Kwantitatieve immunohistochemie van de cellulaire microomgeving bij patiëntenglioblastoomresecties
31 juli 2017
Dit protocol werd ontwikkeld om tumormicro-milieukomponenten kwantitatief te identificeren bij glioblastoom-patiëntresecties onder toepassing van chromogene immunohistochemie en ImageJ.
Het algemene doel van dit protocol is om kwantitief de componenten van de tumormicro-omgeving in glioblastoompatiëntenresecties te identificeren met behulp van chromogene immunohistochemie en Image J.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de tumormicro-omgeving, zoals hoe deze componenten eruitzien in patiëntenmonsters en hoe we fysiologisch relevante verhoudingen van cellen kunnen bepalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig is voor analyse in patiëntenmonsters. De implicaties van deze techniek reiken tot het verduidelijken van de onvoldoende gekarakteriseerde, complexe glioblastoomtumormicro-omgeving.
Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat het timing voor chromogene ontwikkeling nauwgezet gecontroleerd moet worden om overontwikkeling en verzadiging van het weefsel te voorkomen. Begin het protocol door de wasbeurten uit te voeren die in de bijbehorende tekstprotocol zijn gespecificeerd. Verdun de tris-gebaseerde hoge pH antigeenontmaskeringsoplossing en gedistilleerd water met behulp van de aanbevelingen van de fabrikant.
Ga verder met warmte-gemedieerd antigeenherstel door de verdunde ontmaskeringsoplossing toe te voegen aan een niet-verzegelde magnetronbare container. Plaats de slides in de container. Plaats vervolgens de container met de slides in de magnetron.
Kook vervolgens de container gedurende 20 minuten op hoog vermogen. Controleer het vloeistofniveau op verdamping en vul de container indien nodig aan met gedistilleerd water. Laat de monsters een uur afkoelen in de oplossing op kamertemperatuur.
Omlijn het weefselmonster met een hydrofoob om het volume aan reagentia dat nodig is om het monster te bedekken, te minimaliseren. Pipeer vervolgens voldoende permeabiliseringsoplossing, 100 tot 200 microliter, om het weefselmonster te bedekken. Verwijder en gooi de oplossing weg en bedek het weefselmonster opnieuw met permeabiliseringsoplossing.
Incubeer de monsters op kamertemperatuur met blokkeringsoplossing gedurende een uur. Incubeer vervolgens de monsters een nacht op vier graden Celsius met primaire antilichamen verdund in blokkeringsoplossing. De volgende dag detecteert u primaire antilichamen met behulp van een paardenradishperoxidasepolymeerreagens dat overeenkomt met het gastheerdier van het primaire antilichaam.
Pipeer voldoende permeabiliseringsoplossing om het weefselmonster te bedekken en incubeer het monster gedurende vijf minuten. Verwijder en gooi de oplossing weg en bedek het weefselmonster nog een keer gedurende vijf minuten met permeabiliseringsoplossing. Incubeer de slides in 0,3% waterstofperoxide en IX TBS gedurende 15 minuten.
Ontwikkel de monsters met een peroxidase diaminobenzidine of dab substraat gedurende twee tot 10 minuten totdat de gewenste kleurintensiteit is bereikt. Tegenkleuren de monsters om celkernen te identificeren, zoals met hematoxylinen volgens het protocol van de fabrikant. Dehydrateer monsters met 100% ethanol en xyleen.
Monteer ten slotte de monsters permanent met montagemedium. Twee interessegebieden binnen onze tumorresecties, de primaire tumor Bulk en de aangrenzende gebieden, voornamelijk bestaande uit gezond weefsel met verspreide invasieve kankercellen, werden geïdentificeerd door een samenwerkende neuropatholoog op hematoxylinen en eosine gekleurde patiëntenmonsters. Chromogene immunohistochemie identificeerde positieve kleuring voor astrocyten, microglia en oligodendrocyten binnen elk patiëntenmonster.
We voerden kleuring uit zonder primair antilichaam voor een negatieve controle. De door de fabrikant aanbevolen en verdere verdunningen voordat we op de een op 200 verdunning kwamen vanwege optimale positieve kleuring van de cellichaam en het proces met minimalisering van de achtergrond voor het anti ALDH 1l1 antilichaam. Met behulp van Image J werd de percentage dekking van OSP-1 positieve oligodendrocytenkleuring gekwantificeerd om uiteindelijk verschillen in onze interessegebieden te vergelijken.
Zodra de juiste drempelwaarde op de afbeelding is toegepast, kan de percentage dekking vanaf de drempelwaarde worden gemeten en vergeleken voor meerdere patiënten. Vijf aangrenzende en bulkgebieden van glioblastoom of GBM patiëntenmonsters, samen met gezond hersenweefsel, werden vergeleken op oligodendrocyt-specifiek eiwit één of OSP1 percentage dekking. Zodra de kleuringstechniek is beheerst, kan de kleuringstechniek in vier uur op de eerste dag en twee uur op de tweede dag worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd.
Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de intensiteit van de weefselkleuring en hydratatie nauwgezet te controleren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het kwantitatief identificeren van componenten van de tumormicro-omgeving in resecties van glioblastoompatiënten met behulp van chromogene immunohistochemie en ImageJ. Deze techniek heeft tot doel inzicht te geven in de complexe tumormicro-omgeving van glioblastoom.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Histologie
Achtergrond
- Glioblastoom is een zeer agressieve hersentumor.
- De tumormicro-omgeving speelt een cruciale rol in de tumorprogressie.
- Inzicht in de samenstelling van deze omgeving is essentieel voor het ontwikkelen van gerichte therapieën.
- Chromogene immunohistochemie maakt een gedetailleerde visualisatie van weefselcomponenten mogelijk.
Doel van de studie
- Kwantitatief beoordelen van de tumormicro-omgeving in glioblastoommonsters.
- Bepalen van fysiologisch relevante verhoudingen van verschillende celtypen.
- Een eenvoudige analysemethode bieden voor monsters van patiënten.
Gebruikte methoden
- Chromogene immunohistochemie voor weefselkleuring.
- ImageJ software voor kwantitatieve analyse.
- Was- en antigeenontmaskeringsprotocollen volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
- Zorgvuldige monitoring van de timing van de chromogene ontwikkeling.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van verschillende componenten van de tumormicro-omgeving.
- Establering van methoden voor het bepalen van celverhoudingen in glioblastoommonsters.
- Inzicht in de complexiteit van de glioblastoommicro-omgeving.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode op monsters van patiënten.
Conclusies
- Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van glioblastoommicro-omgevingen.
- Het helpt bij het begrijpen van de interacties binnen de tumormicro-omgeving.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om glioblastoombehandelingsstrategieën te verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of the tumor microenvironment in patient-derived glioblastoma samples enables mechanistic de-risking of glial cell targets in neuro-oncology drug discovery. By providing reproducible, region-specific measurements of astrocytes, microglia, and oligodendrocytes, this method supports target validation and phenotypic screening in disease-relevant systems. It enhances predictive confidence in preclinical models by linking microenvironment composition to therapeutic response and resistance mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glial cell phenotypes and their functional states within heterogeneous tumor regions.
- Operational Value: Provides quantitative, image-based readouts for assessing target engagement and microenvironment modulation.
- Predictive Value: Supports biomarker-aligned target selection by correlating glial abundance with pathological gradients in patient samples.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes standardized immunohistochemistry protocols compatible with high-throughput imaging and analysis pipelines.
- Quantitative Output: Delivers percent coverage metrics via ImageJ that enable inter-sample and inter-region comparisons.
- Reproducibility: Defines critical timing controls for chromogenic development to ensure signal specificity and minimize background noise.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses actual patient resection samples to maintain pathophysiological fidelity in target validation studies.
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical models by defining quantitative benchmarks for glial cell composition.
- Risk Mitigation: Reduces biological de-risking uncertainty in glial-targeted therapies by characterizing microenvironmental context.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly for neuro-oncology programs focused on microenvironment modulation.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by enabling spatial and quantitative profiling of glial populations in human tissue.
- Screening: Generates standardized, quantifiable staining patterns that can be used to evaluate compound effects on microenvironmental composition.
- Analytics: Provides threshold-based percent coverage measurements that allow statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies by linking glial cell densities to histopathological regions of interest.
- Enterprise Reuse: Establishes a transferable IHC/ImageJ workflow applicable across glioma and other CNS tumor models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence through quantitative, spatially resolved glial cell analysis in patient samples.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized antigen retrieval, blocking, and development timing protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by reducing ambiguity in target microenvironment interactions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of glial-modulating therapeutics based on microenvironmental engagement data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry and neuropathological sample handling.
- Dependent on optimized chromogenic development timing to avoid signal saturation.
- Necessitates standardized ImageJ thresholding protocols for consistent quantification.
- Requires access to patient-derived glioblastoma resection samples with annotated regions of interest.
- Limited by tissue heterogeneity and the need for region-specific analysis to avoid confounding signals.
