Met behulp van een aangepast Microfluidic olfactorische Chip voor de beeldvorming van neuronale activiteit in reactie op de feromonen in mannelijke C. Elegans hoofd neuronen
7 september 2017
Het gebruik van een aangepast "olfactorische chip" voor de efficiënte calcium beeldvorming van C. elegans mannetjes wordt hier beschreven. Studies van mannelijke Gasbedwelming met behulp van glycerol en een feromoon worden ook weergegeven.
Het algemene doel van deze procedure is om efficiënt een calciumtransitie in beeld te vangen in mannelijke C.Elegans kopneuronen bij blootstelling aan feromonen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurobiologie, zoals het begrijpen van geslachtsspecifieke neurale circuitregulatie. Het grote voordeel van deze techniek is dat mannelijke C.Elegans nu efficiënt kunnen worden geïmaged in een microfluïdisch vangapparaat.
Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het laden van dieren in het begin moeilijk kan zijn en biogene feromonen niet bij elk dier een calciumtransitie veroorzaken. Om te beginnen met het samenstellen van de reservoirs, bereidt u drie sets slangen voor door een naald in het ene uiteinde en een metalen buis in het andere uiteinde te steken. Neem vervolgens voor elke reservoir een drieweg luer-klep en bevestig een spuit van 30 milliliter met de plunjer verwijderd, een spuit van drie milliliter en de slang.
Vul elke reservoir met de juiste buffer, ofwel stimulus S basal of S basal met fluoresceïne. Verwijder vervolgens eventuele luchtbellen uit zowel de reservoir als de slang door met de spuit te slaan en te pompen. Vul nu een nieuwe spuit van drie milliliter en slang met S basal en breng deze aan op de uitlaatpoort van het microfluïdische apparaat.
Breng voorzichtig een beetje druk uit op de spuit totdat de buffer aan de oppervlakte van de inlaatgaten verschijnt. Verbind vervolgens de stroomregeling, buffer en stimulusreservoirbuizen naar hun juiste inlaatgaten, en zorg ervoor dat er vloeibare druppels aanwezig zijn op zowel het laadpoortgat als de slang die moet worden aangesloten. Breng nu voorzichtig wat meer druk uit op de spuit totdat druppels verschijnen in de wormlaadpoortinlaat en plaats vervolgens een vaste blokkeerpen in die poort.
Verwijder vervolgens de spuit uit de uitlaatpoort en bevestig een uitlaatlijn die verbonden is met het vacuümhuis. Inspecteer nu het apparaat op eventuele luchtbellen in de drijfkanalen in de videofeed van de microscoop. Klik op live om de live afbeelding te observeren en wacht tot de bellen zich natuurlijk verspreiden voordat u verdergaat.
Schakel vervolgens de fluorescente lichtbron in en gebruik een GFP-filter om de juiste stromingsdynamiek te bevestigen. Activeer de driewegklep en observeer de fluorescente controlestroom in de videofeed, wanneer de klep open is. Om te beginnen, zet één worm op een ongezaaide NGM-agarplaat en laat de worm wegkrullen.
Laat vervolgens de plaat drijf met S basal. Trek de oplossing met de worm in de spuit op. Schakel vervolgens op het apparaat de vacuüm uit om de stroom te stoppen met behulp van de uitlaat luer-klep.
Verwijder vervolgens de vaste pen die de wormlaadpoort blokkeert. Breng de slang met wormen in de laadpoort in. Open de uitlaat luer-klep en observeer de live videofeed.
Breng nu voorzichtig druk uit op de spuit totdat de worm verschijnt. Trek de worm terug als hij met de staart eerst binnenkomt, hij moet met de kop eerst naar binnen om aan het stimulus te worden blootgesteld. De gebruiker moet de worm terugtrekken voordat de staart volledig in het kanaal komt, anders is het buitengewoon moeilijk om de worm uit het kanaal te krijgen en vereist dit meestal het volledig doorspoelen van de worm door het kanaal en het laden van een nieuwe worm.
Breng nu, met behulp van de druk van de spuit, de worm door het kanaal en plaats de kop van de worm zodat deze aan de bufferstroom wordt blootgesteld, maar niet zo ver in het kanaal dat deze vrij kan bewegen. Een kleine hoeveelheid axiale of rotatiebeweging wordt verwacht bij niet-verlamde dieren. Hoewel het toevoegen van een verlammiddel aan de buffers dit effect bijna elimineert.
Om de kans op beweging tijdens de proef te verkleinen, gebruik oudere mannetjes die efficiënter worden gevangen, verminder de breedte of dikte van de wormlaadpoort of verhoog de hoeveelheid tijd die in de verlammiddel wordt doorgebracht. Gebruik de software om opnamen te maken met blauw licht excitatie. Stel de belichting in op 100 milliseconden, open het venster voor beeldverwerving, stel de tijdstippen in op 300 met een interval bij nul en start vervolgens de beeldverwerving.
Na vijf seconden, breng het stimulus aan door de driewegklep te veranderen die de buffers regelt. Een stimulatie van 10 seconden is een goed startpunt en de lengte van het stimulus kan naar behoefte worden aangepast. Na de stimulatie, schakel de stroom terug door op de knop te drukken en ga door met opnemen tot de video van 30 seconden is voltooid.
Dit laat de g camp-fluorescentie terugkeren naar de basislijn. Laat de voorbereiding nu 30 seconden rusten voor de volgende proef. Wormen die g camp drie in de niet-gevoelige neuron, ASH, tot expressie brengen, reageren op een molaire glycerol met zichtbare veranderingen in fluorescentie binnen het ASH-neuron, indicatief voor neurale activiteit.
Het neuron moet gedurende de hele video in het analysegebied blijven, anders kan er een bewegingsartefact optreden. Als dat het geval is, verplaats dan het analysegebied voor die tijdstippen en voeg de intensiteitswaarden samen om een enkele trace te maken. Mannen die worden gestimuleerd met het aantrekkelijke biogene feromoon ascaroside drie tijdens blootstelling, werden calciumtransities gemeten in de vier CEM-neuronen.
Van dier tot dier en van neuron tot neuron varieerden de traces in vorm, teken en omvang. Het is dus erg belangrijk om veel dieren te analyseren bij het bestuderen van feromonenreacties. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een mannelijke C elegans in een microfluïdisch apparaat laadt en calciumtransities in kopneuronen analyseert.
Dit proces kan ook worden gebruikt met hermafrodieten om specifieke verschillen in neurale reacties te identificeren. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in een half uur worden uitgevoerd voor het eerste afgebeelde dier. Na de eerste opname kan een nieuw dier in ongeveer 10 minuten worden geladen en afgebeeld.
Volgens deze procedure kunnen andere methoden zoals optogenetica worden gecombineerd met dit protocol om beter te begrijpen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een aangepaste "olfactory chip" ontworpen voor efficiënte calciumimaging van C. elegans-mannetjes, specifiek in reactie op glycerol en feromonen. De methode verbetert het begrip van de sekse-specifieke regulatie van neurale circuits in de neurobiologie.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurobiologie
- Calcium-imaging
- Gedragsanalyse
Achtergrond
- C. elegans dient als een belangrijk modelorganisme voor het bestuderen van de neuronale functie.
- Calcium-imaging maakt het mogelijk om neurale circuits in realtime te observeren.
- Sekse-specifieke reacties op stimuli bieden inzicht in de dynamiek van neurale circuits.
- Efficiënte trapping-technieken verbeteren de imaging-mogelijkheden van levende preparaten.
Doel van de studie
- Om een techniek te ontwikkelen voor het in beeld brengen van calciumtransiënten in de kopneuronen van mannelijke C. elegans.
- Om te onderzoeken hoe mannetjes reageren op biogene feromonen en andere stimuli.
- Om nieuwe inzichten te verschaffen in de regulatie van sekse-specifieke neurale circuits.
Gebruikte methoden
- Een microfluïdisch apparaat werd gebruikt voor het vangen en imageren van C. elegans.
- De focus lag op mannelijke C. elegans als biologisch model voor het beoordelen van neurale responsen.
- Calcium-imaging werd uitgevoerd met behulp van een fluorescent eiwit om neuronale activiteit te visualiseren.
- Kritische stappen omvatten het zorgvuldig laden van de wormen en het beheersen van de vloeistofstroom tijdens de imaging.
- Het proces maakt het mogelijk om na ongeveer 10 minuten nieuwe dieren te imageren.
Belangrijkste resultaten
- Calciumtransiënten werden waargenomen in het ASH-neuron en vier CEM-neuronen na blootstelling aan feromonen.
- De responsen varieerden in vorm en magnitude, wat wijst op individuele verschillen in neurale responsen.
- De methode toonde een veelbelovend potentieel voor het begrijpen van neurale schakelcircuits-responsen op feromonen.
- De haalbaarheid van het in beeld brengen van neurale activiteit met minimale bewegingsartefacten werd aangetoond.
Conclusies
- Deze studie stelt een methode vast voor real-time beeldvorming van neuronale activiteit in mannelijke C. elegans.
- De techniek kan worden aangepast om seksspecifieke neurale mechanismen te onderzoeken.
- Deze benadering vergroot het begrip van neuronale reacties op chemische stimuli en de implicaties hiervan voor de regulatie van neurale circuits.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze microfluïdische olfactorische chip maakt efficiënte calciumimaging mogelijk bij mannelijke C. elegans, waarmee een belangrijk hiaat in het seksespecifieke neurobiologische onderzoek wordt opgevuld. Door real-time imaging van neuronale responsen op feromonen mogelijk te maken, ondersteunt deze methode het mechanistische de-risking bij targetvalidatie voor neuroactieve verbindingen. De aanpak biedt voorspellende waarde in de vroege ontdekkingsfase door de seks-dimorfe regulatie van neurale circuits te verduidelijken.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar sekse-specifieke neurale circuits in reactie op feromoonstimuli.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar platform voor het vangen en beelden van kopneuronen van mannelijke C. elegans.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt hypothesetoetsing van seksedimorfe mechanismen bij het screenen van neuroactieve verbindingen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Vergemakkelijkt de preparatie van gevalideerde neuronale systemen voor daaropvolgende screening van verbindingen.
- Operationele waarde: Maakt gestandaardiseerde, kwantitatieve metingen van calciumtransiënten mogelijk in gedefinieerde neuronale populaties.
- Assay-gereedheid: Ondersteunt schaalbare imaging-workflows met minimale bewegingsartefacten na de initiële training.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Waarde: Verbindt neurale beeldvorming in de ontdekkingsfase met preklinische continuïteit via geslachtsspecifieke biomarker-afstemming.
- Mechanistische Risicoreductie: Vermindert ambiguïteit in geslachtsspecifieke neurale reacties op chemische stimuli.
- Predictieve Betrouwbaarheid: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere voortgang mogelijk door variabele respons-patronen tussen individuen te onthullen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van doelwit-hypothesen tot de identificatie van lead-verbindingen, in het bijzonder voor neuroactieve verbindingen die een sekse-specifiek efficiëntieprofiel vereisen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van sekse-specifieke regulatie van neurale circuits via gecontroleerde blootstelling aan feromonen.
- Screening: Levert assay-klare neuronale preparaten met reproduceerbare stimulusafgifte en calciummetingen.
- Analytics: Maakt kwantitatieve analyse van calciumtransiënten in ASH- en CEM-neuronen mogelijk met behulp van ImageJ voor comparatieve evaluatie van condities.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan bij preklinische validatie door sekse-gestratificeerde neurale responsgegevens te leveren die relevant zijn voor biomarkerontwikkeling.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar microfluïdisch platform voor snelle doorlooptijd van imaging van mannelijke C. elegans, waardoor de preparatietijd per dier na de initiële training wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij doelwitvalidatie door sekse-specifieke neurale signaleringsmechanismen te ontrafelen.
- Operationele waarde: Standaardiseert procedures voor het laden en imageren van wormen, waardoor de doorvoer wordt verbeterd en de variabiliteit wordt verminderd.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door seksedimorfe neurale responsen te onthullen die differentiële effectiviteit van verbindingen kunnen voorspellen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van neuroactieve verbindingen mogelijk op basis van sekse-specifieke neurale activiteitsprofielen.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in de assemblage van microfluïdische apparaten, het hanteren van wormen en calcium-imagingtechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot fluorescentiemicroscopie, spuitpompen en vacuümcontrolesystemen voor vloeistofregulering.
- Maakt standaardisatie tussen teams noodzakelijk voor een consistente oriëntatie bij het laden van wormen en de timing van de stimulus.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het uitbreiden van het protocol naar hermaphrodieten of andere neuronale stammen.
- Omvat praktische beperkingen zoals variabele responspercentages op feromonen en een initiële leercurve voor de efficiëntie van het laden van wormen.
