Fase gedrag van geladen blaasjes onder voorwaarden van symmetrische en asymmetrische oplossing bewaakt met fluorescentie microscopie

Het algemene doel van dit protocol is om kwantitatief de effecten van de hoge zoutgehaltes en transmembraan oplossingsasymmetrie die in fysiologische omstandigheden worden aangetroffen op de membraanfasetoestanden te beoordelen. Oplossingen binnen en buiten cellen zijn zeer verschillend. Onze methoden helpen om het effect van de oplossingsasymmetrie op de membraaneigenschappen en fasegedrag te begrijpen.

Het grote voordeel van onze aanpak is dat bellen kunnen worden bereid onder fysiologische bufferomstandigheden en dat het microfluïdische apparaat kan worden gebruikt om asymmetrische bufferomstandigheden te creëren. Om te beginnen, maakt u een zijde van een PTFE-plaat ruw met fijn schuurpapier. Was de plaat, een glasbuisje van 15 milliliter en een afsluitbare glazen container met commercieel vaatwasmiddel, ethanol en chloroform.

Gebruik een glazen spuit van 25 microliter om 10 tot 15 microliter lipidestok in chloroform op de ruwe zijde van de schone, droge PTFE-plaat te deponeren. Verspreid de lipidestok met de naald van de spuit om een uniforme lipidelaag te creëren. Gebruik een pincet om de plaat over te brengen naar het 15 milliliterbuisje.

Verwarm de plaat op 60 graden Celsius en droog gedurende twee uur om het oplosmiddel te laten verdampen. Voeg vervolgens gedeïoniseerd water toe aan een glazen container tot een hoogte van ongeveer een centimeter. Plaats het buisje met de plaat in de container, zorg ervoor dat het stabiel en rechtop blijft en sluit de container af.

Laat de lipide dubbellaag zes uur op 60 graden Celsius voorswellen. Verwijder vervolgens het buisje uit de container. Trek vijf milliliter zwelvloeistof aan in een plastic spuit en bevestig een 0,45 micrometerfilter aan het spuitsamenvlak.

Voeg de gefilterde zwelvloeistof toe aan het buisje om de lipidelaag te hydrateren. Sluit het buisje en verzegel het met een plastic paraffinefolie. Bewaar het buisje een nacht bij 60 graden Celsius om het GUV-aggregatie te verkrijgen.

Koel de bellen af tot kamertemperatuur binnen een uur na verwijdering van de warmte. Snijd het uiteinde van een plastic micropipettip van 200 microliter af, zodat het GUV-aggregatie in de tip kan worden getrokken. Gebruik de bijgesneden pipettetip om het aggregaat en 50 microliter zwelvloeistof over te brengen naar een schoon, droog twee milliliterbuisje.

Voeg aan het buisje 950 microliter verse zwelvloeistof of een isotone oplossing toe om respectievelijk symmetrische of asymmetrische oplosmiddelomstandigheden te verkrijgen. Pipetteer het mengsel op en neer en draai het buisje vervolgens enkele keren voorzichtig om de GUV's opnieuw te suspenderen. Om met de beoordeling te beginnen, plaats een aliquot van GUV-suspensie in een siliconen isolator op een microscoopglasplaat.

Versegel de kamer met een dekglas. Laat het monster vijf minuten herstellen. Plaats vervolgens de plaat op het monsterstandaard van een fluorescentiemicroscoop en verkrijg beelden van minimaal 30 GUV's per batch.

Inspecteer de beelden om de fasetoestanden van de afgebeelde GUV's te bepalen. GUV's in een enkele vloeibare fasetoestand zullen bolvormig en glad zijn met een fluorescerend label dat homogeen over de membraan is verdeeld. GUV's in een vloeibare geordende en gesorteerde twee-fasen toestand zullen bolvormig zijn met een fluorescerend label verdeeld in domeinen met gladde randen binnen de membraan.

Controleer of de domeinen vrij kunnen diffunderen op de oppervlakken van de bellen en dat ze kunnen samenvloeien. GUV's in een twee-fasen of drie-fasen vast-vloeibare fasetoestand zullen afgerond zijn met enkele hoekige randen. Vloeibare domeinen op een vaste achtergrond mogen geen diffusie vertonen, maar vaste domeinen mogen vrij diffunderen op een vloeibare achtergrond.

Zodra de fasetoestand van elke afgebeelde GUV is bepaald, bepaal de dominante fasetoestand voor de batch. Herhaal het proces met onafhankelijke monsters als de dominante fasetoestand een smalle meerderheid is. Voordat u het microfluïdische apparaat gebruikt, bereid ten minste vijf milliliter sucrose en zout zwelvloeistof voor.

Filter elke oplossing door een 0,45 micrometerfilter. Trim vervolgens de uiteinden van 200 microliter plastic pipetten en plaats een pipettenpunt in elk kanaal van het apparaat. Voeg aan het reservoir van het apparaat 100 microliter verse gefilterde zwelvloeistof van hetzelfde type toe dat werd gebruikt om de GUV's te bereiden.

Voeg vijf microliter van de zwelvloeistof toe aan elk pipettenpunt. Centrifugeer het apparaat gedurende 10 minuten bij 900 keer G om de kanalen van het apparaat te vullen. Vul vervolgens een glaspomp van een milliliter met dezelfde gefilterde zwelvloeistof.

Verbind een stuk slang met de pomp. Druk de zwelvloeistof door de slang totdat de plunjer volledig is ingedrukt en de slang gevuld is met oplossing. Verbind vervolgens de slang met het uitlaatkanaal en monteer de pomp op een pomp.

Verbind vervolgens de drukregeleenheid met de inlaten van de microfluïdische kanalen. Zorg ervoor dat de kleppen gesloten zijn en stel vervolgens de druk in op drie bars. Plaats het microfluïdische apparaat op het monsterstandaard van een omgekeerde confocale microscoop.

Gebruik een pipetten om de zwelvloeistof uit het reservoir van het apparaat te verwijderen tot er nog 25 tot 50 microliter oplossing overblijft. Voeg 150 microliter van de GUV-suspensie toe aan het reservoir en meng de suspensie door licht te pipetten. Laat de pomp in de terugtrekmodus draaien bij 10 microliter per minuut gedurende 20 minuten of tot meer dan 90% van de apparaatvallen bezet is.

Open vervolgens de kleppen van de drukregeleenheid om de ringkleppen in het microfluïdische apparaat te sluiten. Stop de pomp en laat het apparaat een uur staan voordat confocale beelden van de GUV's in het apparaat worden verkregen. Gebruik vervolgens een pipetten om de GUV-suspensie uit het reservoir te verwijderen om slechts 25 tot 50 microliter over te laten.</