Name: Met behulp van een aangepast Microfluidic olfactorische Chip voor de beeldvorming van neuronale activiteit in reactie op de feromonen in mannelijke C. Elegans hoofd neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Leer calciumbeeldvorming in mannelijke C. elegans hoofdneuronen met een microfluidische olfactorische chip. Deze methode onthult neurale reacties op feromonen en geslachtsspecifieke circuitregulatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij wil Manuel Zimmer bedanken voor het verstrekken van ons met het oorspronkelijke ontwerp-bestand dat werd aangepast voor gebruik met males; Frank Schroeder voor de synthese en de levering van ascr #3; Ross Lagoy voor het inzicht en de hulp bij beeldvorming en analyse; en Laura Aurilio voor de master fabricage en die, naast Christopher Chute, bijgedragen tot de herziening van dit manuscript. Financiering voor dit werk werd verstrekt onder de National Institutes of Health subsidie 1R01DC016058-01 (J.S.), de National Science Foundation subsidie CBET 1605679 (D.R.A.) en de Burroughs-Wellcome Career Award op de wetenschappelijke Interface (D.R.A.).

1. fabricage van apparaat Opmerking: zie referentie 1.
 Opmerking: silicium master mallen waren vervaardigd gebruikend photolithographic standaardtechnieken voor patronen van SU-8 fotoresist op een silicium master 1 , 7. Fotomaskers voor wafer patronen werden gedrukt met 25.000 dpi. De man-aangepast apparaat is voorzien van een Chronis olfactorische Chip ontwerp 19 met een verandering in de worm laadhaven haven, een ontwerp verkregen M. Zimmer (persoonlijke correspondentie, 2016) aan te passen. Een beurt is opgenomen om de controle van de rotatie van de dieren. De breedte van de worm laden poort kanaal wordt teruggebracht naar 50 μm. Alle kanalen zijn 32 μm groot. Zodra een silicium meester mal beschikbaar voor de gebruiker is, de gebruiker de daaropvolgende kunt volgen protocol, zoals eerder beschreven 1.
<ol><li>Mix PDMS basis en genezen agent op een 10:1-verhouding gewichtsprocent.</li>
	<li>Meng overschrijving pipetten.</li>
	<li>Ontgas het mengsel in een vacuüm exsiccator gedurende 1 uur, totdat alle zichtbare bellen zijn verwijderd.</li>
	<li>Giet het mengsel op een siliconen mal meester in een 150 mm diameter schotel, totdat het is 5 mm dik (100 g). Verwijder alle bubbels of stof die zijn ingevoerd om het mengsel van een pipet van Pasteur kunt.</li>
	<li>Bakken bij 65 ° C gedurende ten minste 3 uur, of 's nachts.</li>
	<li>Knippen van het PDMS uit de buurt van de schimmel met behulp van een scalpel en knip de afzonderlijke apparaten uit elkaar met een scheermesje.</li>
	<li>Inlaat en uitlaat gaten met een 1 mm dermale punch punch.</li>
	<li>Spoelen de gaten met dH 2 O, ethanol, en opnieuw met dH 2 O om deeltjes te verwijderen uit de stempels. Droog het apparaat in een lucht stroom puls.</li>
	<li>Reinigen van beide kanten van de zender en de bovenzijde van het apparaat met plakband, verwijderen van stof en vuil op het apparaat te maken voor succesvolle hechting resterende.</li>
	<li>Plasma-bond het apparaat, kanaal-zijde naar beneden, met een glas van de cover nr.1.
	<ol><li>Bloot cover glas en apparaat (kanaal-kant naar boven) aan plasma van de lucht met behulp van voorwaarden die het mogelijk voor goede hechting, zoals 100 W voor 30 maken s of 24 W voor 60 s. 
		Opmerking: Instellingen kunnen worden aangepast om de efficiëntie van de hechting te verbeteren. De plasma-bonding voorwaarden zijn niet zo kritisch als goede reiniging bij een poging om de efficiëntie van de hechting te verbeteren. Een onvoldoende gereinigde apparaat zal niet obligatie, zelfs onder ideale plasma voorwaarden.</li>
		<li>Omkeren van het glas van de cover op de kant van het kanaal van het apparaat en druk op neer met de duim voor 5 s.</li>
	</ol></li></ol> 2. Voorbereiding van de buffer <ol><li>Dilute 1 x S basale (100 mM NaCl en 0,05 M KPO 4, pH 6.0) uit een steriele 10 x voorraad.</li>
	<li>1 M tetramisole voorraad om een eindconcentratie van 1 mM in 1 x S basale verdund voor alle buffer oplossingen.</li>
	<li>Fluoresceïne toevoegen aan zowel de &#34; datatransportbesturing &#34; en &#34; buffer &#34; stuwmeren.
	<ol><li>Maakt een voorraad van 100 mg/mL van fluoresceïne in 1 x S basale.</li>
		<li>De eindconcentraties van 1 µg/mL in de datatransportbesturing en 0,1 µg/mL in de buffer voorraad verdunnen.</li>
	</ol></li> <li>Maken de stimuli.
	<ol><li>Verdunde glycerol om een eindconcentratie van 1 M in 1 X S basale.</li>
		<li>Verdund ascaroside #3 (ascr #3) om een eindconcentratie van 1 µM in 1 X S basale.</li>
	</ol></li></ol> 3. App.instlng Opmerking: Zie 1.
 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig1.jpg" /> Figuur 1. Microfluidic app.instlng. (A) Reservoirs en buizen. Een 30 mL syringe zonder een plunjer fungeert als de &#34; reservoir. &#34; Dit is gekoppeld aan een Luer-klep met drie opties van de stroom. Een stopcontact is aangesloten op een 3 mL spuit met een zuiger, terwijl de andere op een naald (oranje) dat is ingevoegd in de buizen die verbinding met het microfluidic-apparaat maakt is aangesloten. (B) de algemene opstelling van de microfluidic imaging experiment. Het apparaat is geplaatst op een podium van een omgekeerde epifluorescence Microscoop, boven de objectieven. De &#34; datatransportbesturing &#34; buffer reist door een 3-weg klep die wordt gecontroleerd door een eenheid op de plank boven de setup. Lijnen met buffers zijn vervolgens ingevoegd in de juiste poorten. (C) de poorten van de microfluidic apparaat. De &#34; datatransportbesturing &#34; havens flank de andere inlaat-poorten: de &#34; stimulus &#34; en &#34; buffer &#34; havens. De &#34; outlet &#34; poort is de poort van de meest rechtse. Dankzij de ligging van de worm laden arena, de &#34; worm laden &#34; poort is de poort van de centrale-waarvan de meeste op het apparaat. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56026/56026fig1large.jpg" target="_blank"> Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<ol><li>Voorbereiden drie vloeistof reservoirs door de 3-weg Luer klep, een 30 of 60 mL spuit aansluiten met een 3 mL spuit en naald gekoppeld aan de Luer-klep ook (zoals in figuur 1A). Leidingen die zich tot het microfluidic-apparaat uitstrekt verbinden met de naald (zoals in figuur 1A -B).</li>
	<li>Verwijderen van de luchtbellen uit het reservoir en buis.</li>
	<li>Vullen de 3 mL-spuit met bijgevoegde buizen met 1 x S basale en plaatst u deze in het stopcontact poort.</li>
	<li>Zachtjes druk uitoefenen op de spuit, totdat de buffer wordt weergegeven aan de bovenkant van de inlaat gaten.</li>
	<li>De datatransportbesturing, buffer en stimulans buizen verbinden met gaten van de juiste inlaat (zoals in figuur 1B -C), ervoor te zorgen dat vloeibare druppels aanwezig op zowel de laden port gat en de buffer buis worden gehecht.</li>
	<li>Weer zachtjes druk uitoefenen op de spuit die is aangesloten op de poort van de uitlaat tot druppels verschijnen in de worm laden poort inlaat.</li>
	<li>Plaats een solide blokkerende pin in de worm laden poort.</li>
	<li>Verwijderen van de spuit uit de retourzijde en bevestig de afvoer lijn aangesloten op het huis vacuüm (-670 Torr).</li>
	<li>Inspecteren het apparaat voor bubbels in de stroom kanalen, visueel en via video bevestiging via een software compatibel met de camera gebruikt, zoals de open-sourcesoftware Micro-Manger. Zie stap 6 voor tips over het gebruik van Micro-Manager.
	<ol><li>Als alle bubbels aanwezig zijn, wacht hen te verjagen of worden opgenomen in het PDMS muur vóór het laden van alle dieren; de aanwezigheid van bubbels zal verstoren de goede doorstroming van vloeistoffen door het apparaat.</li>
	</ol></li> <li>Goede stroom dynamiek binnen het apparaat met behulp van een filter GFP bevestigen vóór worm laden door de 3-wegkraan bedieningsmagneet en observeren de omschakeling van buffers.
	<ol><li>Bepalen de juiste flow dynamics: observeren de fluoresceïne aanwezig in de flow control en buffer oplossingen ( figuur 2D -2E) wanneer de waarde van de stroom-besturingselement wordt gewijzigd door te drukken op het besturingselement te wijzigen knop voor de 3-wegkraan op de klep koppeling ( figuur 1B).</li>
		<li>Na het openen van Micro-Manager, klik op &#34; Live &#34; te observeren een live beeld van het apparaat. De fluorescerende lichtbron te observeren van de stroom van buffers in het apparaat inschakelen ( figuur 2D -2E).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig2.jpg" /> Figuur 2: Een man-aangepast microfluidic olfactorische chip. (A) de stroom patronen van het apparaat als de worm wordt blootgesteld aan buffer. Buffer (B) wordt weergegeven in het bruin en datatransportbesturing (FC) wordt weergegeven in het geel, met stimulus (S) in wit. De worm laadhaven haven is aangepast om op te nemen van een curve, die voor betere controle van worm oriëntatie zorgt. (B) de stroom patronen van het apparaat als de worm wordt blootgesteld aan stimulans. Buffer (B) wordt weergegeven in het bruin en datatransportbesturing (FC) wordt weergegeven in het geel, met stimulus (S) in wit. (C) metingen van het aangepast apparaat als verzonnen. De worm laadhaven haven eindigt in een 42 µm openen, met een 50 µm-kanaal dat is ontworpen voor de mannelijke breedte. De gemeten hoogte van de kanalen is 32 µm, ondanks een streefcijfer van 25 µm in het ontwerp. (D-E) A gevangen mannelijke waarin p sra-6:: GCaMP3. De promotor sra-6 is niet ASH-specifieke, en sommige expressie kan worden waargenomen in de ASI neuron, hoewel geen calcium transiënten werden waargenomen in ASI. Het beeld is (D) een combinatie van lichte-veld en TL verlichting, terwijl (E) alleen tl is. De schaal balken duiden 42 µm. (F) de ASH neuron reageert op 1 M van glycerol stimulatie met robuuste neurale activiteit. Het blauwe gebied duidt de tijd van de 1 M glycerol stimulus. Het gearceerde gebied geeft de standaardfout, met n = 20 pulsen van zeven wormen. De rode sporen duiden depolarizing reacties. De Y-axes weergeven ΔF/F 0 De schaal balk duidt 5 s. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56026/56026fig2large.jpg" target="_blank"> Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
 4. dier voorbereiding Opmerking: zie referentie 23.
<ol><li>Imaging ASH reacties op 1 M van glycerol.
	<ol><li>Plaats ongeveer 20 C. elegans mannetjes die positief voor p sra-6:: GCaMP3 matrix expressie op een nematode middellange (NGM) agar groeischijf bezaaid met een gazon van OP50 E. coli. Gebruik van de uitdrukking van fluorescerende GECI en/of een co injectie marker voor de identificatie van matrix-positieve dieren. 
		Opmerking: De positieve dieren Array fluoresceren volgens de GECI gebruikt (dat wil zeggen, de dieren GCaMP uiten fluoresceren onder blauw-licht stimulatie, groene terwijl RCaMP dieren rood onder groen-licht stimulatie fluoresceren). Co injectie markeringen kunnen variëren van andere fluorescerende eiwitten, zoals GFP en RFP, tot fenotypische markers, zoals rol-6, of een dominante fenotype, zoals de pha-1 mutatie 28 kunnen redden.
		<ol><li>Als plukken onmiddellijk voorafgaand aan de test, pick jonge volwassen mannetjes. Als het oppakken van de dag voorafgaand aan de test, kies L4 larvale mannetjes.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Imaging de CEM reacties op 1 µM ascr #3.
	<ol><li>Pick ongeveer 20 L4 C. elegans mannetjes (fkEx98 [p pkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; Pha-1 (e2123ts); hem-5 (e1490); Lite-1 (ce314)) dat zijn positief voor dsRed co injectie marker expressie. 
		Opmerking: dsRed uitdrukking binnen de ray neuronen van het mannelijke verhaal is gemakkelijker te observeren en te bevestigen dan GCaMP uitdrukking binnen de vier CEM neuronen.</li>
		<li>Isoleren deze mannetjes van hermafrodieten op een NGM agarplaat alvorens het imaging experiment uit te voeren met een gazon van OP50, E. coli, voor 5-14 h agarvoedingsbodem. 
		Opmerking: Mannetjes niet geïsoleerd voor een minimum van 5 h gedragsgestoorde niet reageren op ascr #3 en daarom kan vertonen zelfs minder calcium transiënten aan de ascaroside dan hier waargenomen.</li>
	</ol></li></ol> 5. Dierlijke laden Opmerking: Zie refefence 1.
<ol><li>Halen één worm op een unseeded NGM agar bord met behulp van standaard worm onderhoud technieken.
	<ol><li>Pick wormen door een pick (gemaakt van afgevlakte platina-draad), het oppakken van bacteriën naar de pick, flaming en &#34; deppen &#34; een worm oprapen. Zachtjes de worm op de nieuwe plaat, zodat het kruipen uit op zijn eigen plaats.</li>
	</ol></li> <li>Ongeveer 5 mL 1 x S basale toevoegen aan de unseeded plaat, zodat de plaat wordt overspoeld.</li>
	<li>Trekken van de worm in een injectiespuit met laden (dat wil zeggen, 3 mL injectiespuit met bijgevoegde buizen) die al vooraf gevuld met 1 x S basale.
	<ol><li>Zorg ervoor dat de worm alleen in de buis, niet helemaal in de spuit zuigen. 
		Opmerking: Als de worm reist in de spuit, het is bijna onmogelijk om het terug in de buis.</li>
	</ol></li> <li>Uitschakelen van het vacuüm om te stoppen met de stroom door te draaien aan het bedrijfsventiel Luer.</li>
	<li>Verwijderen van de vaste pin blokkeren de worm laden poort.</li>
	<li>Zet de Luer-klep aangesloten op de poort van de uitlaat ( figuur 1B), zodat het is ontluchting. 
	Opmerking: Gebruik een live video feed tijdens het laden van de worm te bevestigen de locatie en richting van het dier (stappen 5,8-5.13).</li>
	<li>Invoegen van de worm laden buis in de worm laden poort.</li>
	<li>Zachtjes druk uitoefenen op de spuit, totdat de worm wordt weergegeven in het kanaal laden.</li>
	<li>Als de worm begint te het kanaal staart-eerste binnenkomen, trek op de zuiger van de spuit om te voorkomen dat de worm de kanaal.</li>
	<li>Schakelen tussen de toepassing en het omkeren van druk totdat het hoofd het kanaal eerst treedt.</li>
	<li>Open het vacuüm door te draaien aan de 3-weg Luer klep op de poort van de uitlaat aangesloten te openen om te zuigen in plaats van sfeer.</li>
	<li>Handmatig toe te passen druk door indrukken van de zuiger van de spuit om te oriënteren en plaats van het hoofd van de worm, zodanig dat de katalysator is blootgesteld aan de buffer stroom kanaal, maar niet zo ver dat het hoofd kan zich bewegen ( Figuur 2 D-2E).</li>
</ol> 6. Stimulus en overname <ol><li>met behulp van een open-source microscopie software, zoals Micro-Manager, opnemen door het vastleggen van beelden als een TIFF-stapel op 10 frames per seconde met behulp van blauw-licht excitatie (470 nm) voor 30 s.</li>
	Instellen van de belichting op het belangrijkste menu aan 100 ms. <ol><li>Open <li>&#34; multi D Acq. &#34; van het belangrijkste menu van de software. Stel de &#34; nummer &#34; te &#34; 300, &#34; en de &#34; interval &#34; te &#34; 0. &#34; klikt u op &#34; ophaal! &#34; te verwerven van de video.</li>
	</ol></li> <li>Toepassen een 10 s puls van de stimulus 5 s na de inleiding van de overname. De duur van de prikkel toepassing desgewenst aanpassen.
	<ol><li>Na het verwerven van 5 s-video, wijzigen de 3-wegkraan beheersing van de flow control buffer de prikkel om op te passen het dier wordt getest. Klik op de knop uiterst links op de klep koppeling ( figuur 1B).</li>
		<li>Na 10 s van stimulans blootstelling (ditmaal kan worden aangepast door de gebruiker als gewenst), de stroom van buffers wijzigen door opnieuw op de meest linkse knop op de klep koppeling.</li>
	</ol></li> <li>Record onder buffer alleen totdat het venster 30-s voltooid is om de fluorescentie van de GECI terug te keren naar basislijn.</li>
	<li>Herhaal desgewenst. Wacht 30 s tussen het einde van de overname en de opening van de volgende proef.</li>
</ol> 7. Analyse van het beeld <ol><li>de TIFF-stack met de open-source software, ImageJ, openen door het bestand te slepen in het venster ImageJ.</li>
	<li>Klik met behulp van de cursor en sleep als u wilt instellen van de regio van belang (ROI) rond het neuron van belang. Instellen van de regio op te nemen van het soma van het neuron van belang (zoals in figuur 3A).</li>
	<li>De z-stack van de intensiteit van de fluorescentie van de ROI over stapels uitzetten door op openen te klikken-&#62; beeld - &#62; Stacks - &#62; z-profiel Plot.</li>
	<li>Klik &#34; lijst &#34; in het venster dat wordt geopend. Klik op Edit - &#62; kopiëren om te kopiëren van de waarden. Plak de waarden naar een spreadsheetprogramma.</li>
	<li>Analyseren van de fluorescentie van de achtergrond voor elke pulse door naar een regio van de worm, die geen GCaMP expressie bevat te slepen van de ROI.</li>
	<li>Achtergrond aftrekken voor de elke puls uitvoeren door af te trekken van de waarde van de fluorescentie achtergrond uit de neuron waarde voor de intensiteit van de fluorescentie.</li>
	<li>ΔF/F, 0 voor elk frame voor elke pulse berekenen.
	<ol><li>Berekenen F 0 als de intensiteitswaarde van de gemiddelde van de ROI voor eerste 1 s van overname (bijvoorbeeld frames 1-10).</li>
		<li>ΔF/F 0 berekenen door het verdelen van de achtergrond-afgetrokken waarde voor het frame van belang door de berekende waarde van F 0.</li>
	</ol></li> <li>Herhaal voor elke neuron beeld en elke prikkel puls.</li>
	<li>Voor neuronen met consistente respons profielen, zoals ASH, gemiddeld alle pulsen voor elk neuron en berekenen van de SEM (zoals in figuur 2F).</li>
	<li>De gemiddelde ΔF/F 0 met SEM uitzetten na verloop van tijd voor elk neuron. 
	Opmerking: In dit geval is het gebruikelijk om te omvatten heatmaps van de individuele neuronale antwoorden voor elk afzonderlijk experiment zo goed. In neuronen die geen consistente verandering in de calcium transiënten bij blootstelling aan prikkels over herhaalde stimulaties vertonen, of in verschillende individuen 23, het mogelijk meer toepassing op afzonderlijke puls sporen (zoals in Figuur 4). Zie de discussie voor meer informatie over het bepalen van hoe de gegevens moeten worden weergegeven.</li>
</ol>

<ol><li>Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Devices+for+Behavioral+Analysis%2C+Microscopy%2C+and+Neuronal+Imaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).</li>
<li>Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+the+analysis+of+behavior%2C+nerve+regeneration%2C+and+neural+cell+biology+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans.</a> Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 561-567 (2009).</li>
<li>Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worm+chips%3A+Microtools+for+C.+elegans+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Worm chips: Microtools for C. elegans biology.</a> Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).</li>
<li>Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+screening+of+genes+regulating+tryptophan+hydroxylase+transcription+in+Caenorhabditis+elegans+using+microfluidics+and+an+adaptive+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm.</a> Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).</li>
<li>Lockery, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+whole-animal+drug+screening+using+electrophysiological+measures+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans.</a> Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).</li>
<li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nat Commun. 7, 13023(2016).</li>
<li>Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neuro%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Front Mol Neuro. 6, 2(2013).</li>
<li>Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+calcium+sensor+proteins+for+monitoring+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity.</a> Neurophotonics. 1 (2), 025008(2014).</li>
<li>Tatro, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+imaging+of+neurons+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Brain-wide imaging of neurons in action.</a> Front Neural Circuits. 8, 31(2014).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Greene, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+selection+shapes+density-dependent+foraging+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour.</a> Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).</li>
<li>Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+changes+in+two+chemoreceptor+genes+contribute+to+a+Caenorhabditis+elegans+QTL+for+foraging+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Chemoreceptors+Mediate+Developmental+Effects+of+Dauer+Pheromone+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans.</a> Science. 326 (5955), 994-998 (2009).</li>
<li>McGrath, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+evolution+of+domesticated+Caenorhabditis+species+targets+pheromone+receptor+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes.</a> Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).</li>
<li>Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Expression+of+Channelrhodopsin-2+in+Single+Neurons+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 7 (8), e43164(2012).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Structure+of+the+Nervous+System+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+of+the+Royal+Soc+of+Lon%22%5BJournal%5D)">The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1(1986).</li>
<li>White, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensory+circuitry+for+sexual+attraction+in+C.+elegans+males%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males.</a> Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Chute, C. D., Srinivasan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+mating+cues+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical mating cues in C. elegans.</a> Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).</li>
<li>Izrayelit, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+metabolomics+reveals+a+male+pheromone+and+sex-specific+ascaroside+biosynthesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans.</a> ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).</li>
<li>Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascaroside+signaling+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Ascaroside signaling in C. elegans.</a> WormBook. , 1-22 (2013).</li>
<li>Narayan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+responses+within+a+single+neuron+class+enable+sex-specific+attraction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).</li>
<li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).</li>
<li>Sammut, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia-derived+neurons+are+required+for+sex-specific+learning+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans.</a> Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).</li>
<li>Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+male%3A+postembryonic+development+of+nongonadal+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures.</a> Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).</li>
<li>Hilliard, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+C.+elegans+ASH+neurons%3A+cellular+response+and+adaptation+to+chemical+repellents%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents.</a> The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).</li>
<li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_transformationmicroinjection/transformationmicroinjection.html">Transformation and microinjection.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li>Cáceres, I. dC., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laterally+Orienting+C.+elegans+Using+Geometry+at+Microscale+for+High-Throughput+Visual+Screens+in+Neurodegeneration+and+Neuronal+Development+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies.</a> PLoS ONE. 7 (4), e35037(2012).</li>
<li>Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li>
<li>García, L. R., Portman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+for+sexually+dimorphic+and+sexually+divergent+behaviors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).</li>
<li>Clokey, G. V., Jacobson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autofluorescent+%26%2334%3Blipofuscin+granules%26%2334%3B+in+the+intestinal+cells+of+Caenorhabditis+elegans+are+secondary+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">The autofluorescent &#34;lipofuscin granules&#34; in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes.</a> Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).</li>
<li>Coburn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthranilate+Fluorescence+Marks+a+Calcium-Propagated+Necrotic+Wave+That+Promotes+Organismal+Death+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001613(2013).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hub-and-spoke+circuit+drives+pheromone+attraction+and+social+behaviour+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans.</a> Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).</li>
<li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+structure-specific+and+promiscuous+G-protein-coupled+receptors+mediates+small-molecule+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De man-aangepast olfactorische chip integreert een bocht in een smaller laden-poort, waarmee voor meer controle van de oriëntatie en de efficiënte overlapping van mannelijke C. elegans. Dit zorgt voor de visualisatie van zowel de linker- en leden van neuronale bilaterale paren, zonder de behoefte van de z-stapelen. Deze curve leidt tot een oriëntatie uit de buurt van verticale 100% van de tijd in wormen waar slechts een paar van de bilaterale is gericht met een fluorescerende marker, zoals ASH (<strong class="xf...

Microfluidic apparaten toegenomen toegang bieden tot precies gecontroleerde omgevingen, waarin dieren, zoals de nematode C. elegans, experimenteel gemanipuleerde1kan worden. Deze studies omvatten gedrags testen, calcium beeldvorming studies, of zelfs zeefresten voor specifieke fenotypen, wat resulteert in meer exacte metingen van experimentele resultaten1,2,3,4, 5,6. Microfluidics bieden kleinschalige vloeibare omstandigheden, waardoor gedetailleerde experimenten kunnen worden uitgevoerd tijdens het gebruik te maken van de minimale hoeveelheden van reagentia. Er is een constante productie van nieuwe microfluidic apparaat ontwerpen, en het gebruik van elk varieert, van arenas waarmee voor de natuurlijke sinusvormige motie van C. elegans in behavioral testen en neurale beeldvorming studies, val van apparaten die worden gebruikt in de neurale beeldvorming en olfactorische studies, naar apparaten waarmee voor high-throughput fenotypische analyse in genetische4,5,6,7 schermen. Na de fabricage van een master mold, microfluidic apparaten zijn goedkoop te construeren-gegeven de herbruikbaarheid van de meester — en makkelijk te gebruiken, waardoor snelle gegevens generatie via high-throughput onderzoek. De fabricage van apparaten met behulp van polymeren zoals Polydimethylsiloxaan (PDMS) voorziet in de oprichting van nieuwe apparaten binnen uur.
Calcium imaging studies gebruik genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIs) uitgedrukt in de doelcellen te meten van de neurale dynamiek van deze cellen in real-time8,9,10,11. Het transparante karakter van C. elegans zorgt voor de opname van de fluorescerende niveaus van deze eiwitten in levende dieren. Traditioneel GECIs is afhankelijk van de groen fluorescente proteïne (GFP)-op basis van sensor GFP-Calmoduline-M13 Peptide (GCaMP), hoewel het meer recente studies hebben deze sensoren voor betere signal-to-noise ratio's en rood-verschoven excitatie profielen aangepast. Na de ontwikkeling van GCaMP3, eiwitten met deze specificaties zijn gevarieerd, met inbegrip van sensoren zoals GCaMP6s en GCaMP6f (langzame en snelle fluorescentie af-tarieven, respectievelijk), evenals RFP-Calmoduline-M13 Peptide (RCaMP), die heeft een rode-verschoven activering profiel. De combinatie van deze GECIs met C. elegans cel-specifieke gensequenties promotor kan target cellen van belang, met name de sensorische neuronen12,13,14,15 , 16.
Terwijl het gebruiksgemak C. elegans in microfluidic studies blijkt, hebben bijna alle studies gericht op hermafrodieten. Ondanks de mannetjes slechts accounting voor 0.01-0,02% van de bevolking van wild type, onschatbaar bevindingen kunnen voortvloeien uit hun karakterisering. Terwijl de fysieke connectome van de hermafrodiete zenuwstelsel volledig in kaart voor decennia17 gebracht is, nog de mannelijke connectome onvolledig, vooral in de hoofd regio van de dierlijke18. Het gebruik van calcium beeldvorming bij mannen zal bijdragen tot het genereren van een goed begrip van de mannelijke zenuwstelsel en de verschillen die zich tussen de twee geslachten voordoen. De kleinere omvang van C. elegans volwassen mannetjes voorkomt dat effectieve en betrouwbare vangst in de havens van de laden van traditionele olfactorische inrichtingen die zijn ontworpen voor grotere hermafrodieten. Om aan te pakken dit, een gewijzigde versie van de Chronis olfactorische Chip19 werd ontwikkeld met een smaller laden poort, een lagere hoogte van het kanaal, en draait in de worm laden poort (die draaien het dier), waardoor voor de visualisatie van bilaterale links/rechts neuronale paren. Dit ontwerp toelaat: (1) de effectieve overlapping van jonge volwassen mannetjes, (2) een betrouwbaarder oriëntatie van het dier voor de visualisatie van beide leden van bilaterale gepaarde neuronen, en (3) de precieze beeldvorming van neurale activiteit in mannelijke neuronen.
Steeds meer tonen studies aan dat C. elegans mannetjes anders dan hermafrodieten op een verscheidenheid van ascarosides (ascr), of nematode feromonen20,21,22,23 reageren ,24. Daarom, ontwikkeling van een goed begrip van de neurale dynamiek en voorstellingen binnen de mannelijke connectome geworden zelfs meer relevant. Mannelijke C. elegans bevatten 87 geslacht-specifieke neuronen niet aanwezig in de hermafrodiete25,26, wijzigen van de connectome in als-nog onbepaald manieren. Zijnde kundig voor beeld van deze unieke neurale dynamiek zal ons in staat stellen geslacht-specifieke reacties en neurale vertegenwoordigingen beter te begrijpen.
Dit protocol beschrijft het gebruik van een man-aangepast olfactorische chip voor de neurale beeldvorming van mannelijke C. elegans chemosensation. De Nociceptieve neuron die Ash op betrouwbare wijze op 1 M van glycerol in mannetjes, consistent met vorige hermafrodiete reageert bestudeert27. Blootstelling aan ascarosides kan uitlokken reacties die variabele van dier op dier, waarvoor een groter aantal dieren worden getest. De reactie van de man-specifieke CEM neuronen eerder gebleken, via zowel elektrofysiologie en calcium imaging studies, inspelen op variabel ascaroside #323.

<table><tbody><tr><td>Silicon Wafer</td><td>University Wafer</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2035</td><td>MicroChem</td><td>Y111070-0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>MicroChem</td><td>Y020100-4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>Wafer Mask</td><td>Cad/Art Services</td><td>-</td><td>Custom order. Printed at 25,000 dpi.</td></tr><tr><td>Sylgard-184</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mm Dermal Punches</td><td>Acuderm Inc.</td><td>P150</td><td></td></tr><tr><td>Soft Tubing</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-06419-01</td><td></td></tr><tr><td>Hard Tubing</td><td>IDEX Health &amp; Science</td><td>1622</td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td>New England Small Tube</td><td>NE-1027-12</td><td></td></tr><tr><td>Blocking Pins</td><td>New England Small Tube</td><td>0.415/0.425" OD x.500 Long</td><td>Batch PB07027</td></tr><tr><td>3 mL syringes</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>30 mL syringes</td><td>Vitality Medical</td><td>302832</td><td>Used as buffer reservoirs.</td></tr><tr><td>Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer</td><td>Component Supply Company</td><td>NE-231PL-50</td><td></td></tr><tr><td>Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-30600-07</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Mercator Control System LF-5 Plasma System</td><td>Mercator</td><td>LF-5</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Tape</td><td>Scotch</td><td>BSN43575</td><td></td></tr><tr><td>Series 20 Chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>P-2</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Desicator</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>420250000</td><td>24 cm inner diameter.</td></tr><tr><td>Weigh Boats</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-01017-27</td><td></td></tr><tr><td>Classic Plus Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>PB1501-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipettes</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-25554-06</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Genesee Scientific</td><td>30-202</td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Sheldon Manufacturing Inc</td><td>9120993</td><td>Model Number: 1500E.</td></tr><tr><td>60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes</td><td>TriTech Research</td><td>T3308</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer.A1</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS</td><td>Hammamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Blue Fluorescent Light</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM6-LCR-SA</td><td>24-30V/7.9A DC.</td></tr><tr><td>Illumination Adaptor</td><td>Zeiss</td><td>423302-0000</td><td></td></tr><tr><td>Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve</td><td>Parker</td><td>001-0017-900</td><td>3-way valve for controlling flow.</td></tr><tr><td>ValveLink8.2&reg;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>01-18</td><td>Flow Switch Controller</td></tr><tr><td>Micro Manager</td><td>Micro-Manager</td><td>-</td><td>Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>ImageJ</td><td>-</td><td>Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Agar, Bacteriological Grade</td><td>Apex</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Apex</td><td>20-260</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>VWR</td><td>BDH0224-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11470</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270741-4L</td><td></td></tr><tr><td>Tetramisole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9756-10(G)</td><td>Store at 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Fluorescein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD2000S-250mg</td><td>Light Sensitive. Store in photoprotective vials.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ascaroside #3</td><td>-</td><td>-</td><td>Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University).</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-215</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>BDH</td><td>BDH9268.25</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3252-025</td><td></td></tr><tr><td>ASH GCaMP3 line</td><td>-</td><td>-</td><td>CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library.</td></tr><tr><td>CEM GCaMP6 line</td><td>-</td><td>-</td><td>JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library.</td></tr><tr><td>E. coli (OP50)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>"Reservoir"</td><td>-</td><td>-</td><td>To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle.</td></tr></tbody></table>

met behulp van een aangepast microfluidic olfactorische chip voor de beeldvorming van neuronale activiteit in reactie op de feromonen in mannelijke c. elegans hoofd neuronen

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

Het gebruik van calcium indicatoren heeft ons begrip van neurale dynamiek en verordening aanzienlijk verbeterd. De nematode Caenorhabditis elegans, met zijn volledig toegewezen zenuwstelsel en transparante anatomie, presenteert een ideaal model voor inzicht in real-time neurale dynamiek calcium indicatoren. Calcium-imaging studies met behulp van deze indicatoren worden in combinatie met microfluidic technologieën en experimentele designs uitgevoerd in zowel gratis voortbewegende en gevangen dieren. Echter hebben de meeste eerdere studies met behulp van vangst apparaten, zoals de olfactorische chip beschreven in Chronis et al., inrichtingen die zijn ontworpen voor gebruik in de meest voorkomende hermafrodiet, zoals het minder vaak mannetje zowel morfologisch en structureel is ongelijke. Een aangepast olfactorische chip is ontworpen en gefabriceerd voor meer efficiëntie bij de mannelijke neuronale imaging met het gebruik van jonge volwassen dieren. Een beurt werd opgenomen in de worm laadhaven haven te draaien van de dieren en voor de scheiding van de individuele neuronen binnen een bilaterale paar in 2D beeldvorming. Wormen zijn blootgesteld aan een gecontroleerde stroom van odorant binnen het microfluidic-apparaat, zoals beschreven in eerdere hermafrodiete studies. Calcium transiënten worden vervolgens geanalyseerd met behulp van de open-sourcesoftware ImageJ. De hierin beschreven procedure ruimte laten voor een verhoogde hoeveelheid mannelijke gebaseerde C. elegans calcium imaging studies, verdiepen ons begrip van de mechanismen van het geslacht wordt bepaald neuronale signalering.

Een voorbeeld van de algehele app.instlng kan worden gezien in figuur 1A-B. Figuur 1A beeldt de juiste reservoir bouw en installatie. Figuur 1B toont de aansluitingen van de stuwmeren aan het microfluidic apparaat. Figuur 1 c toont een microfluidic-apparaat met afzonderlijke poorten gelabeld voor duidelijkheid.
<p class="jove_content" fo:keep-togethe...

Het gebruik van een aangepast "olfactorische chip" voor de efficiënte calcium beeldvorming van C. elegans mannetjes wordt hier beschreven. Studies van mannelijke Gasbedwelming met behulp van glycerol en een feromoon worden ook weergegeven.

Met behulp van een aangepast Microfluidic olfactorische Chip voor de beeldvorming van neuronale activiteit in reactie op de feromonen in mannelijke C. Elegans hoofd neuronen

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

Het algemene doel van deze procedure is om efficiënt beelden vast te leggen van calciumtransiënten in de kopneuronen van mannelijke C.elegans bij blootstelling aan feromonen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de neurobiologie, zoals het begrijpen van sekse-specifieke regulatie van neurale circuits. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat mannelijke C.elegans nu efficiënt kunnen worden afgebeeld in een microfluïdisch trapapparaat.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het laden van dieren in het begin lastig kan zijn en biogene feromonen niet bij elk dier calciumtransiënten opwekken. Om te beginnen met de assemblage van de reservoirs, bereidt u drie sets slangetjes voor door aan het ene uiteinde een naald en aan het andere uiteinde een metalen buisje in te brengen. Neem vervolgens voor elk reservoir een drieweg-luerkraan en bevestig hieraan een spuit van 30 milliliter waaruit de zuiger is verwijderd, een spuit van drie milliliter en het slangetje.Vul elk reservoir met de juiste buffer, ofwel stimulus S basal of S basal met fluoresceïne. Verwijder vervolgens eventuele luchtbellen uit zowel het reservoir als de slang door tegen de spuit te tikken en deze te pompen. Vul nu een nieuwe spuit van drie milliliter en de bijbehorende slang met S basal en plaats deze in de uitlaatpoort van het microfluïdische apparaat.Oefen voorzichtig een beetje druk uit op de spuit totdat de buffer aan het oppervlak van de inlaatgaten verschijnt. Sluit vervolgens de slangen van de flowcontrole, de buffer en het stimulusreservoir aan op de overeenkomstige inlaatgaten, waarbij u ervoor zorgt dat er vloeistofdruppels aanwezig zijn op zowel het gat van de laadpoort als op de aan te sluiten slang. Oefen nu voorzichtig iets meer druk uit op de spuit totdat er druppels verschijnen in de inlaat van de laadpoort voor de wormen, en plaats vervolgens een massieve blokkeringspin in die poort.Verwijder vervolgens de spuit uit de uitlaatpoort en bevestig een uitlaatleiding die is aangesloten op het vacuümsysteem van het laboratorium. Controleer nu het apparaat op luchtbellen in de vlotterkanalen via de videofeed van de microscoop. Klik op live om het live-beeld te bekijken en wacht tot de bellen vanzelf verdwijnen voordat u verdergaat.Zet vervolgens de fluorescerende lichtbron aan en gebruik een GFP-filter om de juiste stromingsdynamiek te bevestigen. Bedien het driewegventiel en observeer hoe de fluorescerende controlestroom in de videofeed verschijnt wanneer het ventiel openstaat. Om te beginnen, plaatst u één worm op een niet-gezaaide NGM-agarplaat en laat u de worm wegkruipen.Laat de plaat vervolgens drijven in S basal. Trek de oplossing met de worm op in de spuit. Zet nu op het apparaat het vacuüm uit om de stroom te stoppen met behulp van het Luer-uitlaatventiel.Verwijder vervolgens de vaste pin die de vulpoort voor de wormen blokkeert. Voer de slang met de wormen in de vulpoort in. Open het luer-uitlaatventiel en observeer de live videofeed.Oefen nu voorzichtig druk uit op de spuit totdat de worm verschijnt. Trek de worm terug als deze met de staart eerst naar binnen gaat; de worm moet met de kop eerst naar binnen gaan om aan de stimulus te worden blootgesteld. De gebruiker moet de worm terugtrekken voordat de staart volledig in het kanaal is gegaan, anders is het uiterst moeilijk om de worm uit het kanaal te krijgen, wat meestal vereist dat de worm volledig door het kanaal wordt gespoeld en er een nieuwe worm wordt geladen.Gebruik nu de druk van de spuit om de worm door het kanaal te bewegen en positioneer de kop van de worm zodanig dat deze wordt blootgesteld aan de bufferstroom, maar niet zo ver in het kanaal dat de worm vrij kan bewegen. Bij niet-verlamde dieren is een kleine hoeveelheid axiale of rotationele beweging te verwachten. De toevoeging van een paralyticum aan de buffers elimineert dit effect echter vrijwel volledig.Om de kans op beweging tijdens de proef te verkleinen, kunnen oudere mannetjes worden gebruikt omdat deze efficiënter gevangen worden, kan de breedte of dikte van de poort voor het laden van de wormen worden verkleind, of kan de tijd in het paralyticum worden verlengd. Gebruik de software om opnames te maken met excitatie door blauw licht. Stel de belichting in op 100 milliseconden, open het venster voor beeldacquisitie, stel het aantal tijdspunten in op 300 met een interval op nul, en start vervolgens de beeldacquisitie.Pas na vijf seconden de stimulus toe door de driewegkraan die de buffers regelt om te zetten. Een stimulatie van 10 seconden is een goed startpunt; de duur van de stimulus kan indien nodig worden aangepast. Schakel na de stimulatie de stroom terug door opnieuw op de knop te drukken en ga door met opnemen tot de video van 30 seconden is voltooid.Dit zorgt ervoor dat de g camp fluorescentie terugkeert naar de basislijn. Laat het preparaat nu 30 seconden rusten vóór de volgende trial. Wormen die g camp drie tot expressie brengen in het nosoceptieve neuron, ASH, reageren op één molair glycerol met zichtbare veranderingen in fluorescentie binnen het ASH-neuron, wat duidt op neurale activiteit.Het neuron moet gedurende de gehele video in het analysegebied blijven, anders kan er een bewegingsartefact optreden. Indien dit gebeurt, verplaats dan het analysegebied voor die tijdspunten en voeg de intensiteitswaarden samen om een enkele trace te creëren. Bij mannetjes die tijdens de blootstelling werden gestimuleerd met het aantrekkende biogene feromoon ascaroside three, werd de calciumtransiënt gemeten in de vier CEM-neuronen.Van dier tot dier en van neuron tot neuron varieerden de traces in vorm, teken en magnitude. Daarom is het zeer belangrijk om veel dieren te analyseren bij het bestuderen van feromonrespons. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een mannelijke C elegans in een microfluïdisch apparaat plaatst en de calciumtransiënten in hoofdneuronen analyseert.Hetzelfde proces kan worden gebruikt bij hermafrodieten om sekse-specifieke verschillen in neurale responsen te identificeren. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze voor het eerste te beelden dier in een half uur worden uitgevoerd. Na de eerste opname kan een nieuw dier in ongeveer 10 minuten worden geladen en in beeld worden gebracht.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals optogenetica, worden gecombineerd met dit protocol om verder inzicht te krijgen in hoe neurale circuits worden gereguleerd.

using-an-adapted-microfluidic-olfactory-chip-for-imaging-neuronal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We beschrijven een gevestigde techniek om te meten en geur-opgeroepen calcium antwoorden te analyseren in de antennaal kwab van het...

Calcium Imaging van Geur-reacties van de consument in de Drosophila Antennaal Lobe

Dit artikel geeft de protocollen van de intrinsieke optische signalen en flavoproteins autofluorescentie signalen beeldvorming in kaart geur-opgeroepen activiteiten op het oppervlak van het reukorgaan in muizen.

Imaging Geur-Opgeroepen activiteiten in de muis bulbus olfactorius met behulp van optische reflectie en autofluorescentie Signalen

Een eenvoudige microfluïdische apparaat is ontwikkeld om verdoving gratis uit te...

Eenvoudige Microfluïdische Inrichtingen voor<em&gt; In vivo</em&gt; Beeldvorming van<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; En zebravis

Hier beschrijven we een moleculaire uitlezing van langdurige geur...

Een Moleculaire Uitlezen van lange termijn Olfactorische aanpassing in<em&gt; C. elegans</em

We tonen variaties van de extracellulaire multi-unit opname techniek om geur-reacties van de consument te karakteriseren in de eerste drie fasen van de ongewervelde olfactorische pad. Deze technieken kunnen gemakkelijk worden aangepast aan ensemble activiteit onderzocht andere neurale systemen.

Multi-unit Opname Methoden om neurale activiteit karakteriseren in de Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfactorische Circuits

Drosophila larven zijn een aantrekkelijk model systeem voor live-imaging vanwege hun doorschijnende cuticula en krachtige genetica. Dit protocol beschrijft hoe u een single-layer PDMS apparaat, genaamd de 'larve chip' voor live-beeldvorming van cellulaire processen binnen neuronen van 3 e instar Drosophila larven benutten.

Met behulp van Microfluidics Chips voor Live Imaging en Studie van Injury Reacties in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Nieuwe hulpmiddelen voor het mechanobiology onderzoek nodig zijn om te begrijpen hoe mechanische spanning activeert biochemische paden en lokt biologische reacties. Hier presenteren we een nieuwe methode voor selectief mechanische stimulatie van geïmmobiliseerdet dieren met een val van de microfluidic waardoor hoge resolutie beeldvorming van cellulaire reacties.

Met behulp van een Microfluidics apparaat voor mechanische stimulatie en hoge resolutie Imaging van C. elegans

Dit protocol beschrijft het gebruik van genetisch gecodeerde Ca2 + verslaggevers om recordwijzigingen in neurale activiteit in gedragen Caenorhabditis elegans wormen.

Ratiometric Calcium beeldvorming van individuele neuronen in gedragen Caenorhabditis Elegans

Het protocol beschrijft een eenvoudig microfluïdisch chipontwerp en microfabricagemethodologie die wordt gebruikt om C. elegans te laten groeien in aanwezigheid van een continue voedselvoorziening gedurende maximaal 36 uur. Het groei- en beeldvormingsapparaat maakt ook intermitterende langetermijnbeeldvorming met hoge resolutie van cellulaire en subcellulaire processen mogelijk tijdens de ontwikkeling gedurende meerdere dagen.

Een eenvoudige microfluïdische chip voor groei op lange termijn en beeldvorming van Caenorhabditis elegans

Dit protocol stelt methoden vast voor het extraheren en kwantificeren van reacties op het vluchtige seksferomoon in C. elegans, en biedt hulpmiddelen om chemische communicatie en navigatietraject te bestuderen.

Vluchtige seksferomoonextractie en chemo-aantrekkingstest bij Caenorhabditis elegans

Dit protocol beschrijft op microfluïdische wijze gebaseerde C. elegans time-lapse-beeldvorming gedurende de gehele post-embryonale ontwikkeling.

Beeldvorming van C. elegans met hoge resolutie in alle larvale stadia

Leer calciumbeeldvorming in mannelijke C. elegans hoofdneuronen met een microfluidische olfactorische chip. Deze methode onthult neurale reacties op feromonen en geslachtsspecifieke circuitregulatie.

Met behulp van een aangepast Microfluidic olfactorische Chip voor de beeldvorming van neuronale activiteit in reactie op de feromonen in mannelijke C. Elegans hoofd neuronen (Video) | JoVE Journal

Met behulp van een aangepast Microfluidic olfactorische Chip voor de beeldvorming van neuronale activiteit in reactie op de feromonen in mannelijke C. Elegans hoofd neuronen

Meer video's verkennen