slagen met een strakke stamper om de kernen vrij te maken.

De volgende filtratiestappen zijn essentieel voor het isoleren van kwalitatieve kernen. Filtreer het homogenaat door een celzeef en spoel dit af met vier milliliter lysisbuffer. Centrifugeer de monsters vervolgens 10 minuten lang bij 1.000 ×g bij vier graden Celsius.

Resuspendeer het pellet in vijf milliliter ijskoude basisbuffer en homogeniseer 10 keer met een nauwsluitende stamper van een Dounce-homogenisator om de kernen vrij te maken. Filtreer de suspensie vervolgens door een cell strainer en spoel de buis met twee milliliter basisbuffer en filtreer opnieuw. Herhaal de filtratie met cell strainers met een geleidelijk afnemende poriegrootte.

Centrifugeer tot slot bij 1.000 ×g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 500 µL basisbuffer voordat u opnieuw centrifugeert. Gooi het supernatant weg en bewaar de pellet bij minus 80 graden Celsius.

Ontdooi de monsters in 500 µL SDS-lysebuffer en resuspendeer door voorzichtig te pipetteren. Breng de suspensie van nucleaire DNA over naar een glazen flacon op ijs. De keuze van het juiste sonicatieplatform en de juiste condities is cruciaal voor de preparatie van chromatine uit geïsoleerde kernen.

Voer de sonicatie uit met gefocuste bursts van ultrasone akoestische energie van een schijfvormige transducer volgens de instellingen die in het tekstprotocol zijn beschreven. Breng het gesoniceerde chromatine over naar een buisje van 1,5 milliliter. Centrifugeer vervolgens bij 12.000 ×g gedurende 15 minuten en breng het supernatant over naar een nieuw buisje.

Breng vervolgens 50 µL van het gesoneerde monster over in een nieuwe buis van 1,5 mL voor reverse cross-linking gedurende de nacht bij 65 °C. Het oogsten van de DNA-monsters wordt beschreven in de volgende sectie. Na evaluatie van de sonificatie en kwantificering zoals beschreven in het tekstprotocol, wordt het ontdooide chromatine verdeeld in aliquoten van ongeveer 100 tot 120 µg per buis.

Verdun vervolgens het chromatine 1 op 10 met immunoprecipitatiebuffer. Voeg daarna 40 µL toe van een 50% slurry van BSA-geblokkeerd proteïne HE agarose of IgY-beads en incubeer dit drie uur op een rotator bij 4 °C. Na centrifugering van het monster bij 1.000 ×g gedurende 10 minuten, wordt het supernatant voorzichtig overgebracht naar nieuwe buisjes.

Voeg vervolgens antilichamen toe in een verhouding van 1 µg antilichaam per 25 tot 100 µg chromatine-DNA. Laat dit zachtjes roteren gedurende de nacht bij 4 °C en ongeveer 15 rpm. Voeg daarna 10 µL BSA-geblokkeerd proteïne HE-agarose of IgY-beads toe en meng.

Roteer de kraal-suspensie gedurende twee uur in de koude kamer. Was vervolgens de kralen met RIPA-buffer, gevolgd door hoog-zoutbuffer, lithiumchloridebuffer en Tris EDTA, zoals in detail beschreven in het tekstprotocol. Elueer na het wassen het DNA van de kralen door eerst te centrifugeren bij 1.000 ×g gedurende één minuut en het supernatant zorgvuldig te verwijderen.

Resuspendeer de kraaltjes met 50 µL elutiebuffer. Incubeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 65 °C. Centrifugeer na incubatie vijf minuten bij 12.000 ×g.

Verwijder het supernatant en voeg nog eens 50 µL elutiebuffer toe voordat u opnieuw centreert bij 12.000 ×g gedurende vijf minuten. Het uiteindelijke elutievolume zal 100 µL zijn. Om de cross-links ongedaan te maken en DNA-elutie uit te voeren, wordt het geëlueerde chromatine eerst een nacht geïncubeerd bij 65 °C.

Voeg vervolgens één µL RNase A toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C. Incubeer daarna met acht µL protease K (10 mg/mL) gedurende 30 minuten bij 55 °C. Win het DNA terug met behulp van een PCR-zuiveringskit met een elutievolume van 50 µL volgens het protocol van de fabrikant.

Analyse vervolgens de profielen via real-time QPCR zoals eerder beschreven. Sequentiële filtratie heeft weefselresten effectief verwijderd. Representatieve afbeeldingen van monsters na de initiële filtratie en na seriële filtratie worden hier ter vergelijking getoond.

Progressieve fragmentatie van chromatine via 10 cycli sonicatie wordt aangetoond door middel van agarosegelelektroforese. 10 cycli sonicatie van het gedigereerde chromatine resulteerden in DNA van ongeveer 500 baseparen. Hier worden representatieve QPCR-resultaten getoond voor B-mannetjes one chIP met muis skeletspierstalen verzameld bij ZT6 en ZT18.

Analyse van de Dbp-locatie-elementen op het Dbp-gen onthulde dat, in overeenstemming met eerdere resultaten, bindingspieken rond ZT6 optreden. Eenmaal beheerst, kan de preparatie van kernen in vijf tot zes uur worden voltooid als dit correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe filtratiegebaseerde methoden kunnen worden gebruikt om hoogwaardige kernen en chromatine-DNA te zuiveren uit gecrosslinkt spierweefsel.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat monsters op ijs of in een koelkamer moeten worden bewaard en dat monsteraliquoten moeten worden bewaard voor microscopische controle vóór en na de filtratiestappen. Na de ontwikkeling van deze techniek konden onderzoekers op het gebied van spieren en genomica de circadiane of tijdsgevoelige dynamiek van chromatine-eiwitinteracties in verschillende spierweefsels onderzoeken. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals chIP-sequencing, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het zoeken naar patronen van transcriptiefactorbinding in spierweefsels.