Name: Engraftment van de tumor in een muismodel van Xenograft van menselijke mantel cel lymfoom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Leer hoe je een xenograft muismodel opzet voor mantelcellymfoom om behandelstrategieën te ontwikkelen. Deze methode maakt in vivo-studie van geneesmiddelen op menselijke lymfoomcellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Ligue Genevoise contre le Cancer, Fondation Dr. Dubois Ferriere Dinu-Lipatti, Oncosuisse KPS-OCS, OCS-02260-08-2008 en 2914-02-2012, en de Zwitserse nationale Science Foundation Grant 31003A_156760 en 310030-153456.

De menselijke bloedmonsters werden gebruikt volgens de procedures die zijn goedgekeurd door de lokale ethische en menselijke experimenten comités van het universitair ziekenhuis van Genève.
Dierlijke procedures werden uitgevoerd overeenkomstig de institutionele ethisch comité van Animal Care in Genève, Zwitserland en de kantonnale Veterinair Bureau (autorisatienummer: GE/26/15).
1. bereiding van primaire perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) door dichtheid verlopende scheiding
Opmerking: 3-5 mL van perifeer bloed is verkregen uit patiënten presenteren met MCL in een leukemische fase. De diagnose was opgericht volgens de standaard diagnostische criteria voor stroom cytometry (CD5 +, CD23−, CD200 +, monoklonaal B-celpopulatie), en vervolgens bevestigd door de aanwezigheid van de chromosomale translocatie t(11;14) en overexpressie van cycline D1. In alle gevallen monoclonal B-cellen gevormd voor > 90% van de totale B-celpopulatie. De resterende cellen waren voornamelijk monocyten en sommige T-cellen.
<ol><li>Verdun (1:1) 5 mL bloedmonster MCL met 5 mL Roswell Park Memorial Instituut voedingsbodem 1640 (RPMI) (figuur 1A).</li>
	<li>Omkeren van de dichtheid kleurovergang media (Tabel of Materials) meerdere malen vóór gebruik om homogenisatie van het mengsel.</li>
	<li>Voeg 5 mL van de kleurovergang media dichtheid in een tube van 15 mL centrifuge met behulp van een pipet aspirator.</li>
	<li>Zachtjes laag het bloedmonster van het verdunde op de dichtheid kleurovergang media in de centrifugebuis van 15 mL met behulp van een aspirator (het bloed dichtheid kleurovergang media verhouding moet 2:1, bijvoorbeeld, 10 mL bloed tot 5 mL van de kleurovergang media dichtheid). Worden moet gewaakt om niet mix de twee lagen (figuur 1B, C).</li>
	<li>Centrifugeer het monster bij 400 x g gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur met de remmen van de centrifuge uitgeschakeld.</li>
	<li>Voorzichtig de middelste laag (witachtige, dunne ring gemarkeerd met een pijl (Figuur 1 d, E)) met behulp van een steriele Pipet van Pasteur, gecombineerd met de mononucleaire cellen en ze vervolgens overbrengen naar een schone buis.</li>
	<li>Wassen van mononucleaire cellen<ol>
<li>Schatten van de omvang van de overgedragen celsuspensie en toevoegen aan het 3 delen van steriele 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 1% bovien serumalbumine (BSA).</li>
		<li>Meng de opschorting door pipetteren op en neer meerdere malen.</li>
		<li>Centrifugeer de schorsing bij 400-500 x g gedurende 10-15 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder het supernatant voor het verkrijgen van de cel pellet en herhaal nogmaals het wassen stap.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in het gewenste volume, bijvoorbeeld, 1 of 2 mL PBS.</li>
		<li>Het aantal cellen door een geautomatiseerde cel teller of handmatig met behulp van een hemocytometer (Neubauer kamer).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. de verrijking van B-cellen door B-cel negatieve selectie
<ol><li>De cellen in PBS om een eindconcentratie van 50 x 106 cellen/mL verdund.</li>
	<li>De cellen overbrengen in een 5 mL ronde onderkant polystyreen buis. Voeg 100 µL van antilichaam cocktail uit de B-cel verrijking kit 2 ml celsuspensie, en meng zachtjes door pipetteren op en neer (Figuur 2-1).</li>
	<li>Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Kort vortex de magnetische deeltjes voorziet in de B-cel verrijking kit 30 s (Figuur 2-2). Voeg 150 µL van de magnetische deeltjes tot 2 mL van het monster.</li>
	<li>Incubeer het monster voor een andere 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Het monstervolume brengen door 2,5 mL met 1 x PBS met 2% foetaal kalfsserum (FCS) en 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA). Plaats de buis in de magneet en Incubeer de buis voor een ander 3-5 min (Figuur 2-3).</li>
	<li>Halen van de magneet met de buis op zijn plaats, en in een continue beweging, decanteren in de buis zodat de verrijkte celsuspensie wordt verzameld in een verse buis (Figuur 2-4). De cellen door een geautomatiseerde cel teller of handmatig met behulp van een hemocytometer te verkrijgen van de totale opbrengst van de B-cellen tellen. Opmerking: Het rendement is meestal ~ 105 B cellen/mL voor normale B-cellen en 5-50 x 106 cellen/mL voor MCL.</li>
	<li>Bevestiging van de zuiverheid van de verrijking van de B-cel<ol>
<li>Nemen ~ 50.000 cellen en Incubeer de cellen met anti-CD19/CD20 antilichamen (1:20 verdunning) en anti-CD45 antilichaam gekoppeld aan verschillende fluorochromes (1:10 verdunning) bij kamertemperatuur gedurende 15-30 minuten.</li>
		<li>Met 1 mL 1 x PBS + 1% BSA wassen, centrifugeren van de cellen bij 400-500 x g gedurende 5 min en resuspendeer de cellen in ~ 200 µL van PBS.</li>
		<li>De celsteekproeven verwerven door stroom cytometry en te analyseren voor de zuiverheid van B-cellen. Zuiverheid is meestal > 90% door deze methode (Figuur 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ontwikkeling van het Model van de muis Xenograft
<ol><li>Schorten ~ 40-60 x 106 cellen in 150-200 µL van 1 x PBS (volume nodig is om te injecteren per muis).</li>
	<li>150 µL van de celsuspensie intraveneus injecteren (i.v.) in elke ader van de staart van 6-7 week oud immunodeficiëntie knik scid gamma (NSG) muizen ongeacht het geslacht (figuur 4A).</li>
	<li>Laat de muizen te ontwikkelen van menselijke lymfoom ~ 10 weken. Opmerking: Primaire menselijke lymfoom cellen veel langer duren om te ontwikkelen van de tumor ten opzichte van menselijke lymphoma cellijnen (~ 3 weken).</li>
	<li>Wanneer de dieren beginnen te symptomen vertonen van een dodelijke ziekte als gewichtsverlies, offeren gegolfde haar, verminderde activiteit, hind-limb verlamming, enz., de muizen door CO2 verstikking gevolgd door cardiale hart punctie te verkrijgen van bloed.</li>
	<li>Verzamel verschillende organen zoals beenmerg, milt en lever door het ontleden van de muizen en verzamelen van perifeer bloed door het bloed van het hart tekenen op het moment van offer voor tumor engraftment analyse (figuur 4B -F).</li>
</ol>4. chimerism analyse van Tumor cel geaccepteerd in verschillende organen
<ol><li>Na het verzamelen van de verschillende organen, verwerken door mechanische verstoring voor het genereren van eencellige schorsingen na lysis van de rode bloedcellen (RBC) met behulp van 200 µL 1 x ammoniumchloride kalium buffer voor bloed en het beenmerg, 500 µL voor milt en 2 mL voor lever .</li>
	<li>Tellen en vlekken van de cellen met behulp van menselijke B-cel specifieke antilichamen, dat wil zeggen, anti-CD19, anti-CD20 en anti-CD45. Opmerking: NSG muizen geen B-cellen en vandaar p.a., cellen zijn gekleurd met menselijke specifieke B-cel markeringen.</li>
	<li>Het analyseren van de cellen die elk orgel door stroom cytometry afgeleid door gating op B cellen (CD19 + CD20 +, CD45 +).</li>
	<li>Kwantificeren van de werk tumorcellen in verschillende organen afgeleid van MCL geïnjecteerd muizen op basis van de gated cellen zoals aangegeven in stap 4.3 (Figuur 4 g). Opmerking: Zie Tabel van materialen voor details.</li>
</ol>

<ol><li>Baggiolini, M., Dewald, B., Moser, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chemokines%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human chemokines: an update.</a> Annu Rev Immunol. 15, 675-705 (1997).</li>
<li>Baggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+leukocyte+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemokines and leukocyte traffic.</a> Nature. 392, 565-568 (1998).</li>
<li>Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaneway%2C+CA+%22Immunobiology%3A+The+Immune+System+in+Health+and+Disease%22">Immunobiology: The Immune System in Health and Disease</a>. , 5th edition, (2001).</li>
<li>De Silva, N. S., Klein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+B+cells+in+germinal+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of B cells in germinal centres.</a> Nat Rev Immunol. 15 (3), 137-148 (2015).</li>
<li>Cohen, P. L., Kurtin, P. J., Donovan, K. A., Hanson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+and+peripheral+blood+involvement+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow and peripheral blood involvement in mantle cell lymphoma.</a> Br. J. Haematol. 101, 302-310 (1998).</li>
<li>Meusers, P., Hense, J., Brittinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mantle+cell+lymphoma%3A+diagnostic+criteria%2C+clinical+aspects+and+therapeutic+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Mantle cell lymphoma: diagnostic criteria, clinical aspects and therapeutic problems.</a> Leukemia (Baltimore). 11 (Suppl 2), S60-S64 (1997).</li>
<li>Herrmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+overall+survival+in+advanced+stage+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Improvement of overall survival in advanced stage mantle cell lymphoma.</a> J Clin Oncol. 27 (4), 511-518 (2008).</li>
<li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensive+treatment+strategies+may+not+provide+superior+outcomes+in+mantle+cell+lymphoma%3A+overall+survival+exceeding+7+years+with+standard+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intensive treatment strategies may not provide superior outcomes in mantle cell lymphoma: overall survival exceeding 7 years with standard therapies.</a> Ann Oncol. 19 (7), 1327-1330 (2008).</li>
<li>Iyengar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+human+primary+mantle+cell+lymphoma+engraftment+in+NSG+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of human primary mantle cell lymphoma engraftment in NSG mice.</a> Br J Haematol. 173 (1), 165-169 (2016).</li>
<li>Klco, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+genetically+defined+subclones+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of genetically defined subclones in acute myeloid leukemia.</a> Cancer cell. 25 (3), 379-392 (2014).</li>
<li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tumor+xenografts+as+predictive+preclinical+models+for+anticancer+drug+activity+in+humans%3A+better+than+commonly+perceived-but+they+can+be+improved%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved.</a> Cancer Biol Ther. 2 (4 Suppl 1), S134-S139 (2003).</li>
<li>Johnson, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+drug+activity+in+NCI+preclinical+in+vitro+and+in+vivo+models+and+early+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials.</a> Br. J. Cancer. 84, 1424-1431 (2001).</li>
<li>Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+drug+response+in+patients+and+in+the+clonogenic+assay+with+solid+human+tumour+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Correlation of drug response in patients and in the clonogenic assay with solid human tumour xenografts.</a> Eur. J. Cancer. 26, 901-905 (1990).</li>
<li>Doñate, C., Vijaya Kumar, A., Imhof, B. A., Matthes, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27256571">Frontline Science: Anti-JAM-C therapy eliminates tumor engraftment in a xenograft model of mantle cell lymphoma.</a> J Leukoc Biol. 100 (5), 843-853 (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Klinische proeven zijn mogelijk voor drugs die zijn in een vergevorderd stadium van ontwikkeling, maar kunnen niet worden gebruikt voor drugontdekking. Inspanningen voor de ontwikkeling van dierlijke ontvangers voor menselijke cel xenotransplantatie om te testen van de vroege fase drugs zijn lang uitgeoefend. Hier presenteren we een dierlijk model dat vermijdt menselijke graft afwijzing en een model voor ziekten bij de mens, zoals MCL tot stand kan brengen. Dit is op dit moment een van de modernste xenograft model te bes...

Lymfocyten door de natuur een belangrijke rol spelen in de immuun toezicht en lymfocyt mensenhandel is een cruciale stap in de montage van antigeen specifieke immuniteit1,2. Dit proces omvat migratie van naïeve T lymfocyten van de thymus naar de bloedstroom, en vandaar naar secundaire lymfoïde organen, met inbegrip van lymfklieren, Peyer de patches, of milt, waar ze elkaar ontmoeten cognaat antigenen. De B-lymfocyten onderscheiden in het beenmerg en in de follikels van secundaire lymfoïde organen3als naïef cellen migreren. Sommige van deze B-cellen antigeen met hun receptor binden en worden geactiveerd door specifieke T-cellen. Proliferatie en differentiatie van deze B-cellen duwt de niet-geactiveerde, naïef B-cellen in de zone van de mantel van de follikel. Geactiveerde cellen kunnen dan onderscheid worden gemaakt in het geheugen B cellen, die het lichaam patrouilleren, of oudere in immunoglobulin afscheidende plasmacellen die naar het beenmerg4 migreren.
MCL treedt op als naïef B lymfocyten in de mantel zone tot een tumor omvormen. Deze cellen van het lymfoom bevinden zich in de communicatie van de lymfoïde organen en vermenigvuldigen onafhankelijk van specifieke T-lymfocyten controle. Echter, in een bepaalde fase van dichtheid ze ontsnappen uit deze niche en recirculate in de bloedbaan op zoek voor niches in andere organen. Gezien de complexiteit van celadhesie-moleculen en de promiscuïteit van chemokines en hun receptoren, het mechanisme van deze cellulaire mensenhandel in vivo slecht wordt begrepen en daarom belemmert therapie. Nieuwe methoden nodig zijn om effectief blokkeren dit migratieproces om te voorkomen dat de cellen van het lymfoom B bereiken van nieuwe microenvironments.
MCL is één van de meest moeilijk te behandelen van B-cel maligniteiten. De ontwikkeling van een neoplastische fenotype van MCL is het resultaat van een meerstaps cascade, gekenmerkt door de acquisitie van unieke biologische eigenschappen. Op het moment van diagnose presenteren de meeste patiënten (70%) al met een gedissemineerde ziekte, met een meerderheid van gevallen extranodal betrokkenheid in de milt, het beenmerg en/of de gastro-intestinale tractus5,6tentoonstellen. Bij behandelde patiënten is herval door resistente tumoren binnen een paar jaar gebruikelijk, hoewel conventionele chemotherapie hoge kwijtschelding tarieven op korte termijn7,8 induceert. Hier presenteren we een nieuw model van de ziekte die kan helpen bij het begrijpen van de MCL verspreiding en de onderliggende biologie: we vastgesteld een menselijke MCL xenograft muismodel dat afkomstig van de primaire tumorcellen van patiënten is. Wij hopen dat dit model helpen zal ontwikkelen van therapeutische strategieën MCL verspreiding tegen te gaan, en eventueel nieuwe klinische perspectieven bieden voor optimale diagnose en behandeling van recidiverende patiënten.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-paque media</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>voor scheiding van mononucleaire cellen</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco-Life technologies</td><td>61870-010</td><td>voor verdunning van bloedmonster</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>wassen van cellen</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td>voor bereiding van PBS met 1% BSA gebruikt bij het wassen van cellen tijdens isolatie</td></tr><tr><td>CD19-APC700</td><td>Beckman Coulter</td><td>B49212</td><td>menselijk pan-B cel marker</td></tr><tr><td>CD20-APC</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21693</td><td>menselijk pan-B cel marker</td></tr><tr><td>CD20-ECD</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM3607</td><td>menselijk pan-B cel marker</td></tr><tr><td>CD5-PC 5.5</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN A70203</td><td>menselijk T cel marker</td></tr><tr><td>CD23-PE</td><td>Pharmingen</td><td>555711</td><td>Celoppervlak-eiwit typisch afwezig in MCL</td></tr><tr><td>CD45 KO</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36294</td><td>Pan-leukecyten marker</td></tr><tr><td>CD200-PE</td><td>Pharmingen</td><td>552475</td><td>Celoppervlak-eiwit typisch afwezig in MCL</td></tr><tr><td>NOD scid gamma (NSG) muizen</td><td>Charles River Laboratories</td><td>5557</td><td>gebruikt voor het ontwikkelen van MCL xenografts in deze studie</td></tr><tr><td>Easy sep Human B cell verrijkingskit</td><td>Stem cell technologies</td><td>19054</td><td>gebruikt om B-cellen te verrijken om pure cellen te verkrijgen voor injectie in muizen</td></tr><tr><td>FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>Navios</td><td>gebruikt om MCL-monster te karakteriseren en de organen te bestuderen voor MCL-aanplant</td></tr><tr><td>1X ammonium chloride potassium buffer</td><td></td><td></td><td>rode bloed lysis buffer (NH4Cl 8.024 mg/l; KHCO3 1.001 mg/l; EDTA.Na2&middot;2H2O 3.722 mg/l )</td></tr></tbody></table>

engraftment van de tumor in een muismodel van xenograft van menselijke mantel cel lymfoom

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

B-lymfocyten zijn belangrijke spelers in de immuun cel verkeer en ze vooral thuis van en wonen in de lymfoïde organen. Terwijl normaal B cellen slechts verspreiden wanneer gestimuleerd door T-lymfocyten, oncogene B cellen overleven en autonoom uit te breiden in ongedefinieerde orgel niches. Mantel cel lymfoom (MCL) is een dergelijke stoornis van de B-cel, waar het tarief van de mediane overleving van patiënten is 4-5 jaar. Dit vraagt om de behoefte aan doeltreffende mechanismen die de homing en engraftment van deze cellen worden geblokkeerd teneinde het voortbestaan en de levensduur van patiënten. Daarom is het streven naar het ontwikkelen van een xenograft muismodel voor het bestuderen van de werkzaamheid van MCL therapeutics door het blokkeren van de homing mechanisme in vivo van het allergrootste belang. Ontwikkeling van dierlijke ontvangers voor menselijke cel xenotransplantatie vroege fase drugs testen zijn lang uitgeoefend, zoals relevante preklinische Muismodellen zijn cruciaal voor het scherm nieuwe therapeutische agenten. Deze diermodel is ontwikkeld om te voorkomen dat menselijke graft afwijzing en om een model voor ziekten bij de mens kan, en het een uiterst nuttig hulpmiddel te bestuderen van de progressie van de ziekte van verschillende lymfoom typen en preklinische testen van kandidaat-geneesmiddelen voor hematologic maligniteiten, zoals MCL. We een muismodel van xenograft die zal dienen als een uitstekend middel om te bestuderen en ontwikkelen van nieuwe therapeutische benaderingen voor MCL opgericht.

Het manuscript wordt beschreven van een geoptimaliseerde protocol voor de succesvolle ontwikkeling van een muismodel van xenograft voor engraftment van cellen van het MCL. Voorbereiding van een zuivere celpopulatie (in dit geval MCL cellen), is zeer cruciaal voor het ontwikkelen van succesvolle MCL xenografts. Figuur 1 geeft de voorbereidende stappen voor mononucleaire cel isolatie uit van MCL patiënt bloed door dichtheid verlopende scheiding. De mononucleair...

Mantel cel lymfoom (MCL) is een moeilijk te behandelen stoornis van de B-cel en het is even moeilijk vast te stellen een muismodel van xenograft van primaire MCL te bestuderen en ontwikkelen van therapeutics. Hier beschrijven we de succesvolle invoering van MCL xenografts bij muizen om te helpen begrijpen van de onderliggende biologie.

Engraftment van de tumor in een muismodel van Xenograft van menselijke mantel cel lymfoom

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Het algemene doel van deze methode is het tot stand brengen van een xenograft-muismodel voor mantelcellymfoom, om behandelstrategieën voor deze ziekte te ontwikkelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de hemato-oncologie, zoals de therapeutische uitkomst van verschillende behandelstrategieën. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om het effect van geneesmiddelen op menselijke lymfoomcellen in vivo te bestuderen.De implicaties van deze techniek reiken tot aan therapie voor mantelcellymfoom, omdat het met dit model niet alleen haalbaar maar ook praktisch is om het effect van therapie op patiëntafgeleide cellen te bestuderen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in therapeutische aspecten van mantelcellymfoom, kan zij ook worden toegepast om verschillende typen lymfomen te bestuderen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het moeilijk is om patiëntafgeleide xenografts te verkrijgen.Toen we voor het eerst het idee hadden voor deze methode, wilden we de migratie van B-cellen in vivo bestuderen en de effecten van bepaalde therapieën op dit proces. Verdun 12 milliliters van een bloedmonster van mantelcellymfoom met gelijke volumes RPMI 1640 Medium. Keer vervolgens het dichtheidsgradiëntmedium meerdere keren om voor gebruik.Haspireer 15 milliliter dichtheidsgradiëntmedium in een centrifugebuis van 50 milliliter. Voeg met behulp van een aspirator voorzichtig en langzaam het verdunde bloedmonster toe bovenop het dichtheidsgradiëntmedium, zonder de twee lagen te mengen. Schakel vervolgens de remmen uit en centrifugeer het bloedmonster 40 minuten lang bij 400g bij kamertemperatuur.Gebruik een steriele pasteurpipet om de mononucleaire bloedcellen uit de middelste laag op te zuigen en over te brengen naar een schone buis. Om de mononucleaire cellen te wassen, voegt u drie volumes steriele Phosphate Buffered Saline (single strength) met 1% foetaal runderserum toe aan een geschat volume van de celsuspensie. Pipetteer de celsuspensie meerdere keren voor een goede menging.Centrifugeer het monster vervolgens gedurende 10-15 minuten bij 400-500g bij kamertemperatuur. Verwijder na de centrifugatie het supernatant en was de celpellet met Phosphate Buffered Saline van normale sterkte, met 1% bovine serum albumin. Centrifugeer het monster.Verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer de cellen in één of twee milliliter Phosphate Buffered Saline. Tel daarna het aantal cellen met een automatische celsteller. Verdun de cellen in Phosphate Buffered Saline, pipetteer de cellen vervolgens in een polystyreen buisje van vijf milliliter en voeg 100 µL van het antilichaamcocktail toe aan de celsuspensie.Pipetteer de celsuspensie voorzichtig enkele keren voor een goede menging. Incubeer de cellen vervolgens gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in de laminaire flowkast. Vortex ondertussen de magnetische deeltjes uit de B-celverrijkingskit gedurende 30 seconden.Voeg vervolgens 150 µL van de magnetische deeltjes toe aan twee milliliter cel-suspensie. Incubeer het mengsel van cellen en magnetische deeltjes gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Breng het samplevolume aan tot 2,5 milliliter, plaats de buis vervolgens in de magneet en incubeer nogmaals drie tot vijf minuten.Giet na incubatie, in één vloeiende beweging, de celsuspensie vanuit de buis die aan de magneet is bevestigd over in een nieuwe buis. Tel vervolgens de totale opbrengst van B-cellen in de suspensie met een automatische celteller. Om de zuiverheid van de verrijkte B-cellen te bevestigen, worden ongeveer 50.000 cellen gedurende 15-30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met anti-CD19, CD20 en anti-CD45 antilichamen gekoppeld aan verschillende fluorochromen.Was de cellen vervolgens met één milliliter Phosphate Buffered Saline van enkele sterkte en 1% bovine serum albumin. Centrifugeer de cellen 5 minuten lang bij 400-500g bij kamertemperatuur. Verwijder na centrifugatie het supernatant en resuspendeer de pellet in 200 µL Phosphate Buffered Saline.Analyseer de zuiverheid van de B-cellen met behulp van flowcytometrie, die bij deze methode gewoonlijk meer dan 90% bedraagt. Suspendeer de cellen in 150 µL Phosphate Buffered Saline van normale sterkte. Injecteer de celsuspensie vervolgens intraveneus in de staartvene van muizen van zes tot zeven weken oud, ongeacht hun geslacht.Het intraveneus injecteren van de uit patiëntafgeleid bloed geïsoleerde lymfoomcellen in de staartvene van de muis is eveneens cruciaal om een succesvolle transplantatie te garanderen. Na het opofferen van de muizen in een koolstofdioxidekamer worden de verschillende organen verzameld. Onderwerp de organen vervolgens aan mechanische disruptie op een filter van 70 micron met de achterkant van een spuitenpluiger om een suspensie van enkelvoudige cellen te genereren.Centrifugeer alle monsters, behalve bloed, tussen de 400 en 500g gedurende vijf minuten en verwijder het supernatant. Gebruik ammoniumchloride-kaliumbuffer van enkelvoudige sterkte om bloed-, beenmerg-, milt- en levercellen te lyseren. Het filteren van cellen afgeleid van organen die uit muizen zijn geïsoleerd om een enkelcellige suspensie te verkrijgen voordat men overgaat naar de flowcytometer is belangrijk om verstoppingen te voorkomen.Gebruik B-cel-specifieke antilichamen, zoals anti-CD19, CD20 en CD45 om de cellen te kleuren. Middels flowcytometrie bleken de B-cellen afkomstig uit elk orgaan positief voor de CD19-, CD20- en CD45-antilichamen. Kwantificeer op basis van de gegate cellen de orgaanspecifieke en gegraftte tumorcellen verkregen uit de muizen waarin mantelcellymfoom is geïnjecteerd.In deze studie wordt flowcytometrie uitgevoerd om de zuiverheid van B-cellen voor en na verrijking bij mantelcellymfoom te bestuderen. Om de mononucleaire mantelcellymfoom te karakteriseren, worden B-cel-specifieke markers zoals CD45, CD19, CD5, CD200, CD20 Kappa en Lambda gebruikt. De flowcytometrische analyse laat cellen zien die positief kleuren voor CD45, CD19, CD20 en CD5.En deze worden geselecteerd voor karakterisering. Cellen die niet kleurden voor CD23 en CD200 worden ook geselecteerd. De mate van organspecifieke transplantatie wordt onderzocht door de organen verder te verwerken via flowcytometrie en vervolgens te analyseren op B-cellen.Hier wordt een vergelijkende weergave getoond van het engraftment-patroon verkregen van twee patiënten met gebruik van organen zoals de milt, het beenmerg en de lever. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze binnen drie weken worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de PBMCs die voor xenotransplantaten worden gebruikt te verrijken en om de muizen regelmatig te controleren op vitale tekenen van ziekte, zoals verstoord haar, een gebogen rug, verlamming van de achterpoten en gewichtsverlies.Na deze procedure kunnen xenografts worden toegepast op andere typen lymfomen, bijvoorbeeld voor het uitvoeren van gepersonaliseerde geneeskunde. Na de ontwikkeling van deze techniek zou deze de weg kunnen vrijmaken voor andere onderzoekers in het veld van de hemato-oncologie om de middelen te verkennen om mantelcellymfoom afgeleid van patiënten te vestigen in immuundeficiënte nod scid-muizen. Na het bekijken van deze video zou u een goed idee moeten hebben over hoe u patiënt-afgeleide PBMCs kunt zuiveren en deze kunt gebruiken om immuundeficiënte muizen te xenograften om de therapeutische strategieën te begrijpen.Houd er rekening mee dat werken met primaire menselijke bloedmonsters extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen, altijd moeten worden getroffen bij het uitvoeren van deze procedures.

tumor-engraftment-xenograft-mouse-model-human-mantle-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een methode voor het betrouwbaar enten van luciferase-gemerkte menselijke maligne perifere zenuwschede tumorcellen in de heupzenuw van immunodeficiënte muizen wordt beschreven. Het gebruik van bioluminescentie imaging om een ​​goede invoering van de tumor enten en criteria voor willekeurige scheiding van dieren in studiegroepen aan te tonen worden ook besproken.

Orthotope Xenografting van de Mens Luciferase-label maligne perifere zenuwschede tumorcellen voor In vivo Het testen van de kandidaat-therapeutische middelen

This video demonstrates an assay to generate a humanized xenograft mouse model. An immunocompromised mouse is injected with cyclophosphamide to cause immune cell depletion. Patient-derived tumor cells mixed with human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in a hydrogel are subcutaneously injected into the mouse, forming a tumor with infiltrating T cells.

A Technique to Generate a Human PBMC-Engrafted Humanized Xenograft Mouse Model

Menselijke tumorxenotransplantaten in immunodeficiënte muizen zijn waardevolle instrumenten om kanker biologie studeren. Specifieke protocollen voor subcutane en intrahepatische xenograften uit menselijke hepatocellulair carcinoom cellen of tumorfragmenten genereren worden beschreven. Leverregeneratie geïnduceerd door gedeeltelijke hepatectomie in ontvangende muizen wordt gepresenteerd als een strategie om intrahepatische engraftment vergemakkelijken.

Generatie van subcutane en Intrahepatic Human Hepatocellular carcinoom Xenografts in immunodeficiënte muizen

Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding en het stereotaxic beheer van allogene menselijke lymfocyten in immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic menselijke primaire hersentumoren. Deze studie biedt een bewijs-van-concept voor zowel de haalbaarheid en antitumorale werkzaamheid van cellulaire immuuntherapie intrabrain-geleverd.

Stereotactische adoptief overdracht van cytotoxische immuuncellen in lymfkliertest modellen van Orthotopic mens Glioblastoma Multiforme Xenografts

Hier gebruiken we bioluminescente, X-ray, en het positron-emissie tomografie/berekend tomography imaging te bestuderen hoe remmende mTOR activiteit beïnvloedt het beenmerg-geaccepteerd myeloma tumoren in een xenograft model. Dit zorgt voor fysiologisch relevante, niet-invasieve en multimodale analyses van het effect van de anti-myeloma van therapieën gericht op beenmerg-geaccepteerd myeloma tumoren in vivo.

Multimodale bioluminescente en positronisch-emissie tomografie/computationele Tomography Imaging van Multiple Myeloma beenmerg Xenografts in NOG muizen

Hier presenteren we een protocol voor het opwekken en scoren van ziekten in een Xenogenic graft-versus-hostziekte (xenoGVHD) model. xenoGVHD biedt een in vivo model om immunosuppressie van menselijke T-cellen te bestuderen. Daarnaast beschrijven we hoe we menselijke T-cellen in weefsels met digitale PCR kunnen detecteren als een hulpmiddel om immunosuppressie te kwantificeren.

Inductie en scoren van transplantaat-versus-gastheer ziekte in een xenogene Murine model en kwantificering van menselijke T cellen in muizen weefsels met behulp van digitale PCR

We beschrijven een humaan perifeer bloed mononucleaire cel (PBMC) — op basis van gehumaniseerd xenotransplantaatmodellen is muismodel voor translationeel immuno-oncologisch onderzoek. Dit protocol kan dienen als een algemene richtlijn voor het vaststellen en karakteriseren van vergelijkbare modellen voor I-O-therapie beoordeling.

Een humane perifere bloed mononucleaire cel (PBMC) Engrafted gehumaniseerd xenograft model voor translationele immuno-oncologie (I-O) onderzoek

Het huidige protocol beschrijft methoden voor de vaststelling van de patiënt afgeleide xenotransplantaatmodellen is (PDX) modellen en primaire kanker cellijnen van chirurgische maagkanker monsters. De methoden bieden een nuttig instrument voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en Kankerbiologie onderzoek.

Oprichting van maagkanker patiënten afgeleide xenograft modellen en primaire cellijnen

Orthotopic humane lever gemetastaseerde ukalfs melanoom xenotransplantaatmodellen is Muismodellen werden gemaakt met behulp van chirurgische orthotopic implantatie technieken met patiënt-afgeleide tumor Brok en naald injectietechnieken met gekweekte menselijke ukalfs melanoom cellijnen.

Generatie van een lever Orthotopic humaan Ukalfs melanoom xenograft platform in Immunodeficiënte muizen

Hier presenteren we een tumortransplantatieprotocol voor de karakterisering van tumor-inherente en periferie-afgeleide tumor-geïnfiltreerde lymfocyten in een muistumormodel. Specifieke tracering van de instroom van van de ontvanger afgeleide immuuncellen met flowcytometrie onthult de dynamiek van de fenotypische en functionele veranderingen van deze cellen tijdens antitumorimmuunresponsen.

Tumortransplantatie voor het beoordelen van de dynamiek van tumorinfiltrerende CD8 + T-cellen bij muizen

Het huidige protocol beschrijft hoe de menselijke huid kan worden geënt op niet-obese diabetische (NOD) -scid interleukine-2 gammaketen receptor (NSG) muizen. Een gedetailleerde beschrijving van de voorbereiding van de menselijke huid voor transplantatie, de voorbereiding van muizen voor transplantatie, transplantatie van de menselijke huid van gespleten dikte en de herstelprocedure na de transplantatie zijn opgenomen in het rapport.

Xenograft huidmodel om menselijke immuunresponsen in vivo te manipuleren

Leer hoe je een xenograft muismodel opzet voor mantelcellymfoom om behandelstrategieën te ontwikkelen. Deze methode maakt in vivo-studie van geneesmiddelen op menselijke lymfoomcellen mogelijk.

Engraftment van de tumor in een muismodel van Xenograft van menselijke mantel cel lymfoom

Meer video's verkennen