Primordiale geslachtscellen transplantatie voor CRISPR/Cas9 gebaseerde sprongen in Xenopus
1 februari 2018
Genen essentieel voor overleving vormen technische hindernissen voor het maken van mutant lijnen. Sprongen omzeilt letaliteit door het combineren van genoom bewerken met primordiale geslachtscellen transplantatie wild-type dieren uitvoering germline mutaties maken. Sprongen maakt ook de efficiënte generatie homozygoot null mutanten in de F1 generatie. Hier, wordt de transplantatie stap aangetoond.
Het algemene doel van leapfrogging is het vergemakkelijken van de creatie van mutante lijnen voor genen die essentieel zijn voor de embryogenese. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de ontwikkelingsgenetica en andere vakgebieden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat men mutanten in essentiële genen kan verkrijgen in de F1-generatie.
Om deze procedure te starten, micro-injecteert u Cas9-sgRNA-complexen in Xenopus-embryo's in het eencellig stadium, zoals beschreven in het tekstprotocol. Wanneer de embryo's 4,5 uur na bevruchting bereiken, in het vroege blastula-stadium negen, haalt u ze uit de incubator van 25 °C zodat de ontwikkeling bij kamertemperatuur kan worden voortgezet. Om de transplantatie vijf uur na bevruchting te starten, gebruikt u een pasteurpijpet om één niet-geïnjecteerd embryo over te brengen naar een agarose-schaal van 60 millimeter met inkepingen, die zal dienen als de ontvanger van het transplantaat.
Transfer daarnaast één PGC-donorembryo naar de schaal. Gebruik een pincet om de vitelline membranen handmatig van elk embryo te verwijderen. Draai beide embryo's zodanig dat hun vegetatieve polen zichtbaar en toegankelijk zijn voor de chirurgische ingreep.
Stabiliseer vervolgens het ontvangende embryo met de haarlus en steek de scherpe punt van een wenkbrauwhaar-mesje in de vegetatieve pool, net onder het oppervlak. Maak vervolgens met snelle, opwaartse snijbewegingen vier ondiepe incisies in de vorm van een vierkant, binnen de zone waar de toekomstige flescellen zullen vormen die het blastopore markeren. Zodra de vier zijden van het vierkant zijn afgebakend, wordt het wenkbrauwhaar-mesje gebruikt om elke incisie met soortgelijke snijbewegingen te verdiepen tot een diepte van ongeveer 1/3 tot 1/2 van de afstand tot de bodem van het blastocoel.
Bevrijd het vegetatieve weefselexplantaat uit het ontvangende embryo door één of meerdere horizontale sneden te maken in de diepe vegetatieve regio. Herhaal deze procedure vervolgens snel bij het PGC-donorembryo om een vegetatief weefselfragment van gelijke grootte te creëren voor transplantatie. Zodra het weefsel dat de PGC's bevat is verwijderd uit het donorembryo, gebruikt u het wenkbrauwhaar-mesje en de haarlus om het explantaat te positioneren in de opening die in het ontvangende embryo is gemaakt.
Gebruik de schacht van het wenkbrauwhaarmes, parallel aan het oppervlak van het transplantaat gehouden, om het transplantaat voorzichtig in de opening in het vegetatieve oppervlak van het ontvangende embryo te drukken. Gebruik de haarlus om het karkas van het donorembryo voorzichtig over het agarose-oppervlak en in een putje te schuiven. Zorg ervoor dat de open wond van het karkas naar de bulkvloeistof is gericht.
Schuif het ontvangende embryo naar een aangrenzende well en zorg er op dezelfde manier voor dat het getransplanteerde vegetatieve poolweefsel naar de bulkvloeistof is gericht. Herhaal de transplantatie van PGC's met extra embryo's om meer transplantatieparen te creëren, totdat de embryo's ongeveer het vroege gastrula-stadium 10 bereiken, waarbij de embryo's naar lege wells worden overgebracht zodra de transplantaties zijn voltooid. Zodra de graften zijn genezen, doorgaans 30 tot 45 minuten na de transplantatie, gebruik dan een pasteurpipet om de embryo's zeer voorzichtig van de inkepingen over te brengen naar individuele wells in een agarose-gecoate 24-well plaat.
Draai de embryo's zodat ze gepositioneerd zijn met de vegetatieve pool naar boven, gericht naar de bulkoplossing. Plaats de donor-karkassen en de graft-recipiënten in aangrenzende putjes om het bijhouden van embryo-paren te vergemakkelijken en noteer deze informatie. Plaats vervolgens de 24-wells plaat met de embryo's een nacht in een incubator bij 25 °C.
Verplaats de volgende dag elke graft-ontvanger, die zich nu in het vroege staartknopstadium bevindt, naar een individuele put van een nieuwe, met agarose gecoate zes-putsplaat. Kweek de leapfrog-embryo's op en voer de analyse uit van het donor-DNA verkregen uit de karkassen volgens het tekstprotocol. Omdat leapfrogging dieren produceert waarbij de kiemlijn efficiënt wordt vervangen door mutante allelen, kunnen mutante fenotypen worden verkregen in de F1-generatie.
Zoals in deze tabel wordt weergegeven, rapporteerden Blitz et al. dat een meerderheid van de F0-dieren, gericht op de tyrosinase-locus, die vereist is voor melanocyt- en retinapigmentatie, 100% kiemlijnoverdracht van donor-afgeleide mutante genomen vertoont, gemeten door terugkruising met tyr-minus albino dieren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe Xenopus primordiale kiemcellen getransplanteerd moeten worden.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
De leapfrogging-techniek faciliteert de creatie van mutante lijnen voor essentiële genen in de embryogenese. Deze methode maakt de generatie van homozygote null-mutanten in de F1-generatie mogelijk, waardoor de uitdagingen die worden veroorzaakt door letale mutaties worden overwonnen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Ontwikkelingsgenetica
- Genetische modificatie
- Embryologie
Achtergrond
- Essentiële genen zijn cruciaal voor overleving en vormen een uitdaging bij het creëren van mutante lijnen.
- Traditionele methoden werken mogelijk niet voor genen die vereist zijn tijdens de vroege ontwikkeling.
- Leapfrogging combineert genoomredigering met kiemceltransplantatie.
- Deze techniek maakt het mogelijk om essentiële genen te bestuderen zonder letaliteit.
Doel van de studie
- Om de leapfrogging-techniek voor het genereren van mutante lijnen te demonstreren.
- Om een methode te bieden voor het bestuderen van essentiële genen in ontwikkelingsprocessen.
- Om de efficiënte creatie van homozygote null-mutanten te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Micro-injectie van Cas9-sgRNA-complexen in Xenopus-embryo's.
- Transplantatie van kiemcellen van geïnjecteerde embryo's naar recipiënte embryo's.
- Ontwikkelingsmonitoring van embryo's in verschillende stadia.
- Gebruik van agarose-schalen voor het enten van embryo's.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van wild-type dieren met kiembaanmutaties.
- Efficiënte productie van homozygote null-mutanten in de F1-generatie.
- Demonstratie van de transplantatiestap in het leapfrogging-proces.
- Validatie van de effectiviteit van de methode bij het overwinnen van letaliteit.
Conclusies
- Leapfrogging is een veelbelovende techniek voor het bestuderen van essentiële genen.
- Deze methode stelt onderzoekers in staat om de letaliteit van mutaties in essentiële genen te omzeilen.
- Verdere toepassingen van deze techniek kunnen het onderzoek naar ontwikkelingsgenetica verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Leapfrogging via transplantatie van primordiale kiemcellen versnelt de generatie van CRISPR/Cas9-geïnduceerde mutante lijnen in Xenopus, waarmee knelpunten in de functionele genomica voor essentiële genen direct worden aangepakt. Deze aanpak maakt snelle fenotypische analyse in de F1-generatie mogelijk, wat zorgt voor een eerdere validatie van targets en mechanische risicoreductie in pijplijnen voor ontwikkelingsbiologisch en genetisch onderzoek. De methode vergroot de flexibiliteit van het portfolio door een efficiënte studie mogelijk te maken van genen die voorheen ontoegankelijk waren vanwege embryonale letaliteit.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt functionele analyse van essentiële genen mogelijk door embryonale letaliteit te omzeilen.
- Ondersteunt mechanistische risicovermindering via directe fenotypische analyse van de F1-generatie.
- Faciliteert snelle hypothesetoetsing voor genfuncties in ontwikkelingspaden.
- Verbetert de voorspellende betrouwbaarheid voor targetselectie in vroege onderzoeksfasen.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert gevalideerde mutante kiemlijnen voor downstream fenotypische screening.
- Standaardiseert genetische achtergronden voor reproduceerbare assay-ontwikkeling.
- Maakt schaalbare productie van homozygote of samengestelde heterozygote mutanten mogelijk.
- Ondersteunt een robuuste evaluatie van genfuncties in gecontroleerde systemen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij studies naar ziekterelateerde genfuncties in gewervde modellen.
- Maakt continuïteit mogelijk van genetische ontdekking naar preklinische fenotypevalidatie.
- Vermindert het risico in translationeel onderzoek door de essentialiteit van genen in een vroeg stadium te verduidelijken.
- Ondersteunt de analyse van maternale effectgenen, waardoor het translationele inzicht wordt uitgebreid.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert de overgang tussen vroege ontdekking en lead-identificatie, waardoor directe progressie van CRISPR/Cas9-mutagenese naar fenotypische validatie in een enkele generatie mogelijk is.
- Discovery Biology: Versnelt het toetsen van de nulhypothese en de verduidelijking van signaalpaden voor essentiële genen.
- Screening: Levert reproduceerbare, genetisch gedefinieerde embryo's voor downstream-assays.
- Analytics: Biedt kwantitatieve kiembaanoverdracht en fenotypische readouts voor vergelijkende analyse.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinische validatie voor genen met ontwikkelings- of maternale effecten.
- Bedrijfsvoering en Hergebruik: Vestigt een herbruikbare workflow voor de snelle generatie van mutantlijnen over verschillende gentargets.
Operationele en ondernemingsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert ambiguïteit in studies naar genfunctie.
- Operationele waarde: Stroomlijnt de generatie van mutanten, standaardiseert workflows en verbetert de reproduceerbaarheid.
- Strategische waarde: Maakt snellere go/no-go-beslissingen mogelijk en vermindert biologische risico's in een laat stadium.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritisering door vroege functionele validatie van essentiële genen mogelijk te maken.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in micro-injectie, embryologische manipulatie en CRISPR/Cas9-editing.
- Specialistische instrumentatie voor de behandeling en transplantatie van embryo's is noodzakelijk.
- Strikte standaardisatie tussen teams is vereist voor reproduceerbaarheid en data-integriteit.
- Aanpassing aan andere modelsystemen kan protocoloptimalisatie vereisen.
- De efficiëntie is afhankelijk van een precieze timing en behandeling tijdens de transplantatiestappen.
