Name: Isolatie en Cultuur van Primaire Muis Keratinocyten Uit Neonatale en Volwassen Muis Huid (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Leer primaire muizenkeratinocyten isoleren uit neonatale en volwassen huid voor in-vitro differentiatiestudies en UVB-immuniteitonderzoek. Deze methode ondersteunt epidermale biologie en huidbarrièreonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door het NATIONALE INSTITUUT VAN ARTHRITIS EN MUSCULOSKELETAL AND SKIN DISEASES grant (R01AR069653 naar Zhang LJ), en National Institutes of Health Support (5T32AR062496-03 tot CA).

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door het UCSD Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Primere Muis KC Isolatie en Cultuur uit Neonatale Huid <ol><li> Offer de postnatale dag 0-2 neonaten uit de C57B / 6 wildtype muis stam door decapitatie met behulp van een schaar. Knip de ledematen net boven de pols- en enkelgewrichten af, snijd de staart helemaal af en laat een klein gatje. </li><li> Om de hele huid af te plakken, schuift u eerst een scherpe schaar door het gat aan de staart en snijd de huid langs de dorsale middenlijn van het lichaam naar de opening op de nek. Vervolgens gebruik één tang om het blootgestelde lichaam en de andere tang te grijpen om de huid te grijpen en schud de hele huid van het lichaam en over de beenstompen met een continue beweging af. <ol><li> Verwijder de huid als een intact stuk en wees voorzichtig om de huid niet in stukken te breken, aangezien dit celverlies tijdens de dispasstap zal veroorzaken. </li></ol></li> &lt;Li&gt; Spoel de geschilde huid met 15 ml steriele PBS in een 10 cm Petri-schotel en plaats de huid van elke pup in een 2 ml buis gevuld met ijskoude afzettingsbuffer, die 4 mg / ml dispas in KC groeimedium bevat (KC basismedium heeft 0,06 mM CaCl2, DG en antibiotica / antimycotica). OPMERKING: Meerdere huidisolaten kunnen gecombineerd en geïncubeerd worden in een 15 ml buis (tot 5 vellen per buis) die 12 ml dispasoplossing bevat. Incubeer de huidbuis overnacht in een 4 ° C koelkast op een rotator. <ol><li> Zorg ervoor dat de huid niet in de buis wordt gevouwen, omdat dit onvoldoende blootstelling van het gevouwen gebied tot de dispasoplossing zal veroorzaken. </li></ol></li><li> Vervolgens de volgende dag (na 12-18 uur in dispase) de huid samen met de dispasoplossing in een Petri-schotel overbrengen. Breng elk weefselstuk over naar een nieuwe Petri-schotel met 15 mL steriele PBS om overmatig dispas te wassen. </li><li> Gebruik twee paar tangjes, pak de huid van PBS,Lig de huid op en overplaats naar een nieuwe Petri schotel met de epidermale zijde naar beneden en de dermis kant omhoog. Strijk de huidvouwen voorzichtig uit zodat het volledig op de Petri-schotel wordt verlengd. </li><li> Plaats 500 μL van een trypsine-gebaseerde vertering oplossing voor elke huid in een nieuwe Petri schotel. Trek de dermis langzaam op en weg van de epidermis, terwijl u de epidermis vasthoudt. Verwijder de dermis als biohazard materiaal. Breng de gescheiden epidermis over en drijf op elke druppel trypsineoplossing met de basale laag naar beneden. <ol><li> Als de epidermis op de trypsineoplossing wordt gevouwen, verwijder eventuele plooien met behulp van pincet om een ​​efficiënte vertering van basale KC&#39;s uit het epitheel te waarborgen. </li></ol></li><li> Incubeer de huid op een petri schotel in trypsine-oplossing bij kamertemperatuur (met deksel bedekt) op een horizontale shaker met zachte agitatie gedurende 20 minuten. </li><li> Voeg 2 ml aangevuld KC groeimedium per epidermis toe (ongeveer 1 vierkante inch in grootte perEpidermis) aan de Petri schotel. Grijp de epidermis met behulp van tang en veeg de epidermis krachtig en heen en weer om enkele cellen uit het epidermale vel los te maken. <ol><li> Bekijk de middelste beurt steeds turbid als cellen los van de epidermis zijn. Kantel de Petri-schotel om de celsuspensie te verzamelen en over te brengen naar een nieuwe buis die het overblijvende epidermale blad op de schotel laat. </li></ol></li><li> Herhaal nog twee keer het wrijven van het epidermale vel na het toevoegen van 2 ml KC groeimedium, en combineer de cel suspensies in dezelfde buis. </li><li> Pipet de celoplossing zachtjes een paar keer zachtjes om alle celklompen te breken met behulp van een passend serologisch pipet, dan door een 100 μm filter naar een nieuwe 50 ml centrifugebuis. </li><li> Centrifugeer de gefiltreerde cellen gedurende 5 minuten bij 180 x g. </li><li> Aspirateer het supernatant en verzacht de celpellet voorzichtig opnieuw in 1 ml koud KC groeimedium / epidermis. </li><li> Tel de cellen met een hemocytometer. <br/&gt; OPMERKING: De KC&#39;s kunnen spontaan in suspensie onderscheiden, zodat de cellen zo snel mogelijk na isolatie moeten worden geplateerd om de optimale werking van de cellen te waarborgen. We raden aan om de cellen op ijs te plaatsen terwijl ze tellen, omdat dit de snelheid van KC spontane differentiatie vermindert. </li><li> Zaad de cellen bij een dichtheid van 5 x 10 4 / cm2 in groeimedium KC in kweekschalen vooraf bekleed met een extracellulaire matrix (ECM) product dat celhechting bevordert. OPMERKING: Wij gebruiken een commercieel beschikbaar (bijv. Bevestigingsfactor, dat is een gelatine-gebaseerde coatingmateriaal (zie de Tabel van Materialen voor details). Cellen werden gekweekt in bevochtigde incubator met 5% CO 2 bij 37 ° C en vers medium waren Opgevuld elke andere dag. <ol><li> Om de coating te bedekken, bedek de kweekschotels met het celbevestigingsbekledingsmateriaal gedurende 10 minuten tot 2 uur voor kamertemperatuur tot kamertemperatuur. Verwijder de bijlage factor net voorToevoegen van de cel suspensie. </li></ol></li><li> Vervang het medium 24 uur na de eerste plating om losgebonden cellen te verwijderen en verander het medium dagelijks totdat de cellen voorafgaand aan het experiment de gewenste confluentie bereiken. </li></ol> 2. Primaire muizen KC-isolatie uit de volwassene staarthuid <ol><li> Offer een volwassen C57BL / 6 muis (bij voorkeur tussen 6-15 weken oud, ofwel man of vrouw) volgens de dierenvoorschriften. Knip de staart van het lichaam af van de staartbasis en snij ~ 2 mm van de staartpunt af, zodat er een zichtbaar gat bij de punt is. </li><li> Om de staarthuid af te schillen, gebruik eerst een scherp mes om de staarthuid van de basis naar de staart te snijden. Gebruik vervolgens een pincet om het blootgestelde staartbeen en de andere pincet te grijpen om de huid te grijpen en schud de staarthuid van het bot met een continue beweging af. Knip de geschilde huid van de middellijn zodat elk stuk minder dan 2-3 cm lang is. </li><li> Spoel de geschilde huid witH 15 ml steriele PBS in een 10 cm Petri-schotel, plaats dan de huid van elke staart in een 2 ml buis gevuld met ijskoude afgiftebuffer (4 mg / ml dispas in KC groeimedium). OPMERKING: Veelvoudige huidstukken kunnen ook gecombineerd en geïncubeerd worden in een 15 ml buis (tot 5 staart per buis) die 12 ml dispasoplossing bevat. <ol><li> Incubeer de huidbuis overnacht in een 4 ° C koelkast op een rotator. </li></ol></li><li> Voer stappen 1.4 tot 1.13 uit om de enkelcelsuspensie van de staart-epidermis te isoleren. </li><li> Zaad de volwassen cellen bij een dichtheid van 10 x 10 4 / cm2 (geteld met een hematocytometer) in KC groeimedium in kweekschalen voorbekleed met collageen. OPMERKING: we gebruiken een in de handel verkrijgbare collageen gebaseerde coating kit (zie de tabel van materialen voor details). Cellen werden gekweekt in bevochtigde incubator met 5% CO2 bij 37 ° C, en vers medium werd om de dag bijgevuld. In het algemeen is de cCulturen moeten gedurende 30 minuten tot 1 uur voorafgaand aan de celzaad worden gecoateerd met collageen. We merken op dat er een significante verbetering van de volwassen KC-bijlage op het gerecht is wanneer het wordt gecoat met collageen in vergelijking met de bevestigingsfactor, die een gelatine-gebaseerde bekledingsmateriaal is. </li><li> Vervang het medium 24 uur na de eerste plating om losgebonden cellen te verwijderen en verander het medium dagelijks totdat de cellen voorafgaand aan het experiment de gewenste confluentie bereiken. </li></ol> 3. In Vitro Differentiatie van KC&#39;s door middel van hoog calcium <ol><li> Naar terminale differentiatie induceren voeg CaCl 2-0,2 mM in het kweekmedium. </li><li> Alternatief, verhit de gekweekte KC&#39;s overnacht zonder extra toegevoegde groeistoffen in een laag calcium KC basaal medium voorafgaand aan de toevoeging van hoog calcium. OPMERKING: Groei factor hongersnood zal de celverbintenis tot vroege differentiatie verbeteren en de inductie van vroege differentiatie markers, zoals K10 5 </sup&gt;. </li></ol> 4. UVB Bestraling Gemedieerde Cell Death en TNFa Release van KCs <ol><li> Cultuur de muis KC&#39;s in KC groeimedium (in bevochtigde incubator met 5% CO 2 bij 37 ° C) met dagelijkse gemiddelde verandering tot de cellen confluentie bereiken. Onmiddellijk voor de UVB-bestraling, verwijder het groeimedium en vervang met 500 μl PBS. Vervolgens de cellen onderworpen aan 25 mJ / cm 2 UVB of mock control (geen UVB). OPMERKING: UVB bestraling wordt uitgevoerd met handheld UVB lampen met twee 8 W lampen (312 nm) zoals eerder beschreven 10 . Na UVB-bestraling wordt PBS gesuspendeerd en vers medium toegevoegd. </li><li> Meet en kwantificeer de cellevendabiliteit door de CCK-8-cellevendabiliteitsbepaling bij 6, 8 en 24 uur na UVB-behandeling volgens de instructie van de fabrikant 11 . </li><li> Verzamel het gecondenseerde medium uit de KC&#39;s die met UVB zijn behandeld op gewenste tijdspunten en meet de toegediende TNFaIn het gecondenseerde medium door de Mouse TNF (Mono / Mono) ELISA kit volgens de instructies van de fabrikant 7 , 12 . </li></ol>

<ol><li>Mauro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+barrier+perturbation+abolishes+the+Ca2%2B+and+K%2B+gradients+in+murine+epidermis%3A+quantitative+measurement+using+PIXE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE.</a> J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).</li>
<li>Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+calcium+reservoirs+in+mammalian+epidermis%3A+ultrastructural+localization+by+ion-capture+cytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry.</a> J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).</li>
<li>Elias, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+epidermal+calcium+gradient+coincides+with+key+milestones+of+barrier+ontogenesis+in+the+rodent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent.</a> J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).</li>
<li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li>
<li>Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctip2+is+a+dynamic+regulator+of+epidermal+proliferation+and+differentiation+by+integrating+EGFR+and+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).</li>
<li>Lai, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+bacteria+regulate+Toll-like+receptor+3-dependent+inflammation+after+skin+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury.</a> Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).</li>
<li>Bernard, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+radiation+damages+self+noncoding+RNA+and+is+detected+by+TLR3%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3.</a> Nat Med. 18 (8), (2012).</li>
<li>Zhang, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+Peptide+LL37+and+MAVS+Signaling+Drive+Interferon-beta+Production+by+Epidermal+Keratinocytes+during+Skin+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury.</a> Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).</li>
<li>Borkowski, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-Like+Receptor+3+Activation+Is+Required+for+Normal+Skin+Barrier+Repair+Following+UV+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage.</a> J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).</li>
<li>Borkowski, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+3+activation+is+required+for+normal+skin+barrier+repair+following+UV+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage.</a> J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).</li>
<li>Zillessen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+role+of+dipeptidyl+peptidase+4+%28DPP4%29+in+primary+human+%28pre%29adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes.</a> Sci Rep. 6, 23074(2016).</li>
<li>Wells, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage-inducible+C-type+lectin%2C+mincle%2C+is+an+essential+component+of+the+innate+immune+response+to+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans.</a> J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).</li>
<li>Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+actin+polymerization+is+the+driving+force+for+epithelial+cell-cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion.</a> Cell. 100 (2), 209-219 (2000).</li>
<li>Zhuang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF+receptor+p55+plays+a+pivotal+role+in+murine+keratinocyte+apoptosis+induced+by+ultraviolet+B+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation.</a> J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).</li>
<li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes%2C+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).</li>
<li>Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+utilization+of+epidermal+keratinocytes+for+oncogene+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research.</a> Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).</li>
<li>Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse keratinocytes.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15502164">Primary mouse keratinocyte culture.</a> Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).</li>
<li>Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+murine+epidermal+differentiation+markers+is+tightly+regulated+by+restricted+extracellular+calcium+concentrations+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro.</a> J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).</li>
<li>Yuspa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+for+proliferation+and+differentiation+in+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes.</a> Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).</li>
<li>Fang, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+enhances+mouse+keratinocyte+differentiation+in+vitro+to+differentially+regulate+expression+of+papillomavirus+authentic+and+codon+modified+L1+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes.</a> Virology. 365 (1), 187-197 (2007).</li>
<li>Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+cell+cycle+exit%2C+and+onset+of+terminal+differentiation+in+cultured+keratinocytes%3A+pre-programmed+pathways+in+control+of+C-Myc+and+Notch1+prevail+over+extracellular+calcium+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals.</a> J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).</li>
<li>Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+1.2+mmol%2Fl+calcium%2C+triamcinolone+acetonide%2C+and+retinoids+on+low-calcium+regulated+keratinocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation.</a> Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 64-72 (1984).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De huid epidermis functioneert als een kritieke barrière om het lichaam te scheiden en te beschermen tegen de buitenomgeving en schade door waterverlies, pathogenen, hitte en UV-bestraling. De KC&#39;s zijn de overheersende cellijn van de epidermis, en de primaire cultuur van epidermale KC&#39;s is een nuttig instrument om de biologische processen van barrièrevorming en de respons van KC&#39;s te bestuderen en te begrijpen op milieubeledigingen in vitro . Hier beschrijven we methode...

De huid is het grootste orgaan in het lichaam met de epidermis als de buitenste laag. De epidermis speelt een cruciale rol bij het vormen van een intacte epidermische barrière om het lichaam van het milieu af te scheiden, waardoor waterverlies voorkomt en bescherming biedt tegen milieubeledigingen, zoals allergenen, pathogenen en UVB-blootstelling. De epidermis ontwikkelt zich uit een enkele laag ongedifferentieerde basale keratinocyten (KC&#39;s) in een multi-layered stratified epithel bestaande uit een basale laag, gevolgd door een spinous layer, granulaire laag en stratum corneum. Basale KC&#39;s, bestaande uit zowel epidermale stamcellen als transit-amplificerende cellen, zijn proliferatief en ongedifferentieerd. Als de basale KC&#39;s de celcyclus verlaten, plegen de cellen op differentiatie en migreren ze geleidelijk naar het oppervlak van de epidermis, vergezeld van de rijping van celcellen en vorming van een epidermale doorlaatbaarheidsbarrière (EPB). De KC&#39;s bij de spinous laag drukken vroege differentiaat uitIonmarkers zoals Keratin 10 (K10); Als de KC&#39;s migreren naar de korrellaag, worden de cellen uitgedrukt in late differentiatie markers zoals Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) en Involucrin (INV). Bij de stratum corneum worden de KC&#39;s terminale gedifferentieerde corneocyten, die uiteindelijk door ontsmetting worden afgevoerd als nieuwe cellen ze vervangen. Calcium wordt beschouwd als het meest fysiologische middel in de epidermis en verschilt op een vergelijkbare manier in vitro en in vivo differentiatie. Bij normale huid-epidermis vormen calciumionen een karakteristieke &#39;concentratiegradiënt&#39;, waardoor de concentratie naar het huidoppervlak 1 , 2 , 3 toeneemt. De calciumconcentratie stijgt van lage niveaus in de laagste onderlagen (basale en spinale lagen) tot een piek in de bovenste korrellaag en druppelt dan naar verwaarloosbare niveaus in de meest oppervlakkige laag (stratum corneum).<html> De calciumgradiënt ontwikkelt ook toevallig met de opkomst van een componentpermeabiliteitsbarrière, die ondersteunt dat calciumsignaal een cruciale rol speelt bij KC-differentiatie. In vitro handhaaft lage calcium (0,02-0,1 mM) de proliferatie van basale KC&#39;s als een monolaag, terwijl hoog calcium (&gt; 0,1 mM) een snelle en onomkeerbare inzet van de cellen tot terminale differentiatie veroorzaakt, zoals aangetoond door middel van nauwe verbinding en inductie Van LOR en INV op hoge calciumbehandeling aan de basale KCs 4 , 5 . Naast barrièrevorming zijn epidermische KC&#39;s ook een belangrijk onderdeel van het aangeboren immuunsysteem van de huid. Als reactie op pathogenen of beschadigde geassocieerde moleculaire patronen (DAMP&#39;s) die worden vrijgegeven bij UVB-bestraling of verwonding, kunnen KC&#39;s grote hoeveelheden inflammatoire cytokinen produceren, zoals TNFa, IL6 en IFNβ, wat leidt tot het activeren van immuunsysteem&gt; 6 , 7 , 8 , 9 . Hoewel een goede ontstekingsmelding van KC&#39;s nodig is voor pathogeenvrijstelling, kan onbeheerde ontstekingsreactie de ontwikkeling van auto-inflammatoire huidziekten veroorzaken, zoals psoriasis en rosacea 6 , 8 . In het algemeen spelen KC&#39;s een vitale rol bij het handhaven van de intacte huidbarrière en het initiëren van een immuunrespons bij patogene invasie of milieubeledigingen. Daarom is de primaire cultuur van epidermale KC&#39;s een nuttige techniek om de epitheliale biologie, KC-differentiatie, en KC-gestimuleerde aangeboren immuunresponsen te bestuderen. De isolatie en cultuur van primaire muis epidermale KC&#39;s kan een uitdagend proces zijn door de gevoeligheid en gevoeligheid van KC voor diverse externe stimulanten. Hier beschrijven we een methode om KC&#39;s te isoleren en te cultiveren uit ofwel neonatale muishuid ofVolwassen muis staart huid. Voor volwassen KC-isolatie gebruiken we geen dorsale huid van de muis omdat voldoende hoeveelheden levensvatbare KC&#39;s uit dit weefsel kunnen isoleren, om de volgende redenen moeilijk kunnen zijn: Eerst bestaat de volwassen dorsale huid in de rustfase van de haarcyclus (telogen) uit een Dunne epidermis met slechts 1-2 lagen cellen, wat leidt tot een lage celopbrengst en inefficiënte scheiding van de epidermis uit de dermis, die de kritische stap voor succesvolle KC-isolatie is. Ten tweede draagt ​​de hoge haarfollikeldichtheid die aanwezig is op volwassen dorsale huid bij tot de moeilijkheid bij het scheiden van epidermis uit de dermis. In plaats daarvan gebruiken we routinematig staarthuid als bron voor volwassen muis KC&#39;s, omdat dit epithelium dikker is met 3-5 lagen epidermale KC&#39;s. Het heeft ook een lagere haarfollikeldichtheid, die de epidermische afscheiding niet interfereert, waardoor KC-isolatie van elke volwassen muissterthuid mogelijk maakt, ongeacht de leeftijds- en haarcyclusfase van de muis. De geïsoleerde neonaTal KC&#39;s worden geperst op gelatine gecoate kweekschotels, terwijl kollageencoatede schotels worden gebruikt om geïsoleerde volwassen KC&#39;s te zaaien als gevolg van het verminderde vermogen van de volwassen cellen om te hechten in vergelijking met hun neonatale tegenhangers. Om de KC&#39;s van het muizen te cultiveren, wordt het basale calciummedium laag aangevuld met dGS, die epidermale groeifactor (EGF), boviene transferrine, insulineachtige groeifactor1 (IGF1), prostaglandine E2 (PGE2), boviene serumalbumine (BSA) en hydrocortison bevat. Tussen 2-4 dagen na de eerste plating kunnen de meeste van de gedifferentieerde KC&#39;s weggewassen worden tijdens dagelijkse mediumveranderingen, en de overige aanhechtende cellen tonen de typische kolfsteenmorfologie 4 , zijn proliferatie en drukken de vroege differentiatie markering K10 niet uit.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 neonaten of volwassen wildtype muizen</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>Wildtype muizen (oorspronkelijk gekocht van Jackson Laboratory) worden gekweekt en onderhouden in dierenlaboratorium bij UCSD.</td></tr><tr><td>KC basaal medium (EpiLife)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>MEPICF500</td><td>basaal medium voor keratinocytenkweek met 0,06 mM CaCl2</td></tr><tr><td>Gedefinieerd groeisuplement (dGS)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>S0125</td><td>gedefinieerde groeisuplementen voor kweekmedium</td></tr><tr><td>Dispase poeder</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>17105041</td><td>enzym om de epidermis los te maken van de dermis</td></tr><tr><td>Hechtingsfactor</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>S006100</td><td>gelatine-gebaseerd coatingmateriaal</td></tr><tr><td>Coating Matrix</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>R011K</td><td>Collageen-gebaseerd coatingmateriaal</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>12604-013</td><td>Een zachte trypsine-achtige enzym om keratinocyten los te maken van het epidermale blad</td></tr><tr><td>100 μm celzeven Nylon gaas</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 celviabiliteitskit</td><td>Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD</td><td>CK04-11</td><td></td></tr><tr><td>Muis TNF (Mono/Mono) ELISA Set II</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>555268</td><td></td></tr><tr><td>Snoerdraagbare UV-lampen</td><td>Spectronics, Westbury, NY</td><td>EB-280C</td><td></td></tr><tr><td>8-watt UV-buizen</td><td>Spectronics, Westbury, NY</td><td>BLE-8T312</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerd geplaatste microscoop voor celkweek</td><td>ZEISS, Jena, Duitsland</td><td>Axio Observer</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Olympus</td><td>BX41</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en cultuur van primaire muis keratinocyten uit neonatale en volwassen muis huid

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

De keratinocyt (KC) is het overheersende celtype in de epidermis, de buitenste laag van de huid. Epidermale KC&#39;s spelen een cruciale rol in de bescherming van de huid door een intacte huidbarrière tegen milieubeledigingen te vormen, zoals UVB-bestraling of pathogenen, en ook door een ontstekingsrespons op die beledigingen te starten. Hier beschrijven wij methoden om KC&#39;s te isoleren van de neonatale muishuid en van de volwassen staarthuid van volwassenen. We beschrijven ook cultuuromstandigheden met gebruikmaking van gedefinieerde groeitillsupplementen (dGS) in vergelijking met chelexed foetale boviene serum (cFBS). Functioneel tonen wij aan dat zowel neonatale als volwassen KC&#39;s zeer responsief zijn voor hoge calciumgeïnduceerde terminale differentiatie, nauwe kruisvorming en stratificatie. Daarnaast zijn gekweekte volwassen KC&#39;s gevoelig voor UVB-geactiveerde celdood en kunnen grote hoeveelheden TNF vrijkomen bij UVB-bestraling. Samen zullen de hier beschreven methodes nuttig zijn voor onderzoekers voor de opstelling van het in vitro modelS epidermale biologie in de neonatale muis en / of de volwassen muis bestuderen.

Hoge calcium geïnduceerde terminale differentiatie van neonatale en volwassen KC&#39;s. De primaire muis epidermale KCS uitgeplaat en gehandhaafd op 0,06 mM CaCl2 gegroeid als monolaag en individuele cellen hadden een veelhoekige vorm met verschillende intercellulaire ruimte, toont een geplaveide uiterlijk bij confluent (Figuur 1A en Figuur 2A). Verhogen van de CaCl 2-0,2 mM veroorzaakte ee...

Epidermale keratinocyten vormen een functionele huidbarrière en worden gepositioneerd in de voorste lijn van de gastheerverdediging tegen externe milieubeledigingen. Hier beschrijven we methoden voor isolatie en primaire cultuur van epidermale keratinocyten van neonatale en volwassen muishuid, en inductie van terminale differentiatie en UVB-geactiveerde ontstekingsrespons van keratinocyten.

Isolatie en Cultuur van Primaire Muis Keratinocyten Uit Neonatale en Volwassen Muis Huid

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van primaire muiskeratinocyten uit neonatale of volwassen muizenhuid voor in-vitro differentiatie of om hun aangeboren immuunreacties op UVb-blootstelling te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de epidermale biologie over hoe la keratinocytdifferentiatie wordt gereguleerd of hoe epidermale keratinocyten reageren op externe stimuli. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat de keratinocyten op conventionele wijze kunnen worden geïsoleerd uit zowel neonatale als volwassen muizenhuid en dat ze serumvrij kunnen worden gekweekt.De procedure wordt gedemonstreerd door Fengwu Li, een staff research associate uit mijn laboratorium. Begin met het verwijderen van de ledematen van een wild-type C57 BL6 pasgeboren muis van nul tot twee dagen oud, net boven de gewrichten van de polsen, en knip de staart volledig af waarbij een klein stompje overblijft. Steek een scherpe schaar door het gat van de staart en snijd de huid langs de dorsale middellijn van het lichaam tot aan de opening bij de nek.Pak met één pincet het blootgestelde lichaam vast en gebruik een tweede pincet o

isolation-culture-primary-mouse-keratinocytes-from-neonatal-adult

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een snelle, robuuste manier van isoleren levensvatbare volwassen epitheliale stamcellen uit menselijke huid is beschreven. De methode maakt gebruik van enzymatische afbraak van de huid collageen matrix, gevolgd door het plukken van de haarfollikels en isolatie van single cell suspensies of weefsel fragmenten voor celkweek.

Isolatie en Cultuur van Volwassen epitheliale stamcellen uit menselijke huid

This video describes the isolation of keratinocytes—the most prominent cells of human skin's epidermal layer, by employing a combination of enzymatic digestion and mechanical disruption methods. This method helps in the preferential growth of keratinocytes over other skin cell types using a selective growth medium.

Human Skin Keratinocyte Isolation: A Method to Culture Primary Keratinocytes from Skin Samples

Een ideaal model voor het bestuderen van de biologie van volwassen stamcellen is de muis haarfollikel. Hier presenteren we een protocol voor het isoleren van verschillende populaties van haarfollikelstamcellen en epidermale keratinocyten, met behulp van enzymatische vertering van de dorsale muishuid gevolgd door FACS-analyse.

Isoleren haarfollikel stamcellen en epidermale keratinocyten van Dorsale Mouse Skin

De menselijke huid fungeert als een eerste lijn van verdediging tegen de externe omgeving. Presenteren we een methode voor het isoleren van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid. Deze geïsoleerde keratinocyten zijn nuttig in talrijke experimentele opstellingen en een zeer geschikt model voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen in cutane biologie in vitro.

Generatie en kweken van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid

Hier presenteren we een protocol om efficiënt isoleren primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid weefsels. Deze methode vereenvoudigt de conventionele procedure met behulp van de Y-27632 van de Inhibitor van de omwenteling ROCK in het medium van de inoculatie spontaan epidermale cellen uit dermale cellen scheiden.

Een vereenvoudigde en efficiënte methode om te isoleren van de primaire mens keratinocyten van volwassen huidweefsel

Het doel van dit protocol is het isoleren van epidermale keratinocyten uit de rughuid van volwassen muizen voor een verscheidenheid aan downstreamtoepassingen zoals moleculaire biologie, biochemie, fluorescentie geactiveerde celsortering en primair in vitro gebruik (bijv. clonogene keratinocyten).

Isolatie van muizen epidermale keratinocyten en hun in vitro Clonogene cultuur

Dit protocol beschrijft hoe de huid keratinocyten van Muismodellen te isoleren, te vlekken met metaal-gelabelde antilichamen, en om bevlekte cellen te analyseren door massa cytometrie om het patroon van de expressie van eiwitten van belang in de verschillende celcyclus fasen profiel.

Isolatie en kleuring van de muis huid keratinocyten voor celcyclus specifieke analyse van cellulaire eiwit expressie door massa Cytometrie

Hier beschrijven we een protocol voor de systematische teelt van epidermale sferoïden in 3D-suspensiecultuur. Dit protocol heeft uitgebreide toepassingen voor gebruik in een verscheidenheid van epitheelweefseltypes en voor het modelleren van verscheidene menselijke ziekten en voorwaarden.

Het opzetten van een epidermale sferoïde cultuursysteem met hoge doorvoer om keratinocytstamcelplasticiteit te modelleren

Het huidige protocol beschrijft de isolatie en cultuur van orale keratinocyten afgeleid van het volwassen muizengehemelte. Een evaluatiemethode met behulp van immunostaining wordt ook gemeld.

Isolatie en kweek van primaire orale keratinocyten uit het volwassen muizengehemelte

Dit protocol schetst de kweek van vers verkregen (passage 0) keratinocyten voor gebruik in beeldvorming van levende cellen.

Genereren van primaire culturen voor beeldvorming van levende cellen van keratinocyten

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie, zuivering en kweek van primaire marginale cellen uit de muis stria vascularis, en voor het opstellen van in vitro modellen van oxidatieve stress en cellulaire senescentie om cochleaire laterale wandaandoeningen te bestuderen.

Isolatie en kweek van primaire marginale cellen van de stria vascularis uit neonatale muizen

Leer primaire muizenkeratinocyten isoleren uit neonatale en volwassen huid voor in-vitro differentiatiestudies en UVB-immuniteitonderzoek. Deze methode ondersteunt epidermale biologie en huidbarrièreonderzoek.

Isolatie en Cultuur van Primaire Muis Keratinocyten Uit Neonatale en Volwassen Muis Huid

Meer video's verkennen