Name: Elektroconvulsietherapie vangsten bij ratten en versplintering van hun Hippocampi te onderzoeken van inbeslagneming-geïnduceerde veranderingen in postsynaptisch dichtheid eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Leer elektroconvulsieve aanvallen induceren bij ratten en hippocampusfractie uitvoeren om veranderingen in postsynaptische dichtheidseiwitten te onderzoeken. Deze methode helpt bij het bestuderen van synaptische plasticiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken dat Dr. Eric C. Bolton te gebruiken zijn centrifuge voor fractionering en Dr. Graham H. Diering in Dr. Richard L. Huganir lab aan de John Hopkins University voor het verstrekken van ons met het kleinschalige protocol voor de PSD fractionering.

Alle experimentele procedures, met inbegrip van dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd door de institutionele zorg van dieren en gebruik Comité bij de Universiteit van Illinois te Urbana-Champaign.
1. het behoud van een kolonie van de Rat
<ol><li>Fokken van Sprague-Dawley ratten (Zie de Tabel van materialen) en handhaven in standaardomstandigheden met een 12-h licht-donker cyclus en ad libitum toegang tot voedsel en water.</li>
	<li>Spenen van de rat pups op postnatale dag (P) 28, en huis ze in groepen van 2-4 mannelijke of vrouwelijke nestgenoten.</li>
	<li>Markeer de staarten van mannelijke ratten met een niet-giftige permanente zwarte marker voor identificatie.</li>
	<li>Weeg de mannelijke ratten 3 keer per week en het opnemen van hun bodyweights.</li>
</ol>2. voorbereiding van een ECS-Machine
<ol><li>7:30 am, desinfecteren van de Bank in de dierlijke bereidingslokaal en plaats een ECS-machine (pulse generator) op de Bank.</li>
	<li>Plaats een afzonderlijke mannelijke rat met een gewicht van 200-250 g in een schone en lege kooi met een deksel. Herhaal dit voor alle mannelijke ratten te worden behandeld met ECS inductie. Laat de rats koeien voor 30 min.</li>
	<li>Terwijl de ratten zijn fabriekslawaai in hun kooien, een puls generator voor ECS inductie ingesteld op de frequentie van 100 pulsen/s, een pulsbreedte van 0.5 ms, de duur van een schok van 0,5 s, en een stroom van 55 mA(Figuur 1).</li>
	<li>Bereid de puls generator door de "RESET" knop te duwen en ervoor te zorgen dat de "READY" knop brandt. Zorg ervoor dat de oor-clips zijn niet gekoppeld aan een puls generator en druk vervolgens op de knop "SHOCK" voor een paar seconden. Opmerking: op dit punt, de pulse generator is klaar voor ECS inductie.</li>
	<li>Sluit de oor-clips op de pulse generator.</li>
</ol>3. de inductie van Acute ECS
Opmerking: Zie Figuur 1B, bovenste paneel.
<ol><li>NAT van de oor-clips met een steriele zoutoplossing en ervoor te zorgen dat ze zijn verzadigd.</li>
	<li>De oren van een rat met steriele zoutoplossing NAT door inwikkeling ze in zoutoplossing doordrenkte gaas. Zodra ze nat zijn, verwijder het gaas.</li>
	<li>Bevestig één clip per oor, een positie die voorbij de belangrijkste kraakbeen band.</li>
	<li>Op de ECS machine bevestigen dat een ware lus is gevestigd; Als dat niet het geval is, verschijnt een foutbericht of een lezing van "1" op de machine.</li>
	<li>Draag een dik, niet-metalen handschoen. Terwijl de rat zachtjes in een gehandschoende hand, druk op de "SHOCK"-knop voor een paar seconden en langzaam laat de grip op de rat te observeren van de inbeslagneming. Voor de schijn "geen aanvallen" (NS) controle, behandelen de rat identiek maar leveren niet de huidige.</li>
	<li>Koppel de oor-clips zoals clonus begint en het gedrag van de inbeslagneming volgens een herziene Racine schaal22 , waarin "mond en gezicht bewegingen" (fase 1), "hoofd knikken" (fase 2), "voorpoot clonus" opnemen (fase 3), "fokken met voorpoot clonus" (fase 4), en "fokken en vallen met voorpoot clonus" (fase 5). Het beslag moet duren ongeveer 10 s; record de duur van de inbeslagneming met behulp van een timer.</li>
	<li>Terug na beëindiging van de inbeslagneming, de rat naar haar kooi. De rat voor een andere 5 min om er zeker van de terugwinning van de rat uit de vangsten controleren. Houd het afzonderlijk in de kooi waren gehuisvest en de kooi terug te keren naar de recovery room.</li>
	<li>Herhaal de ECS inductie op de volgende rat.</li>
	<li>Toezicht op de rats gedurende de rest van de dag en ten minste eenmaal in de ochtend en eenmaal in de middag de volgende dag totdat zij zijn euthanized voor experimenten. Opmerking: De ECS inductie methode kan leiden tot klinische symptomen als een incidentele bijwerking, waaraan aandacht moet worden. Bijvoorbeeld, kon het ECS inductie protocol aanvallen die langer dan 15 s en oorzaak onnodig leed aan de ratten duren induceren. In dit geval de inbeslagneming met diazepam (10 mg/kg, i.p.) of pentobarbital (25-30 mg/kg, i.p.) te beëindigen. Als de ratten ontwikkelt respiratoire lijden of ernstige gedrags afwijkingen na stopzetting van de inbeslagneming, euthanaseren hen na inademing kooldioxide gevolgd door onthoofding.</li>
</ol>4. de inductie van chronische ECS
Opmerking: Zie Figuur 1B, onderste paneel.
<ol><li>Induceren een ECS per dag op hetzelfde tijdstip in de ochtend zoals beschreven in stappen 1-3, hierboven, voor zeven opeenvolgende dagen.</li>
	<li>Monitor de rats tweemaal een dag nadat ze worden teruggestuurd naar hun huis kooien.</li>
</ol>5. de homogenisering en versplintering van Rat Hippocampi
Opmerking: Zie Figuur 2.
<ol><li>Voorbereiden van een nieuwe homogenisering buffer (oplossing A), die 320 mM sacharose, 5 mM natrium pyrofosfaat, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7.4 bevat, 200 nM "okadaic acid", en proteaseinhibitors. Filter-steriliseren van de buffer met behulp van filters met een 0,22 µm poriegrootte voor vacuüm filtratie en plaats deze op het ijs.</li>
	<li>Op een gegeven moment punt na acute ECS of chronische ECS (Figuur 1), de rat euthanaseren bij CO2 inademing gedurende 5-10 minuten, gevolgd door onthoofding met behulp van een guillotine.</li>
	<li>Verwijderen van de hersenen en het ontleden van de hippocampi op de metalen plaat geplaatst op het ijs, zoals eerder beschreven23,24.</li>
	<li>Plaats twee hippocampi van een rat op een 30-mm weefselkweek schotel en gehakt ze in kleine stukjes met behulp van schaar.</li>
	<li>Het gehakt hippocampi overbrengen in een handmatige glas homogenizer met behulp van een precisiepipet 1 mL en voeg 1 mL ijskoud homogenisering buffer (oplossing A, stap 5.1). Een ronde stamper invoegen in een glas homogenizer. Terwijl de homogenizer van het glas op ijs is, voorzichtig en gelijkmatig beroerte op en neer op de stamper 10 - 15 keer voor 1 min, tot kleine stukjes hippocampal weefsel verdwijnen.</li>
	<li>Het homogenaat overbrengen in een tube voor het microcentrifuge van 1,7 mL met behulp van een precisiepipet 1 mL en Centrifugeer het homogenaat bij 800 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C te scheiden van het postnuclear supernatant (S1 Fractie) van de pellet met onoplosbare weefsel en kernen (P1 breuk). Breng 50 µL en 950 µL van de S1 breuk twee aparte, nieuwe 1,7 mL microcentrifuge buizen met behulp van een precisiepipet 1 mL en opslaan van deze buizen op ijs. Sla de P1 breuk pellet op ijs.</li>
	<li>Centrifugeer de S1 breuk (950 µL) gedurende 10 minuten op 13,800 x g- en 4 ° C te scheiden van het supernatant (S2 Fractie), verrijkt met cytosolische oplosbare eiwitten, en de pellet (P2 Fractie), verrijkt met membraan-gebonden eiwitten, met inbegrip van synaptosomal eiwitten. De S2 fractie overbrengen in een nieuwe 1,7 mL microcentrifuge met behulp van een precisiepipet 1 mL en sla deze op het ijs.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet (P2 breuk) in 498 µL van ijskoude gezuiverd water met behulp van een precisiepipet 1 mL. Voeg 2 µL van 1 M HEPES (pH 7.4) met behulp van een pipet 20 µL om een eindconcentratie van 4 mM HEPES (pH 7.4). Incubeer bij 4 ° C met agitatie voor 30 min. winkel de geresuspendeerde P2 breuk op ijs.</li>
	<li>Bepaal de eiwitconcentratie van de S1, S2, en P2 fracties met behulp van een BCA assay. 50 mM HEPES (pH 7.4) toevoegen aan elke fractie bewaren bij-80 ° C tot gebruik te bereiken van een concentratie van 1 mg/mL, of verwerken van de breuk P2 te isoleren van de PSD.</li>
</ol>6. isolatie van de PSD van de ruwe membraan-eiwitoplossing (P2)
<ol><li>Centrifugeer de P2 breuk (500 µL) voor 20 min op 25.000 x g- en 4 ° C om te scheiden van het lysed supernatant (LS2 breuk) en de lysed pellet (LP1 breuk). De breuk van LS2 overbrengen in een nieuwe 1,7 mL microcentrifuge buis met behulp van een precisiepipet 1 mL en sla deze op het ijs.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet LP1 in 250 µL van 50 mM HEPES (pH 7.4) gemengd met 250 µL van 1% wasmiddel in 1 x PBS buffer met behulp van een precisiepipet 1 mL. Incubeer bij 4 ° C met zachte agitatie voor 15 min.</li>
	<li>Centrifugeren van de geresuspendeerde pellet LP1 gedurende 3 uur op 25.000 x g- en 4 ° C te scheiden van het supernatant (niet-PSD Fractie) van de pellet (PSD breuk). Verwijder de bovendrijvende vloeistof tot een microcentrifuge van 1,7 mL koker en resuspendeer de pellet PSD in 100 µL van 50 mM HEPES (pH 7.4) met behulp van een precisiepipet 200 µL.</li>
	<li>Bepaal de concentratie van de eiwitten van de LS2, niet-PSD en PSD fracties met behulp van een BCA assay. 50 mM HEPES (pH 7.4) toevoegen aan elke fractie bewaren bij-80 ° C tot gebruik te bereiken van een concentratie van 1 mg/mL. Opmerking: Alle oplossingen gebruikt in stap 5-6 (dat wil zeggen, oplossing A, HEPES-buffer en buffer PBS) moeten worden gemaakt met gezuiverde water vrij van Ionische en organische verontreinigende stoffen en deeltjes.</li>
</ol>7. het westelijke bevlekken
<ol><li>Ontdooi elke eiwitoplossing op ijs. 12 µL van elke breuk (S2 P2 en PSD in 1 mg/mL) overbrengen naar een nieuwe 1,7 mL microcentrifuge buis met behulp van een precisiepipet 20-µL.</li>
	<li>Voeg 3 µL van 5 x SDS monster buffer en Incubeer bij 75 ° C gedurende 30 minuten in een waterbad. Koel het monster tot kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>10 µL van het eiwit monster in elk putje van 4-20% helling 15-well kam SDS-polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) gel met behulp van een precisiepipet 20 µL laden. Stel de gel in het apparaat van de SDS-pagina en op 80-100 V in rijklare buffer (0,1% SDS; 25 mM Tris en 190 mM glycine pH 8.3). Opmerking: Elke gel moet bevatten EiwitSteekproeven van NS ratten en ECS ratten op verschillende tijdstippen na acute of chronische ECS.</li>
	<li>De eiwitten van de SDS-pagina gel overdracht naar een membraan polyvinyl difluoride (PVDF) in het apparaat van de overdracht in 25-30 V (60 mA) voor 9-12 h in overdracht buffer (25 mM Tris, 190 mM glycine en 20% methanol; pH 8.3).</li>
	<li>Verwijder het membraan PVDF uit het apparaat van de overdracht en wassen in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) gedurende 5 minuten op een multifunctionele rotator op RT.</li>
	<li>Blokkeren van de membraan in melk 5% en 0,1% Tween-20 in TBS voor 1 h. Incubeer het in primaire antilichamen (tabel 1) in wassen buffer (melk van 1% en 0,1% Tween-20 in TBS) overnachting op een multifunctionele rotator bij 4 ° C (Zie de Tabel van materialen voor verdunningen).</li>
	<li>Wassen van het membraan 4 keer voor elke 10 min in was buffer en het vervolgens uit te broeden met horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerd secundaire antilichamen in buffer voor 1 h wassen op een multifunctionele rotator op RT.</li>
	<li>Het wassen van het membraan 4 keer voor elke 10 min in was buffer en daarna bij TBS voor 5 min.</li>
	<li>Incubeer het membraan met verbeterde chemifluorescence substraat voor 1 min en worden blootgesteld aan een X-ray film. Ontwikkelen van de belichte film met een film-processor.</li>
</ol>8. kwantificering van Western Blots
<ol><li>Scan de Western blot als een TIFF-bestand en sla het bestand op de computer.</li>
	<li>De westelijke vlek-bestand openen in het programma ImageJ als een afbeelding in grijswaarden, onder "Bestand," "Afbeelding openen," pijl "grijstinten."</li>
	<li>Kies het rechthoekig gereedschap in de werkbalk ImageJ en teken een rechthoek dat betrekking heeft op een enkele westelijke vlek band van een proteïne van belang.</li>
	<li>Onder "Analyze," hit "Maatregel" om het gebied en de gemiddelde dichtheid van een geselecteerde band te verkrijgen.</li>
	<li>Verplaats de rechthoek naar een achtergrondgebied zonder het wijzigen van de grootte en vorm. Herhaal stap 8.4 op het gebied en de gemiddelde dichtheid van een achtergrond.</li>
	<li>Aftrekken van de waarde van de gemiddelde dichtheid van een band van de achtergrond van die van een westelijke vlek band, waardoor de dichtheid van de achtergrond-afgetrokken band van de proteïne van belang.</li>
	<li>Herhaal stap 8.2-8,6 voor alle westelijke vlek bands van belang.</li>
	<li>Verdeel de dichtheid van de achtergrond-afgetrokken band van de proteïne van belang door de dichtheid van de achtergrond-afgetrokken band van een huishouding gene product, zoals α-tubuline; deze stap levert de genormaliseerde waarde van de proteïne van belang.</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Hier beschrijven we een ECS inductie methode bij ratten die de globale stimulatie van neuronale activiteit in hun hippocampi lokt. ECS is een dierlijk model van elektroconvulsieve therapie, die klinisch wordt gebruikt voor de behandeling van drug vuurvaste depressieve stoornissen in mensen1,2,3. Ondanks gebruik van elektroconvulsieve therapie voor de behandeling van ernstige depressie, is de precieze onderliggende mechanisme ond...

Elektroconvulsieve therapie is gebruikt voor de behandeling van patiënten met grote depressieve stoornissen, met inbegrip van ernstige resistente depressie, bipolaire depressie, Parkinson ziekten en schizofrenie1,2. In deze therapie, wordt inbeslagneming gegenereerd door elektrische prikkel geleverd aan het hoofd van narcose patiënten via epicranial elektroden,1,,2,3. Herhaalde toediening van ECS is klinisch gunstig voor resistente depressieve stoornissen1,2,3. Het exacte mechanisme dat ten grondslag ligt aan de lange termijn effectiviteit van het antidepressivum effect bij de mens is echter gebleven ongrijpbaar. ECS is een dierlijk model van elektroconvulsieve therapie en wordt veel gebruikt om te onderzoeken zijn therapeutische mechanisme. Bij knaagdieren, zowel acute ECS en chronische ECS behandeling bevorderen van volwassen neurogenesis in het hippocampi en reorganiseren van het neuraal netwerk4,5, die waarschijnlijk zullen bijdragen tot verbeteringen in cognitieve flexibiliteit is. Bovendien, global hoogte van hersenactiviteit door ECS verandert de overvloed van afschriften, zoals een hersenen afgeleide neurotrope factor6en meerdere eiwitten, met inbegrip van metabotropic glutamaat-receptor 17 en de N-methyl-D-aspartaat (NMDA) type glutamaat receptor subeenheden7. Deze wijzigingen zijn betrokken bij het bemiddelen van langdurige wijziging van SYNAPS nummer, structuur en sterkte in de hippocampus7,8,9.
In ECS modellen, wordt elektrische stimulatie bezorgd bij knaagdieren via stereotaxically geïmplanteerde elektroden, hoornvlies elektroden of oor elektroden te roepen gegeneraliseerde tonic-klonische aanvallen10,11. Stereotaxic implantatie van elektroden hersenoperatie impliceert en vereist heel wat tijd aan het verbeteren van de experimentator chirurgische vaardigheden om te minimaliseren van de schade. Minder invasieve hoornvlies elektroden kon veroorzaken hoornvlies schuren en droogheid en anesthesie nodig. Het gebruik van oor-clip elektroden omzeilt deze beperkingen, omdat ze kunnen worden gebruikt op knaagdieren zonder chirurgie of anesthesie en minimale schade veroorzaken. Inderdaad, vonden we dat huidige geleverde te wakker ratten via de elektroden van de oor-clip betrouwbaar induceert stadium 4-5 tonic-klonische aanvallen en verandert van synaptic eiwitten in hun hippocampi10.
Om te onderzoeken de ECS-geïnduceerde overvloed van synaptic eiwitten in de specifieke hersengebieden van de knaagdieren, is het belangrijk om te kiezen van de experimentele methoden die meest geschikt voor de detectie en kwantificering zijn. Subcellular versplintering van de hersenen zorgt voor de ruwe isolatie van oplosbare cytosolische proteïnen; membraaneiwitten; organel-grenzen eiwitten; en zelfs eiwitten in speciale subcellular structuren, zoals de PSD-12,13,14. De PSD is een compact en overzichtelijk subcellular domein in neuronen waarin synaptic eiwitten sterk geconcentreerd op en in de buurt van het postsynaptisch membraan12,13,15 zijn. Het isolement van de PSD is handig voor de studie van synaptic eiwitten verrijkt op de PSD, sinds dynamische veranderingen in de omvang en de functie van postsynaptisch glutamaat receptoren, steigers eiwitten en signaaltransductie eiwitten in de PSD-12 , 15 , 16 , 17 zijn gecorreleerd met synaptische plasticiteit en de synaptopathy waargenomen in diverse neurologische aandoeningen17,18. Een vorige subcellular fractionering methode gebruikt voor het zuiveren van de PSD betrokken het isolement van de breuk wasmiddel onoplosbare uit de ruwe membraan van de hersenen door de differentiële centrifugeren van sacharose verlopen14, 19. de grote uitdaging met deze traditionele methode is dat er grote hoeveelheden knaagdieren brains14,19. Voorbereiding van 10-20 knaagdieren te isoleren van de Fractie van de PSD per behandeling vereist uitgebreide kosten en tijdsinvestering en is niet praktisch haalbaar als er vele behandelingen zijn.
Om te overwinnen deze uitdaging, hebben we een eenvoudiger methode die rechtstreeks isoleert van de PSD-breuk, zonder sacharose kleurovergang centrifugeren20,21, en herzien om te gelden voor PSD isolatie van de hippocampi van een enkele rat aangepast hersenen. Onze kleinschalige PSD fractionering methode levert over 30-50 µg van de PSD-eiwitten uit 2 hippocampi, voldoende voor gebruik in verschillende biochemische tests, met inbegrip van immunoprecipitation en westelijke bevlekken. Westelijke bevlekken toont het succes van onze methode voor het isoleren van de richtlijn betalingsdiensten door te onthullen een verrijking van het postsynaptisch dichtheid eiwit 95 (PSD-95) en de uitsluiting van de presynaptische marker synaptophysin en oplosbare cytoplasmatische eiwit α-tubuline. Onze ECS inductie en kleinschalige PSD fractionering methoden zijn gemakkelijk aan te passen aan andere knaagdieren hersengebieden en bieden een relatief eenvoudige en betrouwbare manier om te evalueren van de effecten van ECS op de expressie van PSD eiwitten.

<table><tbody><tr><td>Spargue-Dawley rat</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>ECS-leveringen</td></tr><tr><td>A pulse generator</td><td>Ugo Bsile, Comerio, Italy</td><td>57800</td><td>ECS-leveringen</td></tr><tr><td>MilliQ water purifying system</td><td>EMD Millipore</td><td>Z00Q0VWW</td><td>Subcellulaire fractioneringsleveringen</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Em science</td><td>SX 1075-3</td><td>Subcellulaire fractioneringsleveringen</td></tr><tr><td>Na4O7P2</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>221368</td><td>Subcellulaire fractioneringsleveringen</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>E9884</td><td>Subcellulaire fractioneringsleveringen</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H0527</td><td>Subcellulaire fractioneringsleveringen</td></tr><tr><td>Okadaic acid</td><td>TOCRIS</td><td>1136</td><td>Subcellulaire fractioneringsleveringen</td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor</td><td>Thermo Scientific</td><td>78429</td><td>Subcellulaire fractioneringsleveringen</td></tr><tr><td>NaVO3</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>72060</td><td>Subcellulaire fractioneringsleveringen</td></tr><tr><td>EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGPS05RE</td><td>Subcellulaire fractioneringsleveringen</td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>WPI (World Precision Instruments)</td><td>500216-G</td><td>Subcellulaire fractioneringsleveringen</td></tr><tr><td>30 mm tissue culture dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772B</td><td>Subcellulaire fractioneringsleveringen</td></tr><tr><td>Glass homogenizer and a Teflon pestle</td><td>VWR</td><td>89026-384</td><td>Subcellulaire fractioneringsleveringen</td></tr><tr><td>1.7 mL microcentrifuge tube</td><td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&nbsp;</td><td>C2170 (1001002)</td><td>Subcellulaire fractioneringsleveringen</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XT/XF Centrifuge&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>75004521</td><td>Subcellulaire fractioneringsleveringen</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>#23228</td><td>Western blot leveringen</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>#1859078</td><td>Western blot leveringen</td></tr><tr><td>SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE)</td><td>BIO-RAD</td><td>#4561086S</td><td>Western blot leveringen</td></tr><tr><td>Running Buffer</td><td>Made in the lab</td><td></td><td>Western blot leveringen.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel</td><td>BIO-RAD</td><td>#1658004</td><td>Western blot leveringen</td></tr><tr><td>Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane&nbsp;</td><td>Milipore</td><td>IPVH00010</td><td>Western blot leveringen</td></tr><tr><td>Transfer Buffer</td><td>Made in the lab</td><td></td><td>Western blot leveringen.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Western blot leveringen</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td>Western blot leveringen</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>436143</td><td>Western blot leveringen</td></tr><tr><td>Methanol&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>Western blot leveringen</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>detergent voor PSD-isolatie</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Module&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>#1703935</td><td>Western blot leveringen</td></tr><tr><td>Nonfat instant dry milk</td><td>Great value</td><td></td><td>Western blot leveringen</td></tr><tr><td>Multi-purposee rotator&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>Model-2314</td><td>Western blot leveringen</td></tr><tr><td>Hyblot CL Autoradiography Film</td><td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&nbsp;</td><td>E3018 (1001365)</td><td>Western blot leveringen</td></tr><tr><td>Enhanced chemifluorescence substrate&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td>Western blot leveringen</td></tr><tr><td>a Konica SRX-101A film processor</td><td>KONICA MINOLTA</td><td>SRX-101A</td><td>Western blot leveringen</td></tr><tr><td>Naam van het antilichaam</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PSD-95</td><td>Cell Signaling</td><td>#2507</td><td>Antilichaamverdunning = 1:500 - 1.000, tijd = 9 - 12 h, Reactietemperatuur = 4 &deg;C, Gastsoort = Konijn</td></tr><tr><td>Synaptophysine</td><td>Cell Signaling</td><td>#4329</td><td>Antilichaamverdunning = 1:500 - 1.000, tijd = 9 - 12 h, Reactietemperatuur = 4 &deg;C, Gastsoort = Konijn</td></tr><tr><td>alpha-Tubuline</td><td>Santacruz</td><td>SC-5286</td><td>Antilichaamverdunning = 1:500 - 1.000, tijd = 9 - 12 h, Reactietemperatuur = 4 &deg;C, Gastsoort = Muis</td></tr><tr><td>GluN2B</td><td>Neuromab</td><td>75-097</td><td>Antilichaamverdunning = 1:500 - 1.000, tijd = 9 - 12 h, Reactietemperatuur = 4 &deg;C, Gastsoort = Muis</td></tr><tr><td>GluA2</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Sab 4501295</td><td>Antilichaamverdunning = 1:500 - 1.000, tijd = 9 - 12 h, Reactietemperatuur = 4 &deg;C, Gastsoort = Konijn</td></tr><tr><td>STEP</td><td>Santacruz</td><td>SC-23892</td><td>Antilichaamverdunning = 1:200 - 500, tijd = 9 - 12 h, Reactietemperatuur = 4 &deg;C, Gastsoort = Muis</td></tr><tr><td>Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoReserch laboratory</td><td>715-035-150</td><td>Antilichaamverdunning = 1:2.000-5.000, tijd = 1 u, Reactietemperatuur = RT, Gastsoort = Ezel</td></tr><tr><td>Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoReserch laboratory</td><td>711-035-152</td><td>Antilichaamverdunning = 1:2.000-5.000, tijd = 1 u, Reactietemperatuur = RT, Gastsoort = Ezel</td></tr></tbody></table>

elektroconvulsietherapie vangsten bij ratten en versplintering van hun hippocampi te onderzoeken van inbeslagneming-geïnduceerde veranderingen in postsynaptisch dichtheid eiwitten

Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins

Elektroconvulsietherapie overname (ECS) is een experimentele diermodel van elektroconvulsieve therapie, de meest effectieve behandeling voor ernstige depressie. ECS induceert gegeneraliseerde tonic-klonische aanvallen met lage sterfte en neuronale dood en is een veel gebruikte model tot scherm anti-epileptische geneesmiddelen. Hier beschrijven we een ECS inductie methode in die een korte 55-mA stroom wordt geleverd voor 0,5 s aan mannelijke ratten 200-250 g in gewicht via oor-clip elektroden. Dergelijke bilaterale stimulatie geproduceerd etappe 4-5 klonische aanvallen die duurde ongeveer 10 s. Na de stopzetting van acute of chronische ECS sham meeste ratten hersteld te gedragsgestoorde niet te onderscheiden van "geen aanvallen" ratten. Omdat ECS wereldwijd hersenactiviteit verheft, heeft het ook te onderzoeken activiteit-afhankelijke wijzigingen van synaptic eiwitten en hun gevolgen voor synaptic kracht met behulp van meerdere methoden gebruikt. Subcellular versplintering van het postsynaptisch dichtheid (PSD) in combinatie met het westelijke bevlekken voorziet met name in de kwantitatieve bepaling van de overvloed aan synaptic eiwitten op deze gespecialiseerde synaptic structuur. In tegenstelling tot een vorige fractionering methode waarvoor grote hoeveelheid knaagdier hersenen, beschrijven we hier een kleinschalige fractionering methode om te isoleren van de PSD van de hippocampi van een enkele rat, zonder sacharose kleurovergang centrifugeren. Met behulp van deze methode, laten we zien dat de geïsoleerde PSD breuk postsynaptisch membraaneiwitten bevat, met inbegrip van PSD95, GluN2B en GluA2. Synaptophysin van de presynaptische marker en oplosbare cytoplasmatische eiwit α-tubuline werden uitgesloten van de PSD-breuk, tonen van succesvolle PSD isolatie. Bovendien daalde chronische ECS GluN2B expressie in de PSD, waaruit blijkt dat onze kleinschalige PSD fractionering methode kan worden toegepast om de opsporing van de wijzigingen in hippocampal PSD eiwitten uit een enkele rat na genetische, farmacologische of mechanische behandelingen .

Met behulp van de gedetailleerde procedure gepresenteerd hier, een elektrische schok (55 mA, 100 pulsen/s voor 0,5 s) geleverd via oor-clip elektroden geïnduceerde niet-terugkerende stadium 4-5 tonic-klonische aanvallen bij ratten (Figuur 1A-B). Een totaal 8 van ratten ontvangen van acute ECS inductie en weergegeven 4-5e etappe tonic-klonische aanvallen. De aanvallen duurde ongeveer 10 s en alle ratten binnen 1-2 min van inbeslagneming stopze...

Elektroconvulsietherapie overname (ECS) is een experimentele diermodel van elektroconvulsieve therapie voor ernstige depressie. ECS stimuleert wereldwijd activiteit in de hippocampus, wat leidt tot synaptogenese en synaptische plasticiteit. Hier beschrijven we methoden voor ECS inductie bij ratten en voor subcellular versplintering van hun hippocampi te onderzoeken van inbeslagneming-geïnduceerde veranderingen in synaptic eiwitten.

Elektroconvulsietherapie vangsten bij ratten en versplintering van hun Hippocampi te onderzoeken van inbeslagneming-geïnduceerde veranderingen in postsynaptisch dichtheid eiwitten

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS ...

Het algemene doel van de inductie van elektroconvulsieve aanvallen en de daaropvolgende kleinschalige fractionering van de hippocampus is om globale aanvalsactiviteit in de hersenen van de rat op te wekken, en om door aanvalsactiviteit geïnduceerde veranderingen van eiwitten in de postsynaptische dichtheid van de hippocampus te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over het neurale proces, zoals welke synaptische eiwitten in specifieke hersengebieden worden gereguleerd bij een aanval, en of dergelijke regulatie kan bijdragen aan neuroplasticiteit. Het belangrijkste voordeel van dit protocol voor de inductie van elektroconvulsieve aanvallen is dat we op een levende manier een globale verhoging van de hersenactiviteit van de rat kunnen induceren zonder neuronale sterfte.De procedure wordt gedemonstreerd door mijzelf en Han Gil Jeong uit het laboratorium van Dr. Hee Jung Chung. Om met deze procedure te beginnen, plaatst u een mannelijke rat in een schone, lege kooi met een deksel. Laat de rat 30 minuten wennen en stel vervolgens de pulsgenerator in voor ECS-inductie.Bereid de pulsgenerator voor door op de resetknop te drukken en controleer of het gereed-lampje brandt. Zorg ervoor dat de oorclips niet aan de pulsgenerator zijn bevestigd. Druk vervolgens enkele seconden lang op de schokknop en sluit daarna de oorclips aan op de pulsgenerator.Bevochtig in deze stap de oorclips met steriele zoutoplossing en zorg ervoor dat ze volledig verzadigd zijn. Bevochtig vervolgens de oren van de rat met steriele zoutoplossing door ze in met zoutoplossing gedrenkt gaas te wikkelen. Verwijder het gaas zodra de oren bevochtigd zijn.Bevestig de klemmen aan de oren met één klem per oor en positioneer deze voorbij de belangrijkste kraakbeenband. Druk enkele seconden op de schokknop en observeer de aanval. Behandel de rat voor de sham-groep (zonder aanvalscontrole) op identieke wijze, maar dien geen stroom toe.Zodra de clonus begint, worden de oorklemmen losgekoppeld en wordt het epileptisch gedrag geregistreerd volgens een herziene Racine-schaal van één tot vijf. Dit omvat oprijzen met clonus in vier ledematen bij stadium vier, en oprijzen en vallen met clonus in vier ledematen bij stadium vijf. De insulten moeten ongeveer 10 seconden duren.Registreer de duur van de aanval met een timer. Plaats de rat na het beëindigen van de aanval terug in de thuiskooi. Houd de rat nog vijf minuten in de gaten om er zeker van te zijn dat deze is hersteld van de aanvallen.Houd het dier individueel gehuisvest in de kooi en plaats de kooi terug in de herstelruimte. Plaats bij deze procedure twee hippocampi van één rat op een weefselkweekschaal van 30 mm en snijd deze met een schaar in kleine stukjes. Draag de versnipperde hippocampi vervolgens over naar een handmatige glazen homogenisator en voeg 1 mL ijskoud homogenisatiebuffer toe.Plaats vervolgens een rond pestel in een glazen homogenisator. Terwijl de glazen homogenisator op ijs staat, beweegt u de pestel 10 tot 15 keer voorzichtig en gestaag op en neer gedurende één minuut, totdat de kleine stukjes hippocampusweefsel zijn verdwenen. Draag het homogenisaat vervolgens met een 1 mL pipet over naar een 1,7 mL microcentrifugebuis en centrifugeer het homogenisaat 10 minuten lang bij 800 ×g bij 4 °C om het postnucleaire supernatant te scheiden van het pellet dat onoplosbaar weefsel en kernen bevat.Breng vervolgens 50 µL en 950 µL van de S1-fractie over naar twee afzonderlijke nieuwe microcentrifugebuisjes van 1,7 mL en bewaar deze buisjes op ijs. Bewaar daarnaast het pellet van de P1-fractie op ijs. Centrifugeer vervolgens de S1-fractie van 950 µL gedurende 10 minuten bij 13.800 ×g en 4 °C om het supernatant, verrijkt met cytosolische oplosbare eiwitten, te scheiden van het pellet, verrijkt met membraangebonden eiwitten, waaronder synaptosomale eiwitten.Breng de S2-fractie over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,7 milliliter en bewaar deze op ijs. Resuspendeer vervolgens het pellet van de P2-fractie in 498 microliters ijskoud gezuiverd water. Voeg twee microliters van een een molar heeps-oplossing toe om een eindconcentratie van vier millimolar heeps te bereiken.Incubeer de suspensie 30 minuten bij 4 °C onder agitatie. Bewaar de geresuspendeerde P2-fractie na 30 minuten op ijs. Centrifugeer in deze stap de P2-fractie 20 minuten bij 25.000 ×g en 4 °C om het gelyseerde supernatant en het gelyseerde pellet te scheiden.Overbreng de LS2-fractie naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,7 milliliter en bewaar deze op ijs. Resuspendeer vervolgens het LP1-pellet in 250 microliters 50 millimolar heeps, gemengd met 250 microliters één procent detergent en 1 X PBS. Incubeer de suspensie gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius onder zachte agitatie.Centrifugeer vervolgens het resuspendere LP1-pellet gedurende 3 uur bij 25, 000 ×g en 4 °C om het supernatant van de niet-PSD-fractie te scheiden van het pellet van de PSD-fractie. Verplaats het supernatant naar een microcentrifugebuisje van 1,7 ml en resuspendeer het PSD-pellet in 100 µL 50 mM HEPES. In deze figuur tonen de representatieve western blots de eiwitexpressie van de NMDA-receptorsubunit GluN2B, de AMPA-receptor GluA2 en STEP 61 in de S2-, P2- en PSD-fracties van de hippocampi van sham-ratten, ratten zonder insulten en ratten die acute ECS ontvingen.Het cytoplasmatisch oplosbare eiwit alpha-tubuline is verrijkt in de S2-fractie. Synaptofysine is een presynaptisch blaasjeseiwit en is verrijkt in de ruwe membraan-P2-fractie, maar niet in de PSD-fractie, terwijl PSD-95 verrijkt is in zowel de P2- als de PSD-fracties. Hier wordt de kwantificering van GluN2B en GluA2 in de P2- en PSD-fracties getoond op drie en 24 uur na acute ECS.De expressie van GluN2B en GluA2 in de P2-fractie werd genormaliseerd ten opzichte van alpha-Tubulin in de S2-fractie. De expressie van GluN2B en GluA2 in de PSD-fractie werd genormaliseerd ten opzichte van PSD 95 in de PSD-fractie. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in vijf tot zes uur worden voltooid mits correct uitgevoerd.Na deze procedure kan auto-masser zoals massa-spectrometrie op basis van eiwitmixen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over welke andere synaptische eiwitten door ECS worden beïnvloed. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van neurologische aandoeningen om het onderliggende mechanisme van synaptische dysfunctie te onderzoeken, om zo acties in law-dons, trans-gen-ing motoren van neurologische aandoeningen uit te voeren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u ECS induceert in law-dons, hoe u homogenisatie en PSD-fractionering van de hippocampi uitvoert en hoe u veranderingen in synaptische eiwitten na ECS onderzoekt.

electroconvulsive-seizures-rats-fractionation-their-hippocampi-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates electroencephalographic (EEG) recording of epileptic seizures in epilepsy-induced rats. A rat with electrodes implanted in the ventral hippocampus is connected to the EEG recording system and placed in a plexiglass chamber. The rat is allowed to move freely while the brain activity is recorded to monitor the occurrence of seizures.

Electroencephalographic Recording of Epileptic Seizures in Epilepsy-Induced Rats

Source: Soukupová, M., et al. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the assessment of extracellular excitatory neurotransmitter levels in rats with chronic epilepsy induction. After implanting a microdialysis probe into the brain and confirming the absence of seizures using electroencephalography (EEG), extracellular fluid is collected to evaluate elevated neurotransmitter levels in epileptic rats. A...

Assessment of Excitatory Neurotransmitter Levels in Chronic Epilepsy-Induced Rats

Source: Jang, S., et al, Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the induction of an acute electroconvulsive seizure (ECS) in a rat model to study seizure-induced neuroplasticity. Researchers apply electrical stimulation via ear-clip electrodes, triggering neuronal hyperexcitability and clonus. This model helps investigate synaptic plasticity, seizure...

Inducing an Acute Electroconvulsive Seizure in a Rat Model

Deze video introduceert de voorbereiding, registratie en bronanalyse procedures van hoge resolutie EEG op gesedateerde ratten met een specifiek preklinisch model van focale epilepsie onder niet-invasieve omstandigheden.

Brain Bron Imaging in preklinisch Rat Modellen van focale epilepsie met behulp van High-Resolution EEG Recordings

Dit gedetailleerde protocol beschrijft transcraniale stimulatie de plaatsing van de elektroden op het bot temporale te onderzoeken van de effecten op korte en lange termijn van de elektrische stimulatie transcranial in ratten vrij te verplaatsen.

Chronische Transcraniële elektrische stimulatie en Intracortical opname in ratten

We illustreren hoe u opnemen en elektrische modulatie van 4-aminopyridine-geïnduceerde epileptiform activiteit in knaagdier hersenen segmenten met behulp van micro-elektrode arrays. Een aangepaste opname-kamer onderhoudt weefsel levensvatbaarheid in langdurige experimentele sessies. Leven van de elektrode toewijzing en selectie van stimulerende paren worden uitgevoerd door een aangepaste grafische gebruikersinterface.

Opname en moduleren van Epileptiform activiteit in knaagdier hersenen plakjes gekoppeld aan micro-elektrode Arrays

Acute inbeslagneming modellen zijn belangrijk voor de studie van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de epileptiform gebeurtenissen. Bovendien biedt de mogelijkheid om het genereren van epileptiform evenementen op afroep een zeer efficiënte methode om te bestuderen van de exacte volgorde van de gebeurtenissen ten grondslag liggen aan hun inleiding. Hier beschrijven we de acute 4-aminopyridine corticale inbeslagneming modellen gevestigd in muis en menselijk weefsel.

Generatie en On-Demand inleiding van Acute Ictale activiteit in knaagdier en menselijk weefsel

Hier beschrijven we een methode voor in vivo microdialysis analyseren aspartaat en glutamaat release in de ventrale hippocampus voor epileptische en niet-epileptische rats, in combinatie met EEG-opnames. Extracellulair concentraties aspartaat of glutamaat kunnen worden gecorreleerd met de verschillende fasen van de ziekte.

Microdialysis van Excitatory aminozuren tijdens EEG opnames in vrij bewegende ratten

De uitdaging van epilepsie onderzoek is het ontwikkelen van nieuwe behandelingen voor patiënten waar klassieke therapie ontoereikend is. Met behulp van een nieuw protocol-met de hulp van een implanteerbare Drug Delivery System-zijn we in staat om aanvallen in verdoofd muizen controle door de elektroforetische levering van GABA in de epileptische focus.

Elektroforetische levering van γ-aminoboterzuur zuur (GABA) in epileptische focus voorkomt aanvallen bij muizen

Het gepresenteerde protocol beschrijft het transport en de voorbereiding van resected menselijk hippocampal weefsel met het uiteindelijke doel om vitale hersenenplakjes te gebruiken als een preklinische evaluatie tool voor potentiële anti-epileptica.

Voorbereiding van acute menselijke hippocampal slices voor elektrofysiologische opnames

Dit rapport beschrijft de methoden om een model van temporale kwab epilepsie te genereren op basis van de elektrische aanmaakhoutjes van transgene VGAT-Cre muizen. Ontstoken VGAT-Cre-muizen kunnen nuttig zijn bij het bepalen van de oorzaak van epilepsie en voor het screenen van nieuwe therapieën.

Voorbereiding en implantatie van elektroden voor elektrisch aanmaakhout VGAT-Cre muizen om een model voor temporale kwab epilepsie te genereren

Leer elektroconvulsieve aanvallen induceren bij ratten en hippocampusfractie uitvoeren om veranderingen in postsynaptische dichtheidseiwitten te onderzoeken. Deze methode helpt bij het bestuderen van synaptische plasticiteit.

Elektroconvulsietherapie vangsten bij ratten en versplintering van hun Hippocampi te onderzoeken van inbeslagneming-geïnduceerde veranderingen in postsynaptisch dichtheid eiwitten (Video) | JoVE Journal

Elektroconvulsietherapie vangsten bij ratten en versplintering van hun Hippocampi te onderzoeken van inbeslagneming-geïnduceerde veranderingen in postsynaptisch dichtheid eiwitten

Meer video's verkennen