Name: Stikstof cavitatie en differentiële centrifugeren zorgt voor de verdeling van perifere membraaneiwitten in gekweekte cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Leer stikstofcavitatie en differentiële centrifugatie voor het scheiden van perifere membraaneiwitten in gekweekte zoogdiercellen. Deze detergentvrije methode verbetert de nauwkeurigheid van eiwitanalyse aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door GM055279, CA116034 en CA163489.

1. buffer en apparatuur preparaten <ol><li>Chill 45 mL cel verstoring bommen, 15 mL buizen en ultracentrifugatie buizen bij 4 ° C.</li>
	<li>Voorbereiden en chill homogenisering buffer per 2 x 10 7 cellen bij 4 ° C. toevoegen een protease inhibitor tablet vlak voor gebruik 25 mL. 
	Opmerking: Homogenisering buffers bevatten doorgaans KCl in plaats van NaCl beter weerspiegelen intracellulaire zout samenstelling. Homogenisering buffer die wordt gebruikt in dit protocol bestaat uit 10 mM HEPES met een pH van 7,4, 10 mM KCl en 1,5 mM MgCl 2 (hierna te noemen hypotone homogenisering buffer). Meeste buffers kunnen worden aangepast voor stikstof cavitatie (Zie discussie).</li>
	<li>Voorbereiden en chill 6 mL 1 x Phosphate-Buffered zoutoplossing (PBS) buffer per monster bij 4 ° C. toevoegen protease inhibitor tabletten vóór gebruik vers. 
	Opmerking: PBS buffer die wordt gebruikt in dit protocol bestaat uit 10 mM nb 2 HPO 4 met een pH van 7,4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl en 2,7 mM KCl.</li>
	<li>Voorbereiden en chill solubilisatie buffer per monster bij 4 ° C. toevoegen een protease inhibitor tablet vlak voor gebruik 4 mL. 
	Opmerking: Solubilisatie buffer die wordt gebruikt in dit protocol is 1 x Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer, die uit 25 mM Tris op pH 7.4, 150 mM NaCl, SDS 0,1% en 0,5% natrium deoxycholate 1 bestaat % NP-40. 4.6 zienoot.</li>
</ol> 2. Opruiming Cell <ol><li>Grow 2 x 10 7 -10 x 10 9 weefselkweek cellen met de aanbevolen voedingsbodems voor het celtype. Typisch, een 15-cm schotel levert 2 x 10 7 HEK-293 cellen gekweekt in DMEM op 90% confluentie ( Figuur 1).</li>
	<li>Verwijderen van het groeimedium door vacuüm.</li>
	<li>Voor Adherente cellen, plaatst u de cultuur gerechten op ijs, wassen van de cellen rechtstreeks in de cultuur-gerechten zachtjes met gekoeld homogenisering buffer tweemaal (10 mL buffer per 15 cm schotel per wasbeurt) en de cellen met een grote cel schraper in een passende omvang van de oogst homogenisering buffer; Voor schorsing cellen, verzamelen de cel pellet in gekoeld homogenisering buffer tweemaal (10 mL buffer per 50 mL cultuur per wasbeurt) met 500 x g spin bij 4 ° C gedurende 5 minuten wassen en resuspendeer de pellet gewassen cel in een passende omvang van homogenisering buffer op ijs. Opmerking: het volume moet worden gebaseerd op de vereisten voor eiwitconcentratie in de voorgenomen experimenten, evenals het volume van de minimale/maximale toegestaan in de cel verstoring bom. Een algemene richtsnoer is 2-10 x 10 7 cellen/mL, of ongeveer 10 volumes van de cel pellet. Dit protocol is geoptimaliseerd voor drie 15-cm schotels van HEK-293 cellen in 2 mL zuiver homogenisering buffer.</li>
</ol> 3. Stikstof cavitatie <ol><li>de celsuspensie overdracht aan een schone en gekoelde bom in een ijsbad op een roer plaat. 
	Let op: De bom heeft hoge druk, lage temperatuur, stikstofgas &#8211; dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen .</li>
	<li>Een micro magnetische roer staaf van de plaats binnen de bom en zet op het roer plaat om schorsing homogeniteit.</li>
	<li>Voegen een protease inhibitor tablet tot de schorsing en de bom per fabrikant te sluiten &#39; s instructie.</li>
	<li>Geleidelijk druk uitoefenen op de bom met een gastank stikstof per fabrikant &#39; s instructie tot de drukmeter bom leest 300 tot 600 psi. Sluit alle afsluiters en verbreken van de stikstof tank. 
	Opmerking: De vereiste druk kan variëren met het celtype. Hier hebben we uitgevoerd cavitatie bij 350 tot 400 psi voor HEK-293, NIH-3T3 en Jurkat cellen.</li>
	<li>Wachten op 20 min om de stikstof te ontbinden en te bereiken evenwicht binnen de cellen.</li>
	<li>Verwijder overtollig water rond de spoelafsluiter met behulp van een doek handdoek. Open de spoelafsluiter zachtjes voor het bereiken van een dropwise versie van homogenaat en verzamelen in een tube pre gekoeld 15 mL. 
	Opmerking: In de buurt van het einde van de collectie zal er een spurt van homogenaat en gas zal ontstaan met een sissende geluid. Zorg ervoor dat het gas niet oorzaak eerder verzameld cavitate om te schieten uit de buis (vandaar het gebruik van 15 mL tubes in plaats van 1,5 mL buizen). Zodra de spurt begint, sluiten de spoelafsluiter en de stikstof ingangsafsluiter abrupt te depressurize de bom bereiken cavitatie van de resterende cellen in de bom te openen. Open de bom voor cavitate herstel en grondige reiniging. 
	Opmerking: De laatste cavitate moet een melkachtige uitstraling met schuim bovenop. Zachtjes roeren met een uiteinde van de pipet om het schuim te laten verdwijnen voordat centrifugeren. 
	Opmerking: Bestuderen de cavitate met fase contrast microscopie bepalen de homogenisering efficiëntie. Voeg een druppel 15 µL cavitate op het oppervlak van een microscopie dia en dek met een dekglaasje aan. Herhaal stap 3.4-3.6 alleen als teveel ongebroken cellen worden gedetecteerd met een 20 X doelstelling. 
	Opmerking: Als de homogenisering buffer bevat geen EDTA of EGTA, toevoegen aan de verzamelde cavitate op een eindconcentratie van 1 mM binnen 5 min na lozing.</li>
</ol> 4. Scheiding van Cytosolic en membraan breuken <ol><li>Centrifuge de cavitate bij 500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot verwijderen ongebroken cellen en kernen. 
	Let op: Herhaal de centrifugeren stap totdat geen zichtbare pellet wordt geproduceerd en de Post nucleaire Supernatant (PNS) verzamelen terwijl het vermijden van het schuim drijvend op bovenkant. Opnieuw Centrifugeer het schuim om verder te verzamelen en combineren van PNS, indien nodig ( Figuur 1).</li>
	<li>Verwerken de PNS desgewenst te verkrijgen van breuken van belang. Met het oog op scheiden cytosolische en membraan breuken, de PNS overbrengen in een buis ultracentrifuge en ultracentrifugatie desgewenst uit te voeren. Dit protocol is geoptimaliseerd voor een &#60; 3,5 mL monster in de buis van een polycarbonaat ultracentrifuge en voor ultracentrifugatie bij 350.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C.</li>
	<li>Verzamelen het supernatant (de S-Fractie) met behulp van een precisiepipet 1 mL.</li>
	<li>Spoel zorgvuldig de pellet met 3 mL koude PBS zonder verstoring van het. Verwijderen van de PBS door vacuüm. 
	Opmerking: Als de besmetting van de membraan breuk door cytosolische eiwitten is een groter probleem dan het verlies van monster, resuspendeer de pellet in 3 mL koud PBS en re-ultracentrifuge zoals in stap 4.2. Verwijderen van de PBS door vacuüm.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet volledig in een juiste hoeveelheid wasmiddel-bevattende solubilisatie buffer van keuze. Om te bereiken cel gelijkwaardigheid, gebruiken dezelfde hoeveelheid buffer solubilisatie als de cytosolische breuk. 
	Opmerking: We raden aan 1 x RIPA buffer gebruiken als solubilisatie buffer voor efficiënte membraan eiwit extractie. Als geen downstream assay vereist voor membraan fractie is, gebruikt u 1 x laemmli monster buffer voor maximale membraan eiwit extractie. 
	Opmerking: We raden loskomen en de pellet in solubilisatie buffer overbrengen naar een schone buis op een buis rotator bij 4 ° C voor maximale membraan eiwit extractie. 
	Opmerking: Als de pellet te plakkerig (teveel lipiden) efficiënt worden verwijderd uit de the ultracentrifuge buis in solubilisatie buffer, wij stellen module voor bevriezing van de pellet in vloeibare stikstof en snel het loskomen van de pellet uit de ultracentrifuge buis met een mini metalen spatel, voordat de pellet ontdooit. 
	Opmerking: U kunt ook membraan pellets kunnen worden gewoon geresuspendeerde en niet ontbindend in een niet-wasmiddel-bevattende buffer te produceren een fractie P van membraan vesikel opschorting, in dat geval het centrifugeren stap in 4.6 niet vereist is. Dergelijke breuken P zijn nuttig bij het onderzoeken van functies zoals enzym-activiteiten die afhankelijk van de vereniging van de membraan zijn.</li>
	<li>De schorsing van de volledig ontbindend pellet uit stap 4.5 bij 20.000 x g in een tafelblad centrifuge voor 10 min Centrifugeer bij 4 ° C. de bovendrijvende vloeistof met behulp van een precisiepipet 1 mL (de P-Fractie) verzamelen en negeren de pellet (onoplosbare lipiden).</li>
	<li>Uitvoeren van gewenste assays zoals het westelijke bevlekken met de cytosolische en/of membraan breuken, of ze bij-80 ° C voor toekomstig gebruik opslaan.</li>
</ol>

<ol><li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins+on+the+move%3A+insights+gained+from+fluorescent+protein+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).</li>
<li>Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+commercial+extraction+kits+for+subsequent+membrane+protein+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling.</a> Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).</li>
<li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+cultured+cells+by+nitrogen+cavitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation.</a> Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).</li>
<li>Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+plasma+membranes.+I.+High-yield+purification+of+human+neutrophil+plasma+membrane+vesicles+by+nitrogen+cavitation+and+differential+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation.</a> J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).</li>
<li>Philips, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+molecular+weight+GTP-binding+proteins+in+human+neutrophil+granule+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).</li>
<li>Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phospholipides+of+Ehrlich+ascites+carcinoma+cells%3A+composition+and+intracellular+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution.</a> Cancer Res. 20, 397-402 (1960).</li>
<li>Hunter, M. J., Commerford, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure+homogenization+of+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Pressure homogenization of mammalian tissues.</a> Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).</li>
<li>Wallach, D. F., Kamat, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+and+Cytoplasmic+Membrane+Fragments+from+Ehrlich+Ascites+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).</li>
<li>Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).</li>
<li>Brock, T. G., Paine, R. 3rd, Peters-Golden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+5-lipoxygenase+to+the+nucleus+of+unstimulated+rat+basophilic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells.</a> J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).</li>
<li>Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+liver+and+muscle+polyribosomes+in+high+yield+after+cell+disruption+by+nitrogen+cavitation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation.</a> FEBS Letters. 2 (1), (1968).</li>
<li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+prenylcysteine+carboxyl+methyltransferase+is+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum.</a> J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).</li>
<li>Wynne, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1-interacting+adapter+molecule+%28RIAM%29+associates+with+the+plasma+membrane+via+a+proximity+detector%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector.</a> J Cell Biol. , (2012).</li>
<li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VPS35+binds+farnesylated+N-Ras+in+the+cytosol+to+regulate+N-Ras+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking.</a> J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).</li>
<li>Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+possess+and+require+an+active+protein+palmitoylation+pathway+for+agonist-mediated+activation+and+in+vivo+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).</li>
<li>Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperoxidized+peroxiredoxin+2+interacts+with+the+protein+disulfide-+isomerase+ERp46%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46.</a> Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).</li>
<li>Annis, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+localized+Bcl-2+prevents+apoptosis+when+redistribution+of+cytochrome+c+is+a+late+event%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event.</a> Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).</li>
<li>Berkowitz, S. A., Wolff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+calcium+sensitivity+of+tubulin+polymerization.+The+contributions+of+temperature%2C+tubulin+concentration%2C+and+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins.</a> J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

De voordelen van stikstof cavitatie boven andere methoden van mechanische storingen zijn spruitstuk. Misschien is het belangrijkste voordeel is de mogelijkheid om voorzichtig nog efficiënt Meng exemplaren. De fysische principes van decompressie cools monsters in plaats van de veldgenerator lokale verwarming schade zoals ultrasone en wrijving/scheren technieken gebaseerd. Cavitatie is ook zeer efficiënt op het verstoren van het plasma-membraan. Omdat stikstof bubbels worden gegenereerd binnen elke afzonderlijke cel op dec...

Cellulaire eiwitten kunnen worden onderverdeeld in twee klassen: die membranen en die niet zijn gekoppeld. Non-membraan geassocieerde eiwitten worden aangetroffen in het cytosol, nucleoplasm en lumina van organellen zoals het endoplasmatisch reticulum (ER). Er zijn twee klassen van membraan-geassocieerde eiwitten, integraal en perifere. Integraal membraaneiwitten zijn ook bekend als transmembraan eiwitten, omdat een of meer segmenten van de polypeptide keten omvat het membraan, meestal als een α-helix samengesteld uit hydrofobe aminozuren. Transmembraan eiwitten zijn co-translationally ingevoegd membranen in de loop van hun biosynthese en zo geconfigureerd blijven totdat zij zijn catabolized. Perifere membraaneiwitten zijn subsidiair naar membranen, meestal als gevolg van posttranslationele wijziging met hydrofobe moleculen zoals lipiden gereden. In tegenstelling tot integraal membraaneiwitten, de vereniging van perifere membraaneiwitten met cellulaire membranen is omkeerbaar en kan worden geregeld. Vele perifere membraan eiwitten functie in signaalroutes en gereglementeerde vereniging met een membraan is een mechanisme voor activeren of remming van een traject. Een voorbeeld van een signalering molecuul thats een perifere membraan eiwit is de kleine GTPase, RAS. Na een reeks van posttranslationele modificaties die wijziging met een lipide farnesyl, de gewijzigde C-terminus van een volwassen RAS-eiwit wordt ingevoegd in de cytoplasmatische bijsluiter van het cellulaire membraan. Het plasma-membraan is met name waar het RAS zijn downstream effector RAF1 bezighoudt. Om te voorkomen dat een constitutief activering van mitogeen-geactiveerd proteïne kinase (MAPK) traject, zijn meerdere niveaus van controle van RAS. Naast rendering RAS inactief door hydrolyseerd GTP in BBP, kan actieve RAS ook worden gelost van het plasma-membraan door wijzigingen of interacties met solubilizing factoren om te remmen signalering. Hoewel fluorescerende levende imaging cel biologen de gelegenheid biedt te observeren de subcellular localisatie van fluorescente proteïne-gelabeld perifere membraan eiwitten1, blijft er een kritische noodzaak om te evalueren van de membraan vereniging van endogene eiwitten semi-kwantitatief met eenvoudige biochemische benaderingen.
De juiste biochemische evaluatie van eiwit verdeling tussen membraan en oplosbare breuken is kritisch afhankelijk van twee factoren: cellulaire homogenisering en efficiënte scheiding van membraan en oplosbare breuken. Hoewel sommige protocollen, met inbegrip van de meest gebruikte gecommercialiseerd kits, is afhankelijk van wasmiddel gebaseerde cel homogenisering, kunnen deze methoden analyse verduisteren door winning van membraaneiwitten in oplosbare fase2. Dienovereenkomstig, niet-wasmiddel op basis, mechanische methoden van verstoring van de cel schonere resultaten opleveren. Er zijn verschillende methoden van mechanische verstoring van cellen gekweekt in cultuur of geoogst van bloed of organen. Het gaat hierbij om Dounce homogenisering, verstoring van de fijne naald, kogellager homogenisering, ultrasoonapparaat en stikstof cavitatie. Hier wij stikstof cavitatie te evalueren en te vergelijken met andere methoden. Stikstof cavitatie is afhankelijk van stikstof, dat wordt ontbonden in het cytoplasma van de cellen onder hoge druk. Na evenwichtsinstelling, wordt de celsuspensie abrupt blootgesteld aan atmosferische druk zodanig dat stikstof belletjes worden gevormd in het cytoplasma die traan open de cel als gevolg van hun bruisen. Als de druk voldoende hoog is, stikstof bruisen de kern3 kan verstoren en membraan gebonden organellen zoals lysosomen4. Echter, als de druk laag genoeg wordt gehouden, zal de decompressie verstoren het plasmamembraan en ER maar niet andere organellen, waardoor het morsen van zowel cytosol en intact cytoplasmatische organellen in het homogenaat die de cavitate5is aangewezen. Om deze reden is stikstof cavitatie de methode van keuze voor het isoleren van organellen zoals lysosomen- en mitochondriën.
Het is echter ook een uitstekende manier voor te bereiden op een homogenaat die gemakkelijk kan worden gescheiden in membraan en oplosbare breuken. Het drukvat (voortaan "de bom" genoemd) gebruikt tijdens cavitatie bestaat uit een dikke roestvast stalen behuizing die hoge druk, met een inham voor levering van de stikstofgas uit een tank en een retourzijde met een verstelbare spoelafsluiter doorstaat.
Stikstof cavitatie is gebruikt voor de cel homogenisering sinds de jaren 1960-6. In 1961 vestigde Hunter en Commerfold7 stikstof Cavitatie als een haalbare optie voor verstoring van de zoogdieren weefsel. Sindsdien onderzoekers hebben de techniek om de verschillende cellen en weefsels met succes, en aangepast stikstof cavitatie is uitgegroeid tot een nietje in meerdere toepassingen, waaronder membraan voorbereiding8,9, kernen en organel voorbereiding10,11, en onstabiele biochemische extractie. Op dit moment cel biologen vaker andere methoden gebruiken van cel homogenisering omdat de voordelen van stikstof homogenisering hebben niet veel geadverteerd, stikstof bommen duur zijn en er is een misvatting dat een relatief groot aantal cellen Vereist. Protocollen voor stikstof cavitatie tot cel-vrije homogenates met intact kernen niet zijn gepubliceerd, en in de meest gepubliceerde evaluaties volumes van 20 mL celsuspensie werden gebruikt. Aan te passen deze klassieke techniek te passen aan de huidige eisen van het werken met kleinschalige monsters, presenteren we een gewijzigde protocol van stikstof cavitatie speciaal ontworpen voor gekweekte cellen. Na stikstof cavitatie, het homogenaat wordt gescheiden in oplosbare (S) en membraan (P) breuken door differentiële centrifugeren, eerst met een lage snelheid spin kernen en ongebroken cellen te verwijderen, en vervolgens met een snelle spin (&#62; 100.000 x g) om te scheiden membranen van de oplosbare fractie. Wij de efficiëntie van de scheiding met immunoblots analyseren en vergelijken van stikstof cavitatie met andere verstoring van de mechanische technieken. We onderzoeken ook de osmotische werking van homogenisering buffer tijdens stikstof cavitatie.

<table><tbody><tr><td>Cell Disruption Vessel (45 mL)</td><td>Parr Instrument</td><td>4639</td><td>Nitrogen cavitation Bomb</td></tr><tr><td>Dounce homogeniser (2 mL)</td><td>Kontes</td><td>885300-0002</td><td>Dounce stamper en buis</td></tr><tr><td>U-100 Insulin Syringe 28G&frac12;</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td>Naald</td></tr><tr><td>Atg12 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>271688</td><td>Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>&beta;-actin antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>47778</td><td>Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>&beta;-tubulin antibody</td><td>DSHB</td><td>E7-s</td><td>Muis antilichaam, gebruik bij 1:5000 verdunning</td></tr><tr><td>Calnexin antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>23954</td><td>Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>Calregulin antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>373863</td><td>Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>Catalase antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>271803</td><td>Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>CIMPR antibody</td><td>Abcam</td><td>124767</td><td>Konijn antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>EEA1 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>137130</td><td>Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>EGFR antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>373746</td><td>Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>F0-ATPase antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>514419</td><td>Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>F1-ATPase antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>55597</td><td>Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>Fibrillarin antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>374022</td><td>Muis antilichaam, gebruik bij 1:200 verdunning</td></tr><tr><td>Golgin 97 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>59820</td><td>Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>HDAC1 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>81598</td><td>Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>Hexokinase 1 antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2024S</td><td>Konijn antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>Lamin A/C antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>376248</td><td>Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>LAMP1 antibody</td><td>DSHB</td><td>H4A3-c</td><td>Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>Na+/K+ ATPase antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>48345</td><td>Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>Rab7 antibody</td><td>Abcam</td><td>137029</td><td>Konijn antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>Rab9 antibody</td><td>Thermo</td><td>MA3-067</td><td>Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>RCAS1 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>398052</td><td>Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>RhoGDI antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>360</td><td>Konijn antilichaam, gebruik bij 1:3000 verdunning</td></tr><tr><td>Ribosomal protein S6 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>74459</td><td>Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>Sec61a antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>12322</td><td>Geiten antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td>Steekproefbuis voor ultracentrifugering</td></tr><tr><td>TLK-100.3 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>349481</td><td>rotor voor ultracentrifugering</td></tr><tr><td>Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>364300</td><td>ultracentrifuge</td></tr><tr><td>cOmplete protease inhibitor cocktail tablets</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td>proteaseremmers</td></tr><tr><td>Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade</td><td>Corning</td><td>353089</td><td>grote celschraper</td></tr><tr><td>Magnetic Stir Bar</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-57SIX</td><td>micro roerstaaf</td></tr><tr><td>Ceramic-Top Magnetic Stirrer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S504501AS</td><td>magnetische roerder</td></tr></tbody></table>

stikstof cavitatie en differentiële centrifugeren zorgt voor de verdeling van perifere membraaneiwitten in gekweekte cellen

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Gekweekte cellen zijn nuttig voor het bestuderen van de subcellular verdeling van eiwitten, met inbegrip van perifere membraaneiwitten. Genetisch gecodeerd fluorescently tagged eiwitten hebben een revolutie teweeggebracht in de studie van eiwit subcellular distributie. Het is echter moeilijk te kwantificeren van de verdeling met fluorescent microscopie, vooral wanneer de eiwitten zijn deels cytosolische. Bovendien is het vaak belangrijk om te studeren van endogene eiwitten. Biochemisch onderzoek zoals immunoblots blijven de gouden standaard voor de kwantificering van eiwit verdeling na subcellular fractionering. Hoewel er commerciële kits die gericht zijn zijn op het isoleren van cytosolische of bepaalde fracties membraan, zijn de meeste van deze kits gebaseerd op extractie met detergentia die mogelijk niet geschikt voor de studie van perifere membraaneiwitten die gemakkelijk membranen worden uitgepakt. Hier presenteren we een wasmiddel-gratis protocol voor cellulaire homogenisering door stikstof cavitatie en latere scheiding van cytosolische en membraan-gebonden eiwitten door ultracentrifugatie. Wij bevestigen de scheiding van subcellular organellen in oplosbare en pellet fracties over de verschillende soorten cellen, en vergelijk eiwit extractie onder verschillende gemeenschappelijke mechanische homogenisering wasmiddel gebaseerde methoden. Onder de verschillende voordelen van stikstof is cavitatie de superieure efficiëntie van verstoring van de cellulaire met minimale fysische en chemische schade aan gevoelige organellen. Gecombineerd met ultracentrifugatie, stikstof cavitatie is een uitstekende methode om te onderzoeken van de verschuiving van perifere membraaneiwitten tussen cytosolische en membraan breuken.

Figuur 2 toont de partitionering van cellulaire eiwitten uit PNS in de oplosbare cytosolische fractie (S) of het membraan pellet breuk (P). Wij onderzochten drie representatieve cellijnen van verschillende celtypes: HEK-293 (epitheliale), NIH-3T3 (fibroblast) en Jurkat (lymfocyten). Rho Guanine dissociatie remmer (RhoGDI) en catie-onafhankelijke mannose-6-fosfaat receptor (CIMPR) werden gebruikt als positieve controles voor cytosolische en membraan breuken, r...

Hier presenteren we protocollen voor wasmiddel-vrije homogenisering van gekweekte zoogdiercellen gebaseerd op stikstof cavitatie en latere scheiding van cytosolische en membraan-gebonden eiwitten door ultracentrifugatie. Deze methode is ideaal voor het toezicht op de partitionering van perifere membraaneiwitten tussen oplosbare en membraan breuken.

Stikstof cavitatie en differentiële centrifugeren zorgt voor de verdeling van perifere membraaneiwitten in gekweekte cellen

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Het algemene doel van deze experimentele procedure is om gecultiveerde cellen optimaal te homogeniseren en de partitionering van cellulaire eiwitten tussen membraan- en oplosbare fracties te analyseren. Deze methode kan helpen bij het aanpakken van een van de belangrijkste uitdagingen in de celbiologie, namelijk de subcellulaire compartimentalisatie van perifere membraaneiwitten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de partitionering van endogene eiwitten binnen een vaste fractie en membraanfracties reproduceerbaar kan detecteren, met grote nauwkeurigheid en zonder gebruik van detergentia.Begin met het kweken van HGK293-cellen tot een confluentie van 90%, zodat de opbrengst per schaal van 15 centimeter ongeveer 2 x 10⁷ cellen is wanneer deze worden gekweekt in DMEM bij 37 °C, met 5% CO₂. Aspireer vervolgens het groeimedium met een vacuümpomp. Plaats daarna de kweekschaalen op ijs en was de cellen op de kweekschaalen voorzichtig twee keer met 10 ml gekoelde homogenisatiebuffer per schaal.Na het wassen gebruikt u een grote celscraper om de cellen te oogsten met een geschikt volume homogenisatiebuffer. Draag de celsuspensie vervolgens over naar een schone, vooraf ge

nitrogen-cavitation-differential-centrifugation-allows-for-monitoring

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video demonstrates the differential radial capillary action of ligand assay — a technique for systematic high-throughput screening of intracellular nucleotide second messenger-binding proteins. This technique allows for direct binding of the messengers to the overexpressed target protein in the cell lysate — bypassing the need for protein purification.

Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay: A High-Throughput Technique to Identify Bacterial Nucleotide Second Messenger-Binding Intracellular Proteins

Hier beschrijven we een robuuste werkwijze voor de fractionering van plantaardige plasmamembranen in reinigingsmiddelenbestendige en detergent oplosbare membranen gebaseerd op een mengsel van gelabelde en in vivo volledig 15N gemerkt Arabidopsis thaliana celculturen. De procedure wordt toegepast voor vergelijkende proteomics studies om signalering processen te begrijpen.

Metabole Labeling en Membrane Fractionation for Comparative Proteomic analyse van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Schorsing Celkweken

Hier wordt een nieuwe kwantitatieve fluorescentietest ontwikkeld om veranderingen in het niveau van een specifiek eiwit op centrosomen te meten door de fluorescentie-intensiteit van dat eiwit te normaliseren naar die van een geschikte interne standaard.

Kwantitatieve immunofluorescentiebepaling op het Variatie in eiwitgehalten op centrosomes Maatregel

Hier presenteren we een protocol om te isoleren van het plasmamembraan, cytoplasma en mitochondria van U937 cellen zonder het gebruik van high-speed centrifugeren. Deze techniek kan worden gebruikt voor het zuiveren van subcellular breuken voor latere onderzoek van eiwit lokalisatie via immunoblotting.

Cel fractionering van U937 cellen in het ontbreken van snelle centrifugeren

Dit artikel presenteert methoden voor het genereren, zuiveren en kwantificeren van Caenorhabditis elegans extracellulaire blaasjes.

Zuivering en analyse van Caenorhabditis elegans Extracellular Blaasjes

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de bepaling van oligomere toestand van membraaneiwitten dat gebruik maakt van een inheems celmembraan nanodeeltjessysteem in combinatie met elektronenmicroscopie.

Native Cell Membrane Nanodeeltjes Systeem voor Membraan Eiwit-Eiwit Interactie Analyse

Dit fractioneringsprotocol stelt onderzoekers in staat om cytoplasmatische, nucleaire, mitochondriale en membraaneiwitten uit zoogdiercellen te isoleren. De laatste twee subcellulaire fracties worden verder gezuiverd via isopycnic dichtheidsgradiënt.

Celfractionering van U937-cellen door isopycnic density gradient purification

Dit protocol beschrijft de opstelling van een NMR-bioreactor om ingekapselde menselijke cellen tot 72 uur levensvatbaar te houden, gevolgd door tijd-opgeloste in-cell NMR-gegevensverzameling en -analyse. De methodologie wordt toegepast om intracellulaire eiwit-ligand interacties in real time te monitoren.

Monitoring van eiwit-ligandinteracties in menselijke cellen door real-time kwantitatieve in-cell NMR met behulp van een bioreactor met hoge celdichtheid

Dit artikel beschrijft de protocollen voor monstervoorbereiding, gegevensreductie en gegevensanalyse in neutronenspinecho (NSE) studies van lipidemembranen. Verstandige deuteriumetikettering van lipiden maakt toegang tot verschillende membraandynamiek op mesoscopische lengte- en tijdschalen mogelijk, waarover vitale biologische processen plaatsvinden.

Neutron Spin Echo Spectroscopie als een unieke sonde voor lipidemembraandynamiek en membraan-eiwitinteracties

Dit artikel beschrijft een methode voor het beoordelen van de interacties en assemblages van integrale membraaneiwitten in vitro met verschillende partnerfactoren in een lipid-proximaal milieu.

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren In Vitro

Leer stikstofcavitatie en differentiële centrifugatie voor het scheiden van perifere membraaneiwitten in gekweekte zoogdiercellen. Deze detergentvrije methode verbetert de nauwkeurigheid van eiwitanalyse aanzienlijk.

Stikstof cavitatie en differentiële centrifugeren zorgt voor de verdeling van perifere membraaneiwitten in gekweekte cellen

Meer video's verkennen