Kwantitatieve immunohistochemie van de cellulaire microomgeving bij patiëntenglioblastoomresecties

Het algemene doel van dit protocol is om componenten van de tumormicro-omgeving in resecties van glioblastoompatiënten kwantitatief te identificeren met behulp van chromogene immunohistochemie en Image J. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de tumormicro-omgeving, zoals hoe deze componenten eruitzien in patiëntmonsters en hoe we fysiologisch relevante celratio's kunnen bepalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze eenvoudig te analyseren is in patiëntmonsters. De implicaties van deze techniek reiken tot het ontrafelen van de ondergekarakteriseerde, complexe tumormicro-omgeving van glioblastoom.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden, omdat de timing van de chromogene ontwikkeling nauwgezet moet worden gemonitord om overontwikkeling en verzadiging van het weefsel te voorkomen. Begin het protocol door de wasbeurten uit te voeren die zijn beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Verdun de tris-gebaseerde high pH antigen-unmasking oplossing en het gedestilleerde water volgens de aanbevelingen van de fabrikant.

Ga over naar hittegeassisteerde antigeenherstel door de verdunde onmaskingsoplossing toe te voegen aan een niet-afgesloten magnetronbestendig vat. Plaats de coupes in het vat. Plaats vervolgens het vat met de coupes in de magnetron.

Kook vervolgens het vat 20 minuten op hoog vermogen. Controleer de vloeistofspiegels op verdamping en vul het vat indien nodig aan met gedestilleerd water. Laat de monsters één uur afkoelen in de oplossing bij kamertemperatuur.

Omtrek het weefselmonster met een hydrofoob middel om het volume reagentia dat nodig is om het monster te bedekken te minimaliseren. Pipetteer vervolgens voldoende permeabilisatielosolution, 100 tot 200 microliters, om het weefselmonster te bedekken. Verwijder en gooi de oplossing weg en bedek het weefselmonster opnieuw met permeabilisatielosolution.

Incubeer de monsters gedurende één uur bij kamertemperatuur met blokkeringsoplossing. Incubeer de monsters vervolgens gedurende de nacht bij vier graden Celsius met primaire antilichamen verdund in blokkeringsoplossing. Detecteer de volgende dag de primaire antilichamen met behulp van een mierikswortelperoxidase-polymeerreagens dat overeenkomt met het gastdier van het primaire antilichaam.

Pipette voldoende permeabilisatieoplossing in om het weefselmonster te bedekken en incubeer het monster gedurende vijf minuten. Verwijder de oplossing en gooi deze weg, en bedek het weefselmonster nogmaals met permeabilisatieoplossing gedurende vijf minuten. Incubeer de coupes in 0,3% waterstofperoxide en IX TBS gedurende 15 minuten.

Ontwikkel de monsters met een peroxidase-diaminobenzidine of dab-substraat gedurende twee tot 10 minuten totdat de gewenste kleurintensiteit is bereikt. Contrastkleur de monsters om celkernen te identificeren, bijvoorbeeld met hematoxyline volgens het protocol van de fabrikant. Dehydrateer de monsters met 100% ethanol en xyleen.

Monteer tot slot de monsters permanent met monteermedium. Twee regio's van belang binnen onze tumorresecties, de primaire tumor Bulk en de Adjacent regio's, die hoofdzakelijk bestaan uit gezond weefsel met diffuus binnendringende kankercellen, werden geïdentificeerd door een samenwerkende neuropatholoog op hematoxyline en eosine-gekleurde patiëntmonsters. Chromogene immunohistochemie identificeerde positieve kleuring voor astrocyten, microglia en oligodendrocyten binnen elk patiëntmonster.

We voerden een kleuring uit zonder primair antilichaam als negatieve controle. De fabrikant adviseerde verdere verdunningen voordat we besloten voor een verdunning van 1 op 200, vanwege de optimale positieve kleuring van het cellichaam en de uitlopers met een minimale achtergrond voor het anti-ALDH 1l1-antilichaam. Met Image J werd het percentage dekking van de OSP-1-positieve oligodendrocytenkleuring gekwantificeerd om uiteindelijk de verschillen in onze regio's van interesse te vergelijken.

Zodra de juiste drempelwaarde op de afbeelding is toegepast, kan het percentage dekking van de drempelwaarde worden gemeten en vergeleken voor meerdere patiënten. Vijf aangrenzende en bulkregio's van glioblastoom- of GBM-patiëntmonsters, samen met gezond hersenweefsel, werden vergeleken op het percentage dekking van oligodendrocyte-specifiek eiwit één of OSP1. Eenmaal onder de knie, kan de kleuringstechniek in vier uur op de eerste dag en twee uur op de tweede dag worden uitgevoerd, mits deze correct wordt uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de kleuringsintensiteit en hydratatie van het weefsel nauwlettend in de gaten te houden.