Name: Kwantitatieve immunohistochemie van de cellulaire microomgeving bij patiëntenglioblastoomresecties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Leer kwantitatieve immunohistochemie van de cellulaire micro-omgeving bij glioblastoomresecties van patiënten. Deze methode met ImageJ analyseert weefselcomponenten en helpt bij het begrijpen van tumorgroei.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Drs. Fahad Bafakih en Jim Mandell voor het verkrijgen en identificeren van patiëntmonsters, Garrett F. Beeghly voor hulp bij immunohistochemie, en de Biorepository and Tissue Research Facility, de Histologie Core van het Cardiovasculaire Research Center en de Biomoleculaire Analysefaciliteit aan de Universiteit van Virginia voor hulp bij Voorbeeldverwerving, immunohistochemie en beeldvorming.

Dit protocol identificeert cellulaire componenten in formaline-gefixeerde paraffine embedded (FFPE) monsters, zoals gebruikelijk voor gebonden klinische patiëntmonsters. Paraffin embedding zorgt voor het beste onderhoud van de cel- en weefselmorfologie en heeft ook een betere levensduur van secties. De monsters die voor deze analyse werden gebruikt werden toegankelijk via de Universiteit van Virginia Biorepository and Tissue Research Facility. Patiëntmonsters werden geselecteerd door een neuropatholoog op basis van een definitieve diagnose van glioblastoom (astrocytoma, WHO grade IV) die tussen 2010 en 2013 aan de Universiteit van Virginia tumorresecties had voltooid en vóór deze analyse 11 werden ontdekt . 1. FFPE Sample Deparaffinization and Rehydration OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol is specifiek voor FFPE-monsters. Terwijl paraffine-ingebedde monsters nuttig kunnen zijn voor deze analyse vanwege het behoud van cellulaire en tMorfologie uitmaken, deze analyse kan ook gedaan worden met bevroren secties. Als u bevroren delen gebruikt, kan dit gedeelte worden weggelaten en ga rechtstreeks naar chromogene immunohistochemie. <ol><li> Doe de volgende wasjes gedurende 5 minuten: Xyleen, Xyleen, 100% Ethanol, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol, Geïoniseerd water, Gegioniseerd water </li></ol> 2. Antigenherwinning OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol is nodig om methyleenbruggen te vormen die worden gevormd tijdens formalinfixatie van FFPE-monsters en blootstelling van antigeenplaatsen voor antilichamen om te binden. <ol><li> Verdun Tris-gebaseerde hoge pH antigeen ontmaskerende oplossing bij fabrikant aanbeveling in gedistilleerd water. </li><li> Voer warmte gemedieerde antigeen herwinning met behulp van een magnetron. Andere vormen van warmtegemedieerde terugwinning (zoals drukkoker, plantaardige stoomboiler of kokend water) zouden ook volstaan. <ol><li> Voeg de verdunde ontmaskeeroplossing toe in een niet-afgesloten magnetronvaartuig. Plaats de glijbanen in het vat. Plaats de glijbanen in de magnetron. </li><li> Kook gedurende 20 minuten bij hoge kracht. Bewaar vloeistofniveaus voor verdamping en vul eventueel met gedestilleerd water aan. </li></ol></li><li> Laat de monsters 1 uur bij kamertemperatuur in de oplossing afkoelen. </li></ol> 3. Chromogene immunohistochemie <ol><li> Omtrek weefselmonster met een hydrofobe pen om het volume van de reagentia die nodig zijn om het monster te dekken te minimaliseren. OPMERKING: Zorg ervoor dat weefselmonsters gehydrateerd zijn en laat ze niet uitdrogen, omdat dit de effectiviteit op de vlek beïnvloedt. </li><li> Pipet genoeg permeabilisatieoplossing (Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) + 0,01% Triton-X) om het weefselmonster te dekken (typisch ongeveer 100 - 200 μl). </li><li> Verwijder en verwijder oplossing en herhaal stap 3.2. </li><li> Incubeer monsters bij kamertemperatuur met blokkerende oplossing (2,5% paars serum + permeabilisatie oplossing). </li><li> Incubeer monsters overnacht in 4 ºC met primaire antilichamen verdundIn blokkerende oplossing. OPMERKING: Alle primaire antilichamen die hier worden gebruikt worden verdund op 1: 200, maar optimale verdunningen kunnen worden bepaald met behulp van seriële verdunningen, beginnend met de fabrikant aanbeveling. Gedetailleerde informatie over antilichamen gebruikt in dit protocol is eerder gepubliceerd 11 . </li><li> Detecteer primaire antilichamen met behulp van een mierikswortelperoxidase polymeer reagens dat overeenstemt met het primaire antilichaam gastheer dier, in navolging van de fabrikant protocol. </li><li> Pipet genoeg permeabilisatie oplossing om het weefselmonster te bedekken en gedurende 5 minuten te incuberen. </li><li> Verwijder en verwijder oplossing en herhaal stap 3.7. </li><li> Incubeer dia in 0,3% H 2 O 2 in 1 x TBS gedurende 15 minuten. </li><li> Ontwikkel monsters met een substraat peroxidase diaminobenzidine (DAB) gedurende 2 - 10 minuten totdat de gewenste vlekintensiteit bereikt wordt. </li><li> Contrasterende monsters om celkernen te identificeren, zoals bij hematoxyline, volgend fabrikantprotocol. </li><li> Ontwater de monsters met 100%Ethanol en xyleen. </li><li> Steek monsters permanent op met montagemedia. </li></ol> 4. Regio&#39;s van belangidentificatie <ol><li> Beeldschermen onder brightfieldmicroscopie die geschikt zijn voor hoge resolutiebeelden. OPMERKING: Gebruik beeldcamera-componenten met een resolutie van minimaal 20x. </li><li> Verplaats camera naar specifieke regio&#39;s van belang door weefselmonsters. </li><li> Bewaar afbeeldingen als TIFF-bestanden voor kwantificering. </li></ol> 5. Beeldanalyse <ol><li> Open afbeeldingen in ImageJ voor kwantificering van de procentuele dekking. </li><li> Gebruik de invoegtoepassing Threshold Color om paars kleur uit hematoxyline-gekleurde kernen te verwijderen. </li><li> Beeld omzetten naar 8-bits. </li><li> Voeg drempel toe zonder donkere achtergrond. </li><li> Procesafbeelding met een van de 17 vooraf ingestelde ImageJ-drempelfilters ( dwz MaxEntropy), zodat alleen DAB-gebrandde gedeelten in de drempel zijn opgenomen. OPMERKING: Selecteer het optimale voorgeladen drempelfilter dat minimaliseertHet opnemen van achtergrondkleuring. Dit kan afhangen van de kwaliteit van kleuring en specificiteit van antilichaam. Gebruik dezelfde drempel voor alle technische replicaten binnen elke patiëntmonster. </li><li> Pas drempel toe. </li><li> Meet percentage gebied van gedrempeld beeld. </li><li> Gemiddelde percentage dekking voor meerdere gebieden binnen elke steekproef. </li></ol>

<ol><li>Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+glioma+growth%3A+a+guerilla+war%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Diffuse glioma growth: a guerilla war.</a> Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).</li>
<li>Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+multiforme%3A+the+terminator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma multiforme: the terminator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6242-6244 (2000).</li>
<li>Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., Dichgans, J., Wick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublethal+Irradiation+Promotes+Migration+and+Invasiveness+of+Glioma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Sublethal Irradiation Promotes Migration and Invasiveness of Glioma Cells.</a> Cancer Res. 61 (6), (2001).</li>
<li>Tuettenberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrence+pattern+in+glioblastoma+multiforme+patients+treated+with+anti-angiogenic+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Recurrence pattern in glioblastoma multiforme patients treated with anti-angiogenic chemotherapy.</a> J. Cancer Res. Clin. Oncol. 135 (9), 1239-1244 (2009).</li>
<li>Munson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-invasive+adjuvant+therapy+with+imipramine+blue+enhances+chemotherapeutic+efficacy+against+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Anti-invasive adjuvant therapy with imipramine blue enhances chemotherapeutic efficacy against glioma.</a> Sci. Transl. Med. 4 (127), 127ra36(2012).</li>
<li>Correia, A. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+is+a+dominant+force+in+multidrug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Resist.+Updat%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance.</a> Drug Resist. Updat. 15 (1-2), 39-49 (2012).</li>
<li>Rubin, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Only+in+congenial+soil%3A+the+microenvironment+in+brain+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Only in congenial soil: the microenvironment in brain tumorigenesis.</a> Brain Pathol. 19 (1), 144-149 (2009).</li>
<li>Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+glioma+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Microglia promote glioma migration.</a> Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).</li>
<li>Le, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploitation+of+astrocytes+by+glioma+cells+to+facilitate+invasiveness%3A+a+mechanism+involving+matrix+metalloproteinase-2+and+the+urokinase-type+plasminogen+activator-plasmin+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Exploitation of astrocytes by glioma cells to facilitate invasiveness: a mechanism involving matrix metalloproteinase-2 and the urokinase-type plasminogen activator-plasmin cascade.</a> J. Neurosci. 23 (10), 4034-4043 (2003).</li>
<li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+microglia%2Fmacrophages+enhance+the+invasion+of+glioma+stem-like+cells+via+TGF-%CE%B21+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated microglia/macrophages enhance the invasion of glioma stem-like cells via TGF-β1 signaling pathway.</a> J. Immunol. 189, 444-453 (2012).</li>
<li>Yuan, J. X., Bafakih, F. F., Mandell, J. W., Horton, B. J., Munson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+the+Cellular+Microenvironment+of+Glioblastoma+to+Develop+Predictive+Statistical+Models+of+Overall+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of the Cellular Microenvironment of Glioblastoma to Develop Predictive Statistical Models of Overall Survival.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. , (2016).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Image+Analysis+of+Cellular+Heterogeneity+in+Breast+Tumors+Complements+Genomic+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Quantitative Image Analysis of Cellular Heterogeneity in Breast Tumors Complements Genomic Profiling.</a> Sci. Transl. Med. 4 (157), (2012).</li>
<li>Yi, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+Obstructive+Intimal+Lesions+and+Their+Cellular+Phenotypes+in+Chronic+Pulmonary+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Distribution of Obstructive Intimal Lesions and Their Cellular Phenotypes in Chronic Pulmonary Hypertension.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162 (4), 1577-1586 (2000).</li>
<li>Turcan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDH1+mutation+is+sufficient+to+establish+the+glioma+hypermethylator+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype.</a> Nature. 483 (7390), 479-483 (2012).</li>
<li>Songtao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDH+mutations+predict+longer+survival+and+response+to+temozolomide+in+secondary+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">IDH mutations predict longer survival and response to temozolomide in secondary glioblastoma.</a> Cancer Sci. 103 (2), 269-273 (2012).</li>
<li>Shinojima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+Value+of+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+in+Patients+with+Glioblastoma+Multiforme%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prognostic Value of Epidermal Growth Factor Receptor in Patients with Glioblastoma Multiforme.</a> Cancer Res. 63, 6962-6970 (2003).</li>
<li>Karpel-Massler, G., Schmidt, U., Unterberg, A., Halatsch, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+inhibition+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+high-grade+gliomas%3A+where+do+we+stand%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Therapeutic inhibition of the epidermal growth factor receptor in high-grade gliomas: where do we stand?</a> Mol. Cancer Res. 7 (7), 1000-1012 (2009).</li>
<li>Badie, B., Schartner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microglia+in+glioma+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Role of microglia in glioma biology.</a> Microsc. Res. Tech. 54 (2), 106-113 (2001).</li>
<li>Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglia function in brain tumors.</a> J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).</li>
<li>Alves, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+cells%3A+A+heterogeneous+and+fatal+tumor+interacting+with+the+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma cells: A heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma.</a> Life Sci. 89 (15), 532-539 (2011).</li>
<li>Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microglia+and+macrophages+in+glioma+maintenance+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression.</a> Nat. Neurosci. 19 (1), 20-27 (2015).</li>
<li>Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fmacrophages+promote+glioma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia/macrophages promote glioma progression.</a> Glia. 59 (3), 472-485 (2011).</li>
<li>Placone, A. L., Quiñones-Hinojosa, A., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+astrocytes+in+the+progression+of+brain+cancer%3A+complicating+the+picture+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of astrocytes in the progression of brain cancer: complicating the picture of the tumor microenvironment.</a> Tumor Biol. 37 (1), 61-69 (2016).</li>
<li>Rath, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+Enhance+the+Invasion+Potential+of+Glioblastoma+Stem-Like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Astrocytes Enhance the Invasion Potential of Glioblastoma Stem-Like Cells.</a> PLoS One. 8 (1), e54752(2013).</li>
</ol>

Onze methode die hier wordt voorgesteld is een kwantitatieve aanpak voor het analyseren van histologische monsters die zijn gekleurd met behulp van traditionele chromogene immunohistochemie. Huidige methodologie voor dit soort analyses bevat soortgelijke kleurenprotocollen, gevolgd door gradering door onafhankelijke pathologen. Deze methode is betrouwbaar, maar voor een aantal toepassingen is een nauwkeuriger inzicht in de cellulaire samenstelling nodig, zoals beter inzicht in de heterogeniteit in verband met tumoren en...

Glioblastoom (GBM), de meest voorkomende en kwaadaardige hersenkanker, wordt gekenmerkt door een zeer diffuse invasie van het primaire tumorvolume in het omliggende gezonde hersenparenchym 1 , 2 . Deze diffuse invasie maakt de tumor bijzonder moeilijk om volledig te resecteren en de invasieve kankercellen die post-therapie blijven, is de meest voorkomende reden voor onvermijdelijk herhaling 2 , 3 , 4 . Vroeger vonden we de diffuse glioma-celinval te remmen om therapeutisch voordelig te zijn 5 , maar weinig bekend is over de complexe mechanismen die bijdragen aan GBM-invasie. De tumor micro-omgeving, of weefsel rondom de kanker, is betrokken bij de progressie van tumoren bij meerdere kankers 6 , 7 . De glioblastoom tumor micro-omgeving, in pArticulair, is relatief onderschat en is uniek complex, het vormen van meerdere gliale cellen, zoals astrocyten, microglia en oligodendrocyten, evenals extracellulaire matrix, oplosbare factoren en biofysische factoren. Experimenteel zijn astrocyten en microglia aangetoond dat de progressie van gliomen en invasie 8 , 9 , 10 toeneemt, maar de samenstelling van alle gliale cellen in de micro-omgeving van de menselijke hersenen is onbekend. We hebben eerder laten zien dat micro-componenten de overleving van patiënten kunnen voorspellen door cellulaire componenten van de glioblastoom micro-omgeving kwantitatief te analyseren en onze analyses te integreren in een proportioneel risico model 11 . Hier beschrijven we de kwantitatieve analysemethode voor het identificeren van de populaties van glialcellen binnen het tumorvolume en aangrenzende gebieden van tumorresecties van glioblastoom patients. We gebruikten chromogene immunohistochemie om de gliale celpopulaties en ImageJ te identificeren om de procentuele dekking van kleuring voor elke gliale populatie te analyseren. Het beoordelen van de procentuele dekking creëert een simpele meting voor het bepalen van de morfologische verschillen in cellen, met name die welke beïnvloed zijn door interacties met kankercellen. Eerdere studies voor het kwantificeren van histopathologische kleuring gebruiken standaard kleuring zoals hematoxyline en eosin 12 of Masson&#39;s trichroom 13 , die niet profiteren van de specificiteit van immunohistochemische kleuring op antilichamen. Onze methode is ontwikkeld om de glialpopulaties rechtstreeks te kwantificeren binnen glioblastoom patiënten tumor resecties, die we willen gebruiken om de complexe glioblastoom micro-omgeving te verhelderen.

<table><tbody><tr><td>Xyleen</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3P</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>High pH antigeen onthullende oplossing</td><td>Vector Labs</td><td>H-3301</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Amresco</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Paarden serum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-ALDH1L1&nbsp;</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab56777</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Iba1&nbsp;</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab5076</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oligodendrocyte Specifiek Eiwit1&nbsp;</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab53041</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS anti-geit</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS Universeel (anti-muis/konijn)</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7500</td><td></td></tr><tr><td>Waterstofperoxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB substraat</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxyline contra-kleuring</td><td>ThermoScientific</td><td>72404</td><td></td></tr><tr><td>Histochoice Montagemedium</td><td>Amresco</td><td>H157-475</td><td></td></tr><tr><td>Aperio Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Super HT PAP Pen</td><td>Research Products International</td><td>195506</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantitatieve immunohistochemie van de cellulaire microomgeving bij patiëntenglioblastoomresecties

Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

Met de groeiende interesse in de micro-omgeving van de tumor, ontwikkelden we een methode om de micro-milieukomponenten specifiek te bepalen in patiëntenmonsters van glioblastoom, de dodelijkste en meest invasieve hersenkanker. Niet alleen zijn kwantitatieve methoden die gunstig zijn voor het nauwkeurig beschrijven van zieke weefsels, ze kunnen ook potentieel bijdragen tot een nauwkeuriger prognose, diagnose en de ontwikkeling van weefsel-gemanipuleerde systemen en vervangingen. Bij glioblastoom zijn gliale cellen, zoals microglia en astrocyten, onafhankelijk gecorreleerd met een slechte prognose gebaseerd op patholoog-gradering. Echter, de toestand van deze cellen en andere gliale celcomponenten is niet kwantitatief goed beschreven. Dit kan moeilijk zijn door de grote processen die deze glialcellen markeren. Bovendien richten de meeste histologische analyses op het algehele weefselmonster of alleen in het grootste deel van de tumor, in tegenstelling tot het kwantificeren van kwantificaties op basis van regio&#39;s witHin het zeer heterogene weefsel. Hier beschrijven we een methode voor het identificeren en kwantitatief analyseren van de populaties van gliale cellen in het tumorvolume en de aangrenzende gebieden van tumorresecties van glioblastoompatiënten. We gebruikten chromogene immunohistochemie om de gliale celpopulaties bij patiënten tumor resecties en ImageJ te identificeren om de percentuele dekking van kleuring voor elke gliale populatie te analyseren. Met deze technieken kunnen we de glialcellen beter omschrijven doorheen de regio&#39;s van de glioma tumor micro-omgeving.

Voor deze analyse werden twee regio&#39;s van belangen binnen onze tumorresecties - het primaire tumorvolume en de aangrenzende gebieden, hoofdzakelijk samengesteld uit gezond weefsel met diffuse invallende kankercellen ( Figuur 1A , 1B ) - geïdentificeerd door samenwerkende neuropathologen op hematoxyline en eosin-gekleurde patiënt samples. Binnen elk patiëntmonster werden positieve kleuring voor astrocyten ( Figuur 1C<...

Dit protocol werd ontwikkeld om tumormicro-milieukomponenten kwantitatief te identificeren bij glioblastoom-patiëntresecties onder toepassing van chromogene immunohistochemie en ImageJ.

Kwantitatieve immunohistochemie van de cellulaire microomgeving bij patiëntenglioblastoomresecties

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

Het algemene doel van dit protocol is om componenten van de tumormicro-omgeving in resecties van glioblastoompatiënten kwantitatief te identificeren met behulp van chromogene immunohistochemie en Image J. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de tumormicro-omgeving, zoals hoe deze componenten eruitzien in patiëntmonsters en hoe we fysiologisch relevante celratio's kunnen bepalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze eenvoudig te analyseren is in patiëntmonsters. De implicaties van deze techniek reiken tot het ontrafelen van de ondergekarakteriseerde, complexe tumormicro-omgeving van glioblastoom.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden, omdat de timing van de chromogene ontwikkeling nauwgezet moet worden gemonitord om overontwikkeling en verzadiging van het weefsel te voorkomen. Begin het protocol door de wasbeurten uit te voeren die zijn beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Verdun de tris-gebaseerde high pH antigen-unmasking oplossing en het gedestilleerde water volgens de aanbevelingen van de fabrikant.Ga over naar hittegeassisteerde antigeenherstel door de verdunde onmaskingsoplossing toe te voegen aan een niet-afgesloten magnetronbestendig vat. Plaats de coupes in het vat. Plaats vervolgens het vat met de coupes in de magnetron.Kook vervolgens het vat 20 minuten op hoog vermogen. Controleer de vloeistofspiegels op verdamping en vul het vat indien nodig aan met gedestilleerd water. Laat de monsters één uur afkoelen in de oplossing bij kamertemperatuur.Omtrek het weefselmonster met een hydrofoob middel om het volume reagentia dat nodig is om het monster te bedekken te minimaliseren. Pipetteer vervolgens voldoende permeabilisatielosolution, 100 tot 200 microliters, om het weefselmonster te bedekken. Verwijder en gooi de oplossing weg en bedek het weefselmonster opnieuw met permeabilisatielosolution.Incubeer de monsters gedurende één uur bij kamertemperatuur met blokkeringsoplossing. Incubeer de monsters vervolgens gedurende de nacht bij vier graden Celsius met primaire antilichamen verdund in blokkeringsoplossing. Detecteer de volgende dag de primaire antilichamen met behulp van een mierikswortelperoxidase-polymeerreagens dat overeenkomt met het gastdier van het primaire antilichaam.Pipette voldoende permeabilisatieoplossing in om het weefselmonster te bedekken en incubeer het monster gedurende vijf minuten. Verwijder de oplossing en gooi deze weg, en bedek het weefselmonster nogmaals met permeabilisatieoplossing gedurende vijf minuten. Incubeer de coupes in 0,3% waterstofperoxide en IX TBS gedurende 15 minuten.Ontwikkel de monsters met een peroxidase-diaminobenzidine of dab-substraat gedurende twee tot 10 minuten totdat de gewenste kleurintensiteit is bereikt. Contrastkleur de monsters om celkernen te identificeren, bijvoorbeeld met hematoxyline volgens het protocol van de fabrikant. Dehydrateer de monsters met 100% ethanol en xyleen.Monteer tot slot de monsters permanent met monteermedium. Twee regio's van belang binnen onze tumorresecties, de primaire tumor Bulk en de Adjacent regio's, die hoofdzakelijk bestaan uit gezond weefsel met diffuus binnendringende kankercellen, werden geïdentificeerd door een samenwerkende neuropatholoog op hematoxyline en eosine-gekleurde patiëntmonsters. Chromogene immunohistochemie identificeerde positieve kleuring voor astrocyten, microglia en oligodendrocyten binnen elk patiëntmonster.We voerden een kleuring uit zonder primair antilichaam als negatieve controle. De fabrikant adviseerde verdere verdunningen voordat we besloten voor een verdunning van 1 op 200, vanwege de optimale positieve kleuring van het cellichaam en de uitlopers met een minimale achtergrond voor het anti-ALDH 1l1-antilichaam. Met Image J werd het percentage dekking van de OSP-1-positieve oligodendrocytenkleuring gekwantificeerd om uiteindelijk de verschillen in onze regio's van interesse te vergelijken.Zodra de juiste drempelwaarde op de afbeelding is toegepast, kan het percentage dekking van de drempelwaarde worden gemeten en vergeleken voor meerdere patiënten. Vijf aangrenzende en bulkregio's van glioblastoom- of GBM-patiëntmonsters, samen met gezond hersenweefsel, werden vergeleken op het percentage dekking van oligodendrocyte-specifiek eiwit één of OSP1. Eenmaal onder de knie, kan de kleuringstechniek in vier uur op de eerste dag en twee uur op de tweede dag worden uitgevoerd, mits deze correct wordt uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de kleuringsintensiteit en hydratatie van het weefsel nauwlettend in de gaten te houden.

quantitative-immunohistochemistry-cellular-microenvironment-patient

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Source: Núñez, F. J., et al. Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates an immunohistochemical technique for labeling tumor biomarkers in paraffin-embedded brain tumor neurospheres. The neurosphere sections undergo paraffin removal and rehydration, followed by treatment to expose biomarker sites. Primary and secondary antibodies are then applied to label these biomarkers. The...

Immunohistochemical Staining of Biomarkers in Brain Tumor Neurosphere Sections

Protocol voor vermeerdering van gedissocieerde hoogwaardige glioom chirurgische specimens in serumvrij neurosfeermedium om te selecteren voor cellen met kankerstamcelfenotype. Voor specimens die niet als neurosferen groeien, wordt een alternatief protocol voorgesteld. Een paraffine-inbeddingstechniek voor het behoud van de 3D-neurosfeerarchitectuur voor immunocytochemie wordt beschreven.

Optimalisatie van hoogwaardige glioomcelcultuur van chirurgische specimens voor gebruik in klinisch relevante diermodellen en 3D-immunochemie

Hier voorgesteld is een eenvoudige methode voor het isoleren en flowcytometrische analyse van glioma infiltrerende perifere mononucleaire cellen die tijdsafhankelijk kwantitatieve gegevens over het aantal en activeringsstatus van immuuncellen die het begin hersentumor micro oplevert.

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen

Hier beschrijven we een methode om te scheiden en verrijken van de componenten van de tumor immuun en niet-immuun communicatie in gevestigde subcutane tumoren. Deze techniek maakt het mogelijk voor de afzonderlijke analyse van tumor immuun infiltreren en niet-immuun tumor breuken die uitgebreide karakterisering van de tumor immuun communicatie kunnen toestaan.

Verrijking en karakterisering van de Tumor immuun en niet-immune Microenvironments in gevestigde subcutane lymfkliertest tumoren

Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding en het stereotaxic beheer van allogene menselijke lymfocyten in immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic menselijke primaire hersentumoren. Deze studie biedt een bewijs-van-concept voor zowel de haalbaarheid en antitumorale werkzaamheid van cellulaire immuuntherapie intrabrain-geleverd.

Stereotactische adoptief overdracht van cytotoxische immuuncellen in lymfkliertest modellen van Orthotopic mens Glioblastoma Multiforme Xenografts

Neurospheres gegroeid als 3D culturen vormen een krachtig hulpmiddel om te studeren glioma biologie. Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van immunohistochemistry met behoud van de 3D structuur van glioma neurospheres via paraffine insluiten. Deze methode kan de karakterisatie van glioma neurosphere eigenschappen zoals stemness en Neurale differentiatie.

Evaluatie van Biomarkers in Glioma door Immunohistochemistry op 3D Glioma paraffine-ingebedde Neurosphere culturen

Laser microdissectie (LMD) is een gevoelige en zeer reproduceerbare techniek die kan worden gebruikt om paden die glioom heterogeniteit en invasie te bemiddelen blootleggen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol om discrete gebieden te isoleren van glioomweefsel met behulp van laser LMD, gevolgd door transcriptomische analyse.

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Proteomische ontregeling speelt een belangrijke rol bij de verspreiding van diffuus infiltrerende gliomen, maar verschillende relevante eiwitten blijven ongeïdentificeerd. Digitale ruimtelijke verwerking (DSP) biedt een efficiënte, high-throughput benadering voor het karakteriseren van de differentiële expressie van kandidaat-eiwitten die kunnen bijdragen aan de invasie en migratie van infiltratieve gliomen.

Digitale ruimtelijke profilering voor karakterisering van de micro-omgeving in diffuus infiltrerend glioom van het volwassen type

We presenteren een methode voor het repliceren van de micro-omgeving van de glioomtumor aan het invasieve front die interstitiële vloeistofstroom omvat. Dit model is een hyaluronzuur-collageen I hydrogel in een weefselkweekinzetstuk waar een vloeistofdrukkop op kan worden aangebracht. Invasie kan worden gekwantificeerd en cellen kunnen worden geïsoleerd of gelyseerd.

Een fotopolymeriseerbaar hyaluronzuur-collageenmodel van de invasieve glioommicro-omgeving met interstitiële stroom

Dit protocol bereidde met succes voldoende hoogwaardig neovasculair weefsel van gliomamonsters met behulp van laser-capture microdissectie voor kwantitatieve proteomics-analyse van tumorangiogenese, waarmee de beperkingen van studies die traditioneel vooral op angiogene factoren gericht zijn overwonnen en een grootschalig proteomica-profiel van glioma-angiogenese werden geleverd.

Voorbereiding van neovasculaire weefsels uit humane gliomaweefsels voor kwantitatieve proteomanalyse van tumorangiogenese

Leer kwantitatieve immunohistochemie van de cellulaire micro-omgeving bij glioblastoomresecties van patiënten. Deze methode met ImageJ analyseert weefselcomponenten en helpt bij het begrijpen van tumorgroei.

Kwantitatieve immunohistochemie van de cellulaire microomgeving bij patiëntenglioblastoomresecties

Meer video's verkennen