Name: Horizontale Gel Electroforese voor Verbeterde Detectie van Proteïne-RNA Complexen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Leer horizontale native gel-elektroforese voor analyse van RNA-eiwitinteracties. Deze methode maakt real-time monitoring van complexvorming mogelijk tijdens elektroforese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Laura Vanderploeg voor het voorbereiden van cijfers. Werk in het laboratorium Sheets wordt ondersteund door NSF grant 1050395 en NIH grant (R21HD076828). Werk in het Ryder lab wordt ondersteund door NIH subsidies R01GM117237 en R01GM117008. Megan Dowdle wordt ondersteund door een SciMed GRS Advanced Opportunity Fellowship door het University of Wisconsin-Madison Graduate School en Biotechnology Training Programma door het Nationaal Instituut voor Algemene Medische Wetenschappen van de National Institutes of Health (T32GM008349).

1. Bereiding van de Horizontale Native Polyacrylamide Gel 4 . <ol><li> Voorbereiding van de benodigde materialen. <ol><li> Voor het horizontale gelapparaat gebruik een gelendoos (37 cm x 24 cm) met een 27 cm x 21 cm lade en een capaciteit voor twee combinaties met 24 putjes. Deze installatie biedt in totaal 48 monsters die tegelijkertijd kunnen worden geanalyseerd. </li><li> Bereid de volgende reagentia voor: 40% Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8,0), TEMED en 10% APS (ammoniumpersulfaat). </li></ol></li><li> Generatie van een 10% native acrylamide gel. <ol><li> Voeg in een 500 ml fles 80 ml 5x TBE, 100 ml 40% acrylamide en water toe aan een eindvolume van 400 ml. </li><li> Voeg 4 ml 10% APS en 400 μL TEMED toe. Goed mengen. </li><li> Giet de mix in de horizontale gietbak en laat de gel 30 minuten polymeriseren. De gel zal ongeveer 2 cm dik zijn. OPMERKING: Gelegels kunnen snel in een dampkap werpenUp polymerisatie. Na polymerisatie blijft een dunne laag vloeistof boven op de gel. </li><li> Giet de vloeistof af en spoel met rennende buffer. Verwijder de kam (en) zorgvuldig en spoel de putjes met rennende buffer met een spuit. </li></ol></li><li> Bereiding van loopbuffer. <ol><li> Bereid 2 L van 1x TBE loopbuffer voor de gelkast. Verdun 400 ml 5XTBE met 1600 ml en meng. Plaats 1x TBE buffer in de koude kamer om af te koelen. </li></ol></li><li> Voorloop van de gel <ol><li> Voeg 2 liter koudloopbuffer aan de gelkastoos toe en plaats de gel. </li><li> Pre-run de gel bij 120 V gedurende 1 uur bij 4 ° C in een koude kamer. Bereid tijdens deze tijd de bindingsreactie. </li></ol></li></ol> 2. Bindende reactie 8 <ol><li> 2.1.Perpareer de volgende reactiekomponenten. 20 mM DTT 10 mM BSA 10 mM gist tRNAs 5x bindingsbuffer (50 mM HEPES pH 8,0, 5 mM EDTA, 250 mM KCl, 0,2% Tween-20) 100 nM fluoresceïne gelabelde RNA commercieel gekocht Geconcentreerd Bicaudal-C eiwit 50% glycerol in met DEPC behandeld H2O DEPC behandeld H2O </li><li> Monteer de bindingsreactiekomponenten in een RNase-vrije microcentrifugebuis. <ol><li> Voeg bij de buis 5 μl 10 mM BSA, 5 μl 20 mM DTT, 5 μl 10 mM gist tRNAs, 10 μl 5x bindende buffer. </li></ol></li><li> Voeg eiwit toe aan een eindconcentratie van 250 nM in 50 μl. Voeg water toe aan een eindvolume van 45 μl. </li><li> Voeg 5 μl fluorescent gemerkt RNA substraat toe. Gebruik een in de handel verkochte 3 &#39;fluoresceïne gelabelde 32-nucleotide substraat. </li><li> Meng en incubeer in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol> 3. Analyse van monsters op de natuurlijke horizontale polyacrylamide gel <ol><li> Voeg bij elke reactie 15 μL 50% glycerol toe en meng zachtjes. </li><li> CarefuVoeg 30 μl van elke reactie op de gel toe. De hoeveelheid monster die in een enkele put kan worden geladen, varieert afhankelijk van de dikte van de gel en de grootte van de putten. We hebben geladen volumes tot 15 μL en zo veel als 45 μL in een enkele bron van gels gecreëerd met een 24-brons kam en gegoten tot een dikte van 2 cm. </li><li> Nadat u de stroomtoevoer aan de gelapparatuurschakelaar aan het stopcontact hebt aangesloten en de spanning aanpast. Run de gel in 4 ° C op 120 V. OPMERKING: Voor het horizontale gelapparaat komt dit overeen met ongeveer 5 V / cm. Voor het verticale gelapparaat is dit 16 V / cm. <ol><li> Om schade of bleken van het fluorescent gelabelde RNA te voorkomen, voer elektroforese in het donker. </li><li> Variërende elektroforese tijden afhankelijk van de specifieke kenmerken van het RNA-eiwit complex dat wordt geanalyseerd. OPMERKING: Een belangrijk voordeel van de horizontale EMSA analyse is dat elektroforese kan worden gestopt, de gel afgebeeld en vervolgens de geIk kan terug in het apparaat worden geplaatst en elektroforese kan langer worden voortgezet. </li></ol></li></ol> 4. Imaging de Gel <ol><li> Analyse uitvoeren met elk instrument dat is ontworpen voor het detecteren en imaging van fluorescerende substraten. </li><li> Plaats de gel op de imager. </li><li> Beeldinstellingen aanpassen. Voor fluoresceine-gelabelde RNA liganden, gebruik de volgende instellingen: FAM (golflengte 473 nm), 750 fotomultiplierspanning (PMT), 100 μm pixelgrootte. </li><li> Scan de gel om de afbeelding vast te leggen. </li></ol>

<ol><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li>
<li>Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+characterization+of+bacterial+polyribosomes+in+agarose-acrylamide+composite+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels.</a> J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).</li>
<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+recognition+by+the+embryonic+cell+fate+determinant+and+germline+totipotency+factor+MEX-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).</li>
<li>Royer, C. A., Scarlata, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+approaches+to+quantifying+biomolecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions.</a> Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).</li>
<li>Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoresis+of+proteins+and+protein-protein+complexes+in+native+polyacrylamide+gels+using+a+horizontal+gel+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus.</a> Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).</li>
<li>Buczek, P., Horvath, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+Characterization+of+Binding+Oxytricha+nova+Single+Strand+Telomere+DNA+with+the+Alpha+Protein+N-terminal+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain.</a> J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).</li>
<li>Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA+binding+and+translational+repression+by+the+Bicaudal-C+regulatory+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein.</a> J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).</li>
<li>Gamberi, C., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bic-C+family+of+developmental+translational+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">The Bic-C family of developmental translational regulators.</a> Comp Funct Genomics. , 141386(2012).</li>
<li>Saffman, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+translation+of+oskar+in+oocytes+lacking+the+RNA-binding+protein+bicaudal-C%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C.</a> Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).</li>
<li>Chicoine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+recruits+CCR4-NOT+deadenylase+to+target+mRNAs+and+regulates+oogenesis%2C+cytoskeletal+organization%2C+and+its+own+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression.</a> Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+spatially+controls+translation+of+vertebrate+maternal+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs.</a> RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).</li>
<li>Maisonneuve, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal+C%2C+a+novel+regulator+of+Dvl+signaling+abutting+RNA-processing+bodies%2C+controls+cilia+orientation+and+leftward+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow.</a> Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).</li>
<li>Tran, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+bicaudal+C+regulates+polycystin+2+in+the+kidney+by+antagonizing+miR-17+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity.</a> Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).</li>
<li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17 (1), 14-20 (2011).</li>
<li>Foley, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platform+to+Enable+the+Pharmacological+Profiling+of+Small+Molecules+in+Gel-Based+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays.</a> J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Inheemse polyacrylamidegelen zijn een waardevol hulpmiddel om eiwit-RNA-interacties te onderzoeken en traditioneel worden deze gels verticaal 2 , 3 elektroforeseert. Wij hebben een wijziging van het protocol gebruikt dat de inheemse polyacrylamide gels creëert en horizontaal 1 , 4 , 6 , 7 , 15 elektro...

Elektroforetische mobiliteitsverschuivingsbepalingen (EMSA&#39;s) blijken een waardevol biochemisch instrument te zijn om specifieke eiwit-nucleïnezuurinteracties 1 , 2 , 3 te analyseren. Deze analyses kunnen belangrijke informatie verschaffen over de bindingsaffiniteit van eiwitten aan RNA of DNA 3 , de componentstochiometrie van nucleïnezuur-eiwitcomplexen 1 en verschaffen belangrijke nieuwe inzichten over de bindingsspecificiteit van RNA bindende eiwitten via substraatconcurrentie experimenten 1 . De traditionele experimentele opstelling voor deze analyses bestaat uit het mengen van gezuiverd eiwit met een radioactief gemerkt RNA-substraat. De resulterende complexen worden vervolgens geanalyseerd met niet-denaturerende (inheemse) polyacrylamidegelen die tussen twee glazen platen worden gegoten, gevolgd door monsterelektroforese in een verticaal apparaat 3. Hoewel deze benadering extensief is gebruikt om belangrijke inzichten te verschaffen in de biochemische mechanismen die de binding van eiwitten tot nucleïnezuren onderbouwen, heeft het ook verschillende beperkingen. Deze basisstrategie heeft bijvoorbeeld een relatief lage doorvoer en het is niet gemakkelijk aan te passen voor toepassingen waarbij parallel bindende reacties nodig zijn. Bovendien is het bij het traditionele verticale apparaat uitdagend om meerdere keren complexen mogelijk te houden tijdens elektroforese 3 , 4 . Hier presenteren we een aanpassing van de EMSA-analyse die gebruik maakt van inheemse polyacrylamidegels die worden gegoten in een flatbed apparaat, horizontale elektroforese en fluorescent gelabelde RNA substraten 4 , 5 , 6 , 7 . De opneming van deze relatief eenvoudige wijzigingen van de basis straTegy biedt een aantal sterke voordelen. In het bijzonder leent het horizontale platform formaat zich gemakkelijk om tientallen monsters tegelijkertijd 4 te analyseren. Ook voor sommige RNA-eiwitcomplexen, zoals die gevormd tussen het Bicaudal-C-eiwit en zijn RNA-substraatelektroforese in een horizontale gel, verschaft een verhoogd vermogen om afzonderlijke RNA-eiwitcomplexen op te lossen en deze te onderscheiden van het niet-gebonden RNA-substraat.

<table><tbody><tr><td>Horizontal Gel Box</td><td>OWL</td><td>N/A</td><td>Product niet meer gemaakt. Soortgelijke gelboxen zijn te vinden bij Thermo Scientific, A-serie gelboxen. Catalogusnummer: A2-BP</td></tr><tr><td>24-well grote horizontale gelelektroforese kammen</td><td>OWL</td><td>N/A</td><td>Product niet meer gemaakt. Soortgelijke gelboxen zijn te vinden bij Thermo Scientific, A-serie gelbox kammen. Catalogusnummer: A2-24C</td></tr><tr><td>Powerpac 300</td><td>Bio-Rad</td><td>1655050</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean II Electrophoresis Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2940</td><td></td></tr><tr><td>InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis</td><td>IBI</td><td>IB70015</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>IBI</td><td>IB70120</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>IBI</td><td>IB70080</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNAs</td><td>Ambion</td><td>AM7119</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceïne gelabeld RNA</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Bestelling kan op maat worden gemaakt naar lengte en gewenste sequentie</td></tr><tr><td>EDTA tetranatriumzout hydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5391-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base Ultrapure</td><td>US Biological</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP168-500</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1609-47-8</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3483 12 3</td><td></td></tr><tr><td>Rundserumalbumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr></tbody></table>

horizontale gel electroforese voor verbeterde detectie van proteïne-rna complexen

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Inheemse polyacrylamide gelelektroforese is een fundamenteel instrument van moleculaire biologie die extensief is gebruikt voor de biochemische analyse van RNA-eiwitinteracties. Deze interacties zijn traditioneel geanalyseerd met polyacrylamidegels die worden gegenereerd tussen twee glazen platen en monsters die verticaal worden geforoteerd. Polyacrylamide gels die in bakken worden gegoten en elektroforeseer horizontaal bieden echter verschillende voordelen. Bijvoorbeeld, horizontale gels die gebruikt worden om complexen te analyseren tussen fluorescerende RNA-substraten en specifieke eiwitten kunnen meerdere malen worden weergegeven als elektroforese vordert. Dit biedt de unieke mogelijkheid om RNA-eiwitcomplexen op verschillende punten tijdens het experiment te volgen. Daarnaast maakt horizontale gelelektroforese het mogelijk om veel monsters parallel te analyseren. Dit kan de tijdcursusproeven aanzienlijk vergemakkelijken en meerdere reacties tegelijk analyseren om verschillende componenten en condities te vergelijken. Hier prOvide een gedetailleerd protocol voor het genereren en gebruiken van horizontale inheemse gelelektroforese voor het analyseren van RNA-eiwitinteracties.

Om de kracht en de veelzijdigheid van de horizontale inheemse gelelektroforese te demonstreren hebben we de binding van het Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) eiwit geanalyseerd aan een fluorescent gemerkt RNA dat een Bicc1 bindingsplaats bevat. Bicc1-eiwitten functioneren als mRNA-specifieke translatie-repressors om de beslissingen van het celfeest tijdens de moederstadia van dierlijke ontwikkeling 9 , 10 , <sup clas...

Inheemse polyacrylamide gelelektroforese is een fundamenteel hulpmiddel voor het analyseren van RNA-eiwitinteracties. Traditioneel hebben de meeste experimenten verticale gels gebruikt. Horizontale gels verschaffen echter verschillende voordelen, zoals de mogelijkheid om complexen te monitoren tijdens elektroforese. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor het genereren en gebruiken van horizontale inheemse gelelektroforese.

Horizontale Gel Electroforese voor Verbeterde Detectie van Proteïne-RNA Complexen

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Het doel van dit protocol is om RNA-eiwitinteracties te analyseren met behulp van horizontale native gelelektroforese. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de RNA-biochemie, zoals het definiëren van de kenmerken van specifieke RNA-eiwitinteracties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk is om de vorming van complexen meerdere keren tijdens de elektroforese te monitoren.Gebruik voor het horizontale gelapparaat een gelbak met een gietplateau van 27 centimeter bij 21 centimeter en capaciteit voor twee kammen van 24 putjes. Deze opstelling maakt het mogelijk om in totaal 48 monsters gelijktijdig te analyseren. Bereid twee liter 1x TBE-runbuffer door 400 milliliter 5x TBE te verdunnen met 1.600 milliliter water en te mengen.Plaats de TBE-buffer in de koelruimte om deze te koelen. Bereid de volgende reagentia volgens standaardprocedures: 40% acrylamide (bij voorkeur 19:1), 5x TBE, TEMED en 10% ammoniumper ألفsulfaat. Voeg voor het maken van een 10% native acrylamidegel het volgende toe aan een erlenmeyer van 500 milliliter: 80 milliliter 5x TBE, 100 milliliter 40% acrylamide en water tot een eindvolume van 400 milliliter.Voeg vier milliliter 10% ammoniumpersulfaat en 400 microliter TEMED toe en meng goed. Giet het mengsel in de horizontale giettray en laat de gel gedurende 30 minuten polymeriseren in de zuurkast. De gepolymeriseerde gel zal ongeveer twee centimeter dik zijn en er zal een dunne laag vloeistof bovenop de gel achterblijven.Plaats de gel in de gelbak en breng deze naar de koelruimte. Giet vervolgens de vloeistof af en spoel met running buffer. Verwijder voorzichtig de kammen, voeg twee liter koude running buffer toe aan de gelbak en gebruik daarna een spuit om de wells te spoelen met running buffer.Voer een pre-run van de gel uit bij 120 volt gedurende één uur bij vier graden celsius in een koelruimte. Terwijl de gel wordt voorbereid, worden de bindingsreacties klaargemaakt. Voeg de volgende componenten voor de bindingsreactie in deze volgorde toe aan elke RNA-vrije microcentrifugebuis: vijf microliters 10 millimolar BSA, vijf microliters 20 millimolar DTT, vijf microliters 10 millimolar gist tRNAs, 10 microliters 5x bindingsbuffer, bicaudal-c proteïne tot een eindconcentratie van 250 nanomolar in 50 microliters, DEPC-behandeld water tot een eindvolume van 45 microliters en vijf microliters fluorescent gelabeld RNA-substraat.Sluit de buisjes en tik ze zachtjes aan om te mengen, centrifugeer de buisjes kort en incubeer ze 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Wanneer de bindingsreacties voltooid zijn, voegt u 15 µL 50% glycerol toe aan elke reactie en mengt u dit voorzichtig. Laad voorzichtig 30 µL van elke reactie in de putjes van de gel; de hoeveelheid monster die in één putje kan worden geladen, varieert afhankelijk van de dikte van de gel en de grootte van de putjes.Sluit de stroomtoevoer van het gelapparaat aan, schakel de stroom in, stel de spanning in op 120 volt en laat de gel lopen bij vier graden celsius. Voer de elektroforese in het donker uit om beschadiging of bleken van het fluorescentielabelled RNA te voorkomen. De elektroforesetijden variëren afhankelijk van de specificaties van het geanalyseerde RNA-eiwitcomplex.Een belangrijk voordeel van de analyse met de horizontale elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassay is dat de elektroforese in het gelbeeld kan worden gestopt voordat de run is voltooid. Voer de analyse uit met elk instrument dat is ontworpen voor het detecteren van fluorescente substraten via beeldvorming. Pas de instellingen van de imager aan; gebruik voor fluorescentielabelled liganden de volgende instellingen.Fluoresceïne-golflengte van 473 nanometers, fotomultiplicatorspanning van 750 volts en pixelgrootte van 100 micrometers. Scan de gel om het beeld vast te leggen. Na het beelden kan de gel terug in het apparaat worden geplaatst en kan de elektroforese gedurende langere tijd worden voortgezet.De binding van het xenopus bicaudal-C- of Bicc1-eiwit aan een fluorescent gelabeld Cripto1-mRNA dat een Bicc1-bindingsplaats bevat, werd geanalyseerd met zowel verticale als horizontale native gelelektroforese. Als negatieve controle werd Bicc1 gemengd met een fluorescent gelabeld RNA afgeleid van CyclinB1-mRNA. Met beide methoden was duidelijk zichtbaar dat Bicc1 bindt aan het Cripto1-RNA en een specifiek complex vormt. De Bicc1-Cripto1-complexen waren echter aanzienlijk duidelijker bij analyse met de horizontale gel, wat de detectie vergemakkelijkte en het mogelijk maakte om eiwit-RNA-complexen te onderscheiden van ongebonden RNA.Na de beeldvorming werd de gel teruggeplaatst in het gelapparaat, werd de elektroforese gedurende nog eens drie en een half uur voortgezet en werd de gel opnieuw gefotografeerd. Zoals hier te zien is, waren de complexen verder gemigreerd en bleven ze gemakkelijk detecteerbaar, wat wijst op hun stabiliteit. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in vier tot vijf uur worden uitgevoerd, mits dit correct gebeurt.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe RNA-eiwitinteracties kunnen worden geanalyseerd met behulp van horizontale native gelelektroforese.

horizontal-gel-electrophoresis-for-enhanced-detection-protein-rna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Source: Stenum, T. S., et al. Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the use of gel electrophoresis and northern blotting to detect and compare the charging levels of transfer RNAs in E. coli by separating aminoacylated and deacylated forms.

Gel Electrophoresis and Northern Blotting to Detect tRNA Charging Levels in E. coli

This video demonstrates a denaturing polyacrylamide-based separation technique for proteins. This technique helps in the preliminary identification of proteins based on their molecular weights.

Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis for Protein Analysis: A Technique to Separate and Visualize Proteins Based on Molecular Weight

In this video, we demonstrate a two-dimensional gel electrophoresis method that separates individual proteins from a complex protein mixture obtained from tumor tissues of human nonfunctional pituitary adenoma (NFPA). The proteins are separated based on their electric charge in the first dimension and further separated based on molecular weights in the second dimension.

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

In this video, we demonstrate the electrophoretic mobility shift assay to detect protein-DNA interactions using infrared fluorescent-labeled DNA probes. When the protein binds to the DNA probe, it forms a large complex that migrates slowly on and appears as a shifted band on the gel.

Electrophoretic Mobility Shift Assay for Detection of Transcription Factor-DNA Complexes

Hier presenteren we een protocol om RNA / eiwit interacties te analyseren. De elektroforetische mobiliteit shift assay (EMSA) is gebaseerd op de differentiële migratie van RNA / eiwit-complexen en vrij RNA in natieve gelelektroforese. Door een radioactief gemerkte RNA-probe, kan RNA / eiwit-complexen worden gevisualiseerd door autoradiografie.

Elektroforetische mobiliteit Shift Assay (EMSA) voor de studie van RNA-eiwit interacties: Het IRE / IRP Voorbeeld

We beschrijven hier een geoptimaliseerd protocol van TL-elektroforetische mobiliteit shift assays (Femsa) met behulp van gezuiverd SOX-2 eiwitten in combinatie met infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte DNA-probes als een case study van een belangrijke biologische kwestie aan te pakken.

Een geoptimaliseerde protocol voor Electroforetische Mobility Shift Assay Met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof-gemerkte oligonucleotiden

We melden de protocollen voor de synthese en zuivering van Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomeren opnemen gewijzigd residuen. De biochemische en Biofysische methoden voor de karakterisatie van de erkenning van RNA duplexen door de gewijzigde PNAs worden beschreven.

Volgorde-specifieke en selectieve erkenning van Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs van chemisch gewijzigd Peptide nucleïnezuren

Een protocol voor het metabool profiel van biologische monsters door capillaire elektroforese-massaspectrometrie met behulp van een sheathless poreuze tip interface design wordt gepresenteerd.

Sheathless capillaire elektroforese-massaspectrometrie voor metabole of Biological Samples

Dit artikel beschrijft een eenvoudig en snel protocol om de oligomere toestand van het dynamin-achtige GTPase MxA-eiwit uit lysaten van menselijke cellen te evalueren met behulp van een combinatie van niet-denaturerende PAGE met western blot-analyse.

Karakterisering van Multi-subunit eiwitcomplexen of Human MxA het gebruik van niet-denaturerende Polyacrylamide Gel-elektroforese

Hier wordt aangetoond hoe de in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan worden gebruikt om de directe eiwit-eiwit interacties tussen ATM en p53 te detecteren en visualiseren in suspensiecellen die blootgesteld zijn aan genotoxische stress.

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

Leer horizontale native gel-elektroforese voor analyse van RNA-eiwitinteracties. Deze methode maakt real-time monitoring van complexvorming mogelijk tijdens elektroforese.

Horizontale Gel Electroforese voor Verbeterde Detectie van Proteïne-RNA Complexen

Meer video's verkennen