Met behulp van een aangepast Microfluidic olfactorische Chip voor de beeldvorming van neuronale activiteit in reactie op de feromonen in mannelijke C. Elegans hoofd neuronen
September 7th, 2017
Het gebruik van een aangepast "olfactorische chip" voor de efficiënte calcium beeldvorming van C. elegans mannetjes wordt hier beschreven. Studies van mannelijke Gasbedwelming met behulp van glycerol en een feromoon worden ook weergegeven.
Het algemene doel van deze procedure is om efficiënt een calciumtransitie in beeld te vangen in mannelijke C.Elegans kopneuronen bij blootstelling aan feromonen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurobiologie, zoals het begrijpen van geslachtsspecifieke neurale circuitregulatie. Het grote voordeel van deze techniek is dat mannelijke C.Elegans nu efficiënt kunnen worden geïmaged in een microfluïdisch vangapparaat.
Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het laden van dieren in het begin moeilijk kan zijn en biogene feromonen niet bij elk dier een calciumtransitie veroorzaken. Om te beginnen met het samenstellen van de reservoirs, bereidt u drie sets slangen voor door een naald in het ene uiteinde en een metalen buis in het andere uiteinde te steken. Neem vervolgens voor elke reservoir een drieweg luer-klep en bevestig een spuit van 30 milliliter met de plunjer verwijderd, een spuit van drie milliliter en de slang.
Vul elke reservoir met de juiste buffer, ofwel stimulus S basal of S basal met fluoresceïne. Verwijder vervolgens eventuele luchtbellen uit zowel de reservoir als de slang door met de spuit te slaan en te pompen. Vul nu een nieuwe spuit van drie milliliter en slang met S basal en breng deze aan op de uitlaatpoort van het microfluïdische apparaat.
Breng voorzichtig een beetje druk uit op de spuit totdat de buffer aan de oppervlakte van de inlaatgaten verschijnt. Verbind vervolgens de stroomregeling, buffer en stimulusreservoirbuizen naar hun juiste inlaatgaten, en zorg ervoor dat er vloeibare druppels aanwezig zijn op zowel het laadpoortgat als de slang die moet worden aangesloten. Breng nu voorzichtig wat meer druk uit op de spuit totdat druppels verschijnen in de wormlaadpoortinlaat en plaats vervolgens een vaste blokkeerpen in die poort.
Verwijder vervolgens de spuit uit de uitlaatpoort en bevestig een uitlaatlijn die verbonden is met het vacuümhuis. Inspecteer nu het apparaat op eventuele luchtbellen in de drijfkanalen in de videofeed van de microscoop. Klik op live om de live afbeelding te observeren en wacht tot de bellen zich natuurlijk verspreiden voordat u verdergaat.
Schakel vervolgens de fluorescente lichtbron in en gebruik een GFP-filter om de juiste stromingsdynamiek te bevestigen. Activeer de driewegklep en observeer de fluorescente controlestroom in de videofeed, wanneer de klep open is. Om te beginnen, zet één worm op een ongezaaide NGM-agarplaat en laat de worm wegkrullen.
Laat vervolgens de plaat drijf met S basal. Trek de oplossing met de worm in de spuit op. Schakel vervolgens op het apparaat de vacuüm uit om de stroom te stoppen met behulp van de uitlaat luer-klep.
Verwijder vervolgens de vaste pen die de wormlaadpoort blokkeert. Breng de slang met wormen in de laadpoort in. Open de uitlaat luer-klep en observeer de live videofeed.
Breng nu voorzichtig druk uit op de spuit totdat de worm verschijnt. Trek de worm terug als hij met de staart eerst binnenkomt, hij moet met de kop eerst naar binnen om aan het stimulus te worden blootgesteld. De gebruiker moet de worm terugtrekken voordat de staart volledig in het kanaal komt, anders is het buitengewoon moeilijk om de worm uit het kanaal te krijgen en vereist dit meestal het volledig doorspoelen van de worm door het kanaal en het laden van een nieuwe worm.
Breng nu, met behulp van de druk van de spuit, de worm door het kanaal en plaats de kop van de worm zodat deze aan de bufferstroom wordt blootgesteld, maar niet zo ver in het kanaal dat deze vrij kan bewegen. Een kleine hoeveelheid axiale of rotatiebeweging wordt verwacht bij niet-verlamde dieren. Hoewel het toevoegen van een verlammiddel aan de buffers dit effect bijna elimineert.
Om de kans op beweging tijdens de proef te verkleinen, gebruik oudere mannetjes die efficiënter worden gevangen, verminder de breedte of dikte van de wormlaadpoort of verhoog de hoeveelheid tijd die in de verlammiddel wordt doorgebracht. Gebruik de software om opnamen te maken met blauw licht excitatie. Stel de belichting in op 100 milliseconden, open het venster voor beeldverwerving, stel de tijdstippen in op 300 met een interval bij nul en start vervolgens de beeldverwerving.
Na vijf seconden, breng het stimulus aan door de driewegklep te veranderen die de buffers regelt. Een stimulatie van 10 seconden is een goed startpunt en de lengte van het stimulus kan naar behoefte worden aangepast. Na de stimulatie, schakel de stroom terug door op de knop te drukken en ga door met opnemen tot de video van 30 seconden is voltooid.
Dit laat de g camp-fluorescentie terugkeren naar de basislijn. Laat de voorbereiding nu 30 seconden rusten voor de volgende proef. Wormen die g camp drie in de niet-gevoelige neuron, ASH, tot expressie brengen, reageren op een molaire glycerol met zichtbare veranderingen in fluorescentie binnen het ASH-neuron, indicatief voor neurale activiteit.
Het neuron moet gedurende de hele video in het analysegebied blijven, anders kan er een bewegingsartefact optreden. Als dat het geval is, verplaats dan het analysegebied voor die tijdstippen en voeg de intensiteitswaarden samen om een enkele trace te maken. Mannen die worden gestimuleerd met het aantrekkelijke biogene feromoon ascaroside drie tijdens blootstelling, werden calciumtransities gemeten in de vier CEM-neuronen.
Van dier tot dier en van neuron tot neuron varieerden de traces in vorm, teken en omvang. Het is dus erg belangrijk om veel dieren te analyseren bij het bestuderen van feromonenreacties. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een mannelijke C elegans in een microfluïdisch apparaat laadt en calciumtransities in kopneuronen analyseert.
Dit proces kan ook worden gebruikt met hermafrodieten om specifieke verschillen in neurale reacties te identificeren. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in een half uur worden uitgevoerd voor het eerste afgebeelde dier. Na de eerste opname kan een nieuw dier in ongeveer 10 minuten worden geladen en afgebeeld.
Volgens deze procedure kunnen andere methoden zoals optogenetica worden gecombineerd met dit protocol om beter te begrijpen
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een aangepaste "olfactorische chip" die is ontworpen voor efficiënte calcium-beeldvorming van C. elegans-mannelijken, specifiek in reactie op glycerol en feromonen. De methode verbetert het begrip van geslachtsspecifieke neurale circuitregulatie in de neurobiologie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurobiologie
- Calcium-beeldvorming
- Gedragsanalyse
Achtergrond
- C. elegans dient als een belangrijk modelorganisme voor het bestuderen van neuronale functie.
- Calcium-beeldvorming maakt de observatie van neurale circuits in real-time mogelijk.
- Geslachtsspecifieke reacties op stimuli bieden inzichten in neurale circuitdynamica.
- Efficiënte vangbenaderingen verbeteren de beeldvormingscapaciteiten van levende preparaten.
Doel van de studie
- Om een techniek te ontwikkelen voor het beeldvormen van calcium-transienten in mannelijke C. elegans-kopneuronen.
- Om te onderzoeken hoe mannetjes reageren op biogene feromonen en andere stimuli.
- Om nieuwe inzichten te verschaffen in de regulatie van geslachtsspecifieke neurale circuits.
Gebruikte methoden
- Een microfluïdisch apparaat werd gebruikt voor het vangen en beeldvormen van C. elegans.
- De focus lag op mannelijke C. elegans als het biologische model voor het beoordelen van neurale reacties.
- Calcium-beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een fluorescente eiwit om neuronale activiteit te visualiseren.
- Kritische stappen omvatten het zorgvuldig laden van wormen en het regelen van de vloeistofstroom tijdens het beeldvormen.
- Het proces maakt het mogelijk om vervolgens nieuwe dieren in ongeveer 10 minuten te beeldvormen.
Belangrijkste resultaten
- Calcium-transitie werd waargenomen in de ASH-neuron en vier CEM-neuronen bij blootstelling aan feromonen.
- Reacties varieerden in vorm en grootte, wat wijst op individuele verschillen in neurale reacties.
- De methode toonde veelbelovend potentieel voor het begrijpen van neurale circuitreacties op feromonen.
- Demonstreerde de haalbaarheid van het beeldvormen van neurale activiteit met minimale bewegingsartefacten.
Conclusies
- Deze studie stelt een methode vast voor real-time beeldvorming van neuronale activiteit in mannelijke C. elegans.
- De techniek kan worden aangepast om geslachtsspecifieke neurale mechanismen te onderzoeken.
- Deze aanpak verbetert het begrip van neuronale reacties op chemische stimuli en hun implicaties voor neurale circuitregulatie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This microfluidic olfactory chip enables efficient calcium imaging in male C. elegans, addressing a key gap in sex-specific neurobiology research. By allowing real-time imaging of neuronal responses to pheromones, the method supports mechanistic de-risking in target validation for neuroactive compounds. The approach provides predictive value in early discovery by clarifying sex-dimorphic neural circuit regulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of sex-specific neural circuits in response to pheromonal stimuli.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for trapping and imaging male C. elegans head neurons.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of sex-dimorphic mechanisms in neuroactive compound screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated neuronal systems for downstream compound screening.
- Operational Value: Enables standardized, quantitative calcium transient measurements in defined neuronal populations.
- Assay Readiness: Supports scalable imaging workflows with minimal movement artifacts after initial training.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects discovery-phase neural imaging to preclinical continuity via sex-specific biomarker alignment.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in sex-specific neural responses to chemical stimuli.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions by revealing variable response patterns across individuals.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for neuroactive compounds requiring sex-specific efficacy profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of sex-specific neural circuit regulation through controlled pheromone exposure.
- Screening: Delivers assay-ready neuronal preparations with reproducible stimulus delivery and calcium readouts.
- Analytics: Enables quantitative analysis of calcium transients in ASH and CEM neurons using ImageJ for comparative condition evaluation.
- Translational Research: Aligns with preclinical validation by providing sex-stratified neural response data relevant to biomarker development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microfluidic platform for rapid turnover of male C. elegans imaging, reducing per-animal preparation time after initial training.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving sex-specific neural signaling mechanisms.
- Operational Value: Standardizes worm loading and imaging procedures, improving throughput and reducing variability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing sex-dimorphic neural responses that may predict differential compound efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroactive compounds based on sex-specific neural activity profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device assembly, worm handling, and calcium imaging techniques.
- Depends on access to fluorescence microscopy, syringe pumps, and vacuum control systems for fluid regulation.
- Necessitates standardization across teams for consistent worm loading orientation and stimulus timing.
- Involves adaptation considerations when extending the protocol to hermaphrodites or other neuronal strains.
- Includes practical limitations such as variable pheromone response rates and initial learning curve for worm loading efficiency.
