Name: Met behulp van In Vivo en weefsel en cel Explant benaderingen te bestuderen van de voedselproductie en de pathogenese van de embryonale en perinatale Aorta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Leer in vivo clonale analyse en fate mapping om de morfogenese van de embryonale en perinatale aorta te bestuderen. Deze methoden onthullen de oorsprong van gladde spiercellen en helpen bij het begrijpen van vasculaire ontwikkeling en ziekte.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We dank Dean Li voor het delen van zijn laboratorium protocol voor aorta SMC isolatie. Financiering van de steun werd geboden door de National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 en R01HL133016 naar D.M.G), de American Heart Association (Grant-in-Aid 14GRNT19990019 naar D.M.G.), en Yale University (Brown-Coxe Fellowship aan A.M. en opstarten fondsen aan D.M.G.).

alle protocollen van de muis zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité aan de Yale University.
 1. In Vivo embryonale lot Mapping en klonen analyse Opmerking: We hebben deze benaderingen wijd gebruikt om te evalueren van de oorsprong van cellen en hun klonen architectuur in ontwikkeling en ziekte modellen 7 , 8 , 9 , 10. <ol><li>instellen paring tussen muizen met een CreER en muizen met een verslaggever van de Cre. 
	Opmerking: Een CreER wordt gebruikt voor SMC markering; Myh11-CreERT2 of Acta2-CreERT2 muizen 11 , 12 wordt meestal gebruikt voor dit doel. ROSA26R-CreERT2 muizen 13 hebben we gebruikt voor het in grote lijnen het markeren van embryonale weefsels.
	<ol><li>Voor de analyse van het klonen, gebruik een multi-color Cre verslaggever (bijvoorbeeld Confetti of Rainbow [Rb] muizen) 8 , 14 , 15 en gebruiken voor het omzetten van de Lot, een eenkleurige Cre verslaggever (bijvoorbeeld ROSA26R-YFP muizen 16) of de dubbel-kleur Cre verslaggever ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17. 
		Opmerking: Deze regeling fok gebruikt volwassen muizen die zijn 2-6 maanden oud (over het algemeen ~ 30 g) en zal het genereren van embryo's met een CreER en een verslaggever Cre.</li>
	</ol></li> <li>Für die vaginale stekkers in de ochtend met behulp van een metalen sonde en 's middags op de dag van plug detectie als embryonale dag (E) 0,5 overwegen.</li>
	<li>Scheiden van het vrouwtje van de man, wanneer een stekker wordt gedetecteerd.</li>
	<li>Voorbereiden 4-OH-tamoxifen en tamoxifen werkende oplossingen.
	<ol><li>Voor 4-OH-tamoxifen, los 5 mg in 50 µL van 100% ethanol, vortex gedurende 2 minuten en voeg toe 450 µL van maïsolie. Op het ijs, bewerk ultrasone trillingen ten uitvoer niveau 2 voor 10 s cycli met rust tussen cycli totdat monster afkoelt. Nadat het monster volledig is opgelost (meestal ~ 4-5 cycli van ultrasoonapparaat), nemen 200 µL van sonicated oplossing en los op in 1800 µL van maïsolie om definitieve werkoplossing (4-OH-tamoxifen, 1 mg/mL).</li>
		<li>Voor tamoxifen, Verdun tot 50 mg/mL in 100% ethanol en vortex totdat het is opgelost. Verdund in maïsolie te maken van de definitieve werkoplossing (tamoxifen, 10 mg/mL) toe en roer bij 45 ° C om ervoor te zorgen dat het volledig is opgelost.</li>
	</ol></li> <li>Voor vroege embryonale inductie, injecteren 4-OH-tamoxifen intraperitoneally een zwangere dam.
	<ol><li>4-OH-tamoxifen injecties (tot ~ 150 µg per zwangere muis, of ongeveer 5 mg/kg lichaamsgewicht) gebruikt E5.5 en vervolgens als zij levensvatbaar dam, embryo's en pups opleveren.</li>
		<li>Gebruik tamoxifen bij doses van 0,5 - 1,5 mg (of 17-50 mg/kg) voor dammen zwangere met embryo's op ~ E9 en daarna. Gebruik een naald 30G voor alle injecties. 
		Opmerking: Filtratie door een 0,22 µm filter wordt meestal gebruikt om alle mengsels vóór injectie te steriliseren. </li></ol></li> <li>Voor de analyse van het klonen, gebruik intraperitoneaal injecties van hoge doses van 4-OH-tamoxifen (b.v., 5 mg/kg) of tamoxifen (b.v., 50 mg/kg) naar aanleiding van meerdere cellen.
	<ol><li>Afzonderlijke cellen markeren, Titreer beneden de 4-OH-tamoxifen of tamoxifen dosis zodanig dat in het weefsel van belang (dat wil zeggen, de aorta), hebben bijna alle embryo's geanalyseerd (zoals hieronder beschreven aan het einde van deze sectie) ofwel geen cellen met het label of de alleen cellen van een enkele kleur; Dit is de drempel dosis.</li>
	</ol></li> <li>Om te markeren van cellen in de midden-eind zwangerschapsduur periode en op te sporen hun lot of tentiemechanismen in de postnatale muis, injecteren progesteron in de intraperitoneaal holte van de zwangere dam gelijktijdig met tamoxifen in een 1:2 (progesteron: tamoxifen) dosis verhouding. 
	Opmerking: Tamoxifen doses zijn 17-50 mg/kg en progesteron doses zijn 8,5-25 mg/kg (dat wil zeggen, de helft van de tamoxifen doses). De progesteron-injectie kan arbeid door ~ 1-2 dagen vertragen.</li>
	<li>Euthanaseren de dam zwanger van embryo's van een gewenste leeftijd met een daling van de open methode, waar de dam wordt gebracht in een recipiënt met katoen of gaas doorweekt met onverdunde Isofluraan. Bevestigen van dood door het openen van de borstholte om te induceren pneumothorax, door het verwijderen van de vitale organen en/of door het uitvoeren van cervicale dislocatie.</li>
	<li>Reinigt de buik met 70% ethanol. Gebruik schaar aan de buik opengesneden en ontleden uit de baarmoeder. De embryo's verwijderen van de baarmoeder en zorgvuldig het scheiden van de embryo's van de placenta en de dooierzak met pincet.</li>
	<li>De embryo's op E15 of ouder door het uitvoeren van de cervicale dislocatie of onthoofding met chirurgische schaar of een scherp mes euthanaseren. 
	Opmerking: Embryo's jonger dan E15 snel sterven na euthanasie van de moeder en/of de verwijdering van de embryo's van moeder.</li>
	<li>Plaats van de embryo's in ijskoude PBS en knip een klein stukje van de staart met behulp van schaar naar genotype voor de verslaggever CreER en Cre.</li>
	<li>Bevestigen de embryo's in 4% paraformaldehyde bij 4 ° C voor 2 h. Wash de embryo's die drie keer in PBS en vervolgens uit te broeden de embryo's 30 gewichtspercenten sacharose in PBS in 15 mL buizen, te wachten totdat ze zinken, die tot twee dagen kan duren.</li>
	<li>Vulling kunststof bevriezing mallen tot 2/3 van maximumgehalte met optimale snijden temperatuur (OCT) samengestelde. Plaats elk embryo verticaal in de mal, volledig ondergedompeld in oktober Incubate gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) om te minimaliseren van bubbels.</li>
	<li>Plaats bevriezing weefsel blokken rechtop in een droog ijs, 70% ethanol bad te bevriezen. Opslaan van de blokken op -80 ° C.</li>
	<li>De cryostaat temperatuur instellen tot-22 ° C en blokken voor het genereren van transversale secties door de gehele aorta, 10-20 µm dik gesneden. Droog de dia's op RT gedurende 30 minuten vóór ze op te slaan op -80 ° C.</li>
	<li>Ontdooi de dia's op RT, beschermd tegen licht te vermijden het bleken van fluorophores. Wassen van de dia's met PBS-Tween20 0,1%.
	<ol><li>Voor de analyse van het klonen, vlek van de dia's voor kernen (DAPI, 5 mg/mL) en direct beeld andere fluorophores in de regenboog Cre-verslaggever (Cerulean: 433-nm excitatie max, 475-nm uitstoot max; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
		<ol><li>Gebruik de volgende filters voor het opsporen van fluorophores met een rechtop fluorescente microscoop: DAPI (excitatie max/bandbreedte 350/50 nm, emissie max/bandbreedte 460/50 nm), Cerulean (excitatie 436/20 nm, emissie 480/40 nm), texas rood (excitatie 560 / 40 nm, emissie 630/75 nm) en aangepaste filter te scheiden van mCherry van mOrange (excitatie 577/10 nm, emissie 630/50 nm).</li>
		</ol></li> <li>Voor de toewijzing van de lot met de mTmG Cre verslaggever, detecteren GFP (484 nm, 510 nm), door rechtstreeks imaging of door middel van immunokleuring. Gebruik een GFP-filter (excitatie 470/40 nm, emissie 525/50 nm) voor beeldbewerking met een rechtop fluorescente microscoop.</li>
		<li>Voor immunokleuring, incubeer secties met primaire antilichamen 's nachts bij 4 ° C, wassen met 0,1% Triton X-100 in PBS en vervolgens uit te broeden met secundaire antilichamen voor 1 h. Gebruik anti-CD31 (eindconcentratie 0.0016 mg/mL), anti-GFP (0,006 mg/mL) en Cy3-direct geconjugeerd anti-SMA (1:500 in de uiteindelijke verdunning) primaire antilichamen en gebruik secundaire antibodies rechtstreeks geconjugeerd met fluorophores (1:500 in de uiteindelijke verdunning) (Zie de Tabel van de materialen).</li>
	</ol></li> <li>Afbeelding van dia's met een rechtop fluorescente microscoop (vergroting: 4 X - 20 X) of confocal microscoop (10 X-63 X). Voor hoge vergroting, gebruikt u een confocal imaging 63 x olie doelstelling met een numerieke diafragma voor 1.4-0.6 en een framegrootte van 1024 x 1024 pixels.</li>
</ol> 2. Explant embryonale Aorta cultuur Opmerking: deze benadering werd eerder gebruikt om te evalueren van de rol van integrine beta3 in stenose van de transplanteren Eln (- / -) embryonale aorta 9 , 18. <ol><li>een getimede-zwangere dam bij E15.5 door overtollige Isofluraan inademing, per stap 1.8, boven euthanaseren.</li>
	<li>Oogst en de embryo's, per stappen 1.9-1.10, boven euthanaseren.</li>
	<li>Plaats van het embryo blindelings en pin van de uitgebreide ledematen aan de dissectie van bestuur. Visualiseren met een dissectie stereoscoop en gebruik van schaar te snijden een verticale insnijding uit de buik door het borstbeen naar het bovenste thorax. Ontleden weg de thymus, luchtpijp, longen, slokdarm, darm en lever.</li>
	<li>Het hart ventrally met pincet Trek zachtjes en gebruiken van schaar te ontleden de aorta uit de buurt van de dorsale aspect van de borst- en buikholte Holten. Om los van de aorta, snijd het op de proximale wortel en de distale abdominale posities.</li>
	<li>Plaatst de aorta in ijskoude steriel PBS in een cel cultuur kap. De aorta overbrengen in een 24-well-plate en cultuur het in DMEM met 0,5% FBS gedurende maximaal 24 uur bij 37 ° C. 
	Opmerking: Het kweekmedium kunnen worden aangevuld met een blokkerende antilichamen (bijvoorbeeld anti-integrine αvβ3 antilichaam aan 0,02 mg/mL 9; Zie de Tabel van materialen) of een farmacologische agent.</li>
	<li>Wassen van de aorta tweemaal met PBS en vervolgens repareren met 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten</li>
	<li>Wassen driemaal met PBS en overdracht de aorta naar een 1.5-mL tube met 30% sacharose in PBS. Nadat de aorta zinkt, maken bevroren weefsel blokken, gesneden secties en immunokleuring, zoals hierboven beschreven in stappen 1.13-1.15,.</li>
</ol> 3. SMC isolatie van de perinatale Aorta Opmerking: deze aanpak wordt momenteel gebruikt om te vergelijken van de biologie van de aorta SMCs geïsoleerd van Eln (- / -) en wildtype perinatale muizen.
<ol><li>Een RattenUitrustingen pup op postnatale dag (P) 0,5, cervicale dislocatie of door onthoofding met chirurgische schaar of een scherp mes, zoals beschreven in stap 1.10, boven euthanaseren.</li>
	<li>Stap 2.3 uitvoeren en vervolgens, na het openen van de borstkas en de buik, punctie linkerventrikel met 23G naald. Gebruik plastic buizen de naald verbinden met steriel PBS-bevattende spuit gehouden verticaal op een verhoogde positie zodat PBS mondt uit in het linkerventrikel door de zwaartekracht. Toestaan infusie van steriele PBS in linkerventrikel totdat de lever blanches.
	<ol><li>Gebruik van pincet te verwijderen adventitial weefsel aan de buitenkant van de aorta en het ontleden van de aorta, zoals beschreven in stap 2.4.</li>
	</ol></li> <li>Verteren de aorta in één enkele oplossing van DMEM (500 µL) aangevuld met 225 U/mL collagenase, 2,25 U/mL elastase en 1 x antibiotica-antimycotic gedurende 45 minuten bij 37 ° C. handmatig schudden de buis elke 5-10 min.</li>
	<li>In de steriele cel cultuur kap, titurate het verteerd weefsel door pipetteren op en neer met een 200-µL pipet voor het genereren van een eencellige schorsing. Spoel de eencellige suspensie voor een tube van 15 mL, voeg toe 2 mL DMEM en centrifugeer bij 920 x g gedurende 5 min op 25 ° C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet cel in 3 mL SMC kweekmedium (DMEM met 10% FBS aangevuld met 1 µg/mL rhFGF, rhEGF van 10 µg/mL, 100 U/mL penicilline/streptomycine en 2,5 µg Mo/mL amfotericine B). Overbrengen naar een cultuur van 35-mm plaat. 
	Opmerking: Op de eerste isolatie, ~ 400.000 cellen worden verkregen van een enkele P0.5 wildtype aorta; ~ 300.000 van deze cellen zijn SMCs.</li>
	<li>Cultuur de cellen bij 37 ° C en omzetten in verse SMC kweekmedium om de 3 dagen. Het gebruik van standaardtechnieken met trypsine, passage de cellen bij confluent. Gebruik voor experimenten, cellen van passages 3-7.</li>
</ol> 4. Subcutane osmotische mini pomp plaatsing in zwanger (of niet-zwanger) muizen Opmerking: deze benadering was vroeger continu leveren een farmacologische agent (bijvoorbeeld integrine β3 en β5-remmer cilengitide) embryo's in de baarmoeder 9. De pomp werd ingevoegd in de zwangere dam bij E13.5 en behield tot aan de bevalling.
<ol><li>Anesthetize de muizen met 2-5% Isofluraan in zuurstof (debiet van 1 L/min) voor inductie en 1-3% voor onderhoud. Gebruiken de teen-snuifje reflex om te controleren van het niveau van de anesthesie en de verdoving agent naar wens aanpassen. Beheren van subcutane buprenorfine (0.05 - 0.1 mg/kg) voor analgesie.</li>
	De onderrug scheren <li>met tondeuse. Gebruik van steriele gordijnen, handschoenen en instrumenten en het onderhoud van de muizen op een chirurgische verwarmingsplaat tijdens chirurgie.</li>
	<li>Plaatst u elke muis in liggend en de rug Schrob met betadine gevolgd door isopropyl alcohol. Ongeveer 3-5 cm rostraal van de basis van de staart in de onderrug, maken met een scalpel een horizontale huid incisie 0.5 - 1.0 cm in lengte zonder de onderliggende spier verwonden.</li>
	<li>Een hemostat invoegen in de incisie en maken een subcutane zak rostrally voor de innesteling van de pomp door het openen en sluiten van hemostat kaken.</li>
	<li>Vul een osmotische mini pomp met de agent van keuze, volgens de fabrikant &#39; s richtsnoeren (Zie de Tabel van de materialen). Plaats van de gevulde pomp in de zak en sluit de incisie met clips of niet-absorbeerbare draadjes van de 6-0. Zorgen dat de totale tijd die chirurgische minder dan 10 min. is</li>
	De muizen elke 15 min volgen <li>post-operatively, totdat zij hebben hersteld van sternale ligcomfort. Beheren van subcutane buprenorfine (0.05 - 0.1 mg/kg) elke 6-12 h gedurende 48 uur. Wanneer de muizen hebben volledig hersteld van de narcose, controleren hen dagelijks. De clips verwijderen of hechtingen 7-10 dagen na chirurgie.</li>
</ol>

<ol><li>Shankman, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLF4-dependent+phenotypic+modulation+of+smooth+muscle+cells+has+a+key+role+in+atherosclerotic+plaque+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis.</a> Nat Med. 21, 628-637 (2015).</li>
<li>Rowe, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+cell+apoptosis+in+aneurysmal%2C+occlusive%2C+and+normal+human+aortas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas.</a> J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).</li>
<li>Rodella, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+aortic+aneurysm+and+histological%2C+clinical%2C+radiological+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation.</a> Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).</li>
<li>Lewandoski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+control+of+gene+expression+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Conditional control of gene expression in the mouse.</a> Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).</li>
<li>Lakso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+oncogene+activation+by+site-specific+recombination+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).</li>
<li>Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+site-specific+recombination+in+mammalian+cells+using+a+ligand-dependent+chimeric+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).</li>
<li>Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+developing+artery+muscularization+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension.</a> Cell Rep. 6, 809-817 (2014).</li>
<li>Greif, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+construction+of+an+arterial+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Radial construction of an arterial wall.</a> Dev Cell. 23, 482-493 (2012).</li>
<li>Misra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+beta3+inhibition+is+a+therapeutic+strategy+for+supravalvular+aortic+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis.</a> J Exp Med. 213, 451-463 (2016).</li>
<li>Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+cell+progenitors+are+primed+to+muscularize+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension.</a> Sci Transl Med. 7, (2015).</li>
<li>Wirth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G12-G13-LARG-mediated+signaling+in+vascular+smooth+muscle+is+required+for+salt-induced+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension.</a> Nat Med. 14, 64-68 (2008).</li>
<li>Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+temporally-controlled+targeted+mutagenesis+in+smooth+muscle+cells+of+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse.</a> Genesis. 47, 14-18 (2009).</li>
<li>Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+noninvasive+genetic%2Fpharmacologic+strategy+for+visualizing+cell+morphology+and+clonal+relationships+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse.</a> J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).</li>
<li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143, 134-144 (2010).</li>
<li>Kumar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cells.+Defining+a+mesenchymal+progenitor+niche+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution.</a> Science. 346, 1258810(2014).</li>
<li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Dev Biol. 1, 4(2001).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
<li>Li, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+is+an+essential+determinant+of+arterial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis.</a> Nature. 393, 276-280 (1998).</li>
<li>Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+myosin+heavy+chain+exclusively+marks+the+smooth+muscle+lineage+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis.</a> Circ Res. 75, 803-812 (1994).</li>
<li>Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elastin+gene+is+disrupted+by+a+translocation+associated+with+supravalvular+aortic+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis.</a> Cell. 73, 159-168 (1993).</li>
<li>Li, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+arterial+pathology+in+mice+and+humans+hemizygous+for+elastin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin.</a> J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).</li>
<li>Li, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+point+mutations+cause+an+obstructive+vascular+disease%2C+supravalvular+aortic+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis.</a> Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).</li>
<li>Pober, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Williams-Beuren+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Williams-Beuren syndrome.</a> N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).</li>
<li>Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+treatment+of+cardiovascular+disease+in+Williams-Beuren+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome.</a> J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).</li>
<li>Holtwick, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle-selective+deletion+of+guanylyl+cyclase-A+prevents+the+acute+but+not+chronic+effects+of+ANP+on+blood+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).</li>
<li>Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRP%3A+role+in+vascular+wall+integrity+and+protection+from+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis.</a> Science. 300, 329-332 (2003).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+adult+smooth+muscle+cell-targeted+Cre+recombinase+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).</li>
<li>Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+bacterial+artificial+chromosome+transgenic+mice+expressing+mCherry+fluorescent+protein+substituted+for+the+murine+smooth+muscle+alpha-actin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene.</a> Genesis. 48, 457-463 (2010).</li>
<li>Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+reporter+gene+transgenic+mouse+demonstrates+heterogeneity+in+hepatic+fibrogenic+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations.</a> Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).</li>
<li>Yokota, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+lacks+a+transplantable+progenitor+for+smooth+muscle+type+alpha-actin-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells.</a> Stem Cells. 24, 13-22 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In tegenstelling tot het uitgebreide onderzoek van de lymfkliertest aorta en zijn grote takken in volwassen pathologische condities, zoals de modellen van atherosclerose, is minder bekend met betrekking tot de voedselproductie en de pathogenese van de embryonale en perinatale aorta. Hier, wij concentreren op de embryonale/perinatale aorta, specifiek het SMCs, en protocollen om te bestuderen van de aorta door middel van in vivo, weefsel explant, verstrekken en SMC isolatie benaderingen. Deze gratis methoden biede...

De bloedsomloop systems van meercellige organismen functie voor voedingsstoffen en zuurstof naar de cellen die zijn niet in contact met de externe omgeving en het verwijderen van afvalstoffen en koolstofdioxide van deze cellen. In gewervelde dieren bestaat de primaire bloedsomloop uit het hart, welke pompen bloed door middel van een reeks van bloedvaten. De muren van de grote bloedvaten zoals slagaders en aders, bestaan uit drie lagen: ik) de intima, of binnenlaag van endotheliale cellen; II) de media, of de middelste laag van wisselende omtrek langwerpige zachte spiercellen SMCs en elastische lamellen; en iii) de adventitia, of de buitenlaag van bindweefsel en fibroblasten. De overgrote meerderheid van de studies in vasculaire biologie focus op endotheliale cellen, onderzoek naar de vorming van nieuwe endothelial cel omzoomde buizen door middel van angiogenese. In vergelijking krijgen SMCs relatief weinig aandacht. SMCs zijn echter een kritische celtype in de bouw van de normale arteriële muur en vasculaire pathologieën.
De aorta is de grootste kaliber slagader in het lichaam, het ontvangen van de cardiale output van het linkerventrikel van het hart. Het wordt geteisterd door uiteenlopende ziekten bij de mens, met inbegrip van atherosclerose en aneurysma dissectie. In volwassen organismen, worden de aorta en zijn grote takken intens bestudeerd in modellen van vasculaire ziekte. Bijvoorbeeld, hoog vet dieet gevoed muizen die zijn leeg voor de codering van de low-density lipoprotein receptor of apolipoproteïne E, gene ontwikkelen van atherosclerose, en recente lot toewijzing studies blijkt dat bestaande SMCs aanleiding geven tot meerdere celtypen in de atherosclerotische plaque1. In de aorta aneurysma omvatten pathologische veranderingen SMC apoptosis en extracellulaire matrix remodelleren van2,3.
Aanzienlijk minder is gekend over SMC genuitdrukking en pathogenese tijdens de embryonale en perinatale periode. Wij bieden hier protocollen voor studeren embryonale en perinatale aorta SMCs in vivo, in weefsel explantaten en geïsoleerde cellen. Bijvoorbeeld, bakent het eerste deel van het protocol lot mapping en klonen analyse in embryonale muizen. CRE recombinase uitgedrukt onder de controle van de promotor van een cel-specifieke vergemakkelijkt de markering van de specifieke cellen en hun nageslacht4,5,6; temporele controle van cel-specifieke etikettering kan echter uitdagende zijn tijdens de embryonale ontwikkeling in muizen. In dit verband bieden met embryo's uiting geven aan de voorwaardelijke CreER onder actief in SMCs (e.g.,Myh11 of Acta2) en een Cre-verslaggever, de promotor wij de methoden voor het injecteren van tamoxifen of zijn actieve metaboliet 4-OH-tamoxifen in zwangere dammen en voor het analyseren van de gelabelde cellen in embryo's of postnatale nakomelingen. Bovendien, in tegenstelling tot lot toewijzing studies, waarvoor voornamelijk gebruik maken van Cre verslaggevers met een enkele verslaggever fluorophore1,7, klonen analyse is aanzienlijk verbeterd met Multi-Color Cre verslaggevers.
De tweede en derde van protocol beschreven methoden om te isoleren en kweken van embryonale aorta explantaten en aorta SMCs van pasgeborenen, respectievelijk. Deze benaderingen toestaan voor het manipuleren van signaalroutes, specifiek in de aorta explantaten of SMCs, en voor het analyseren van de directe effecten van farmacologische agenten. Zo kan de rol van specifieke genen in het weefsel van belang worden vertoond in een veel snellere manier dan door middel van traditionele genetische manipulaties in muizen. Bovendien, de geïsoleerde SMC studies vergemakkelijken de analyse van cel migratie en adhesie, die technisch beperkt in vivo.
Tot slot, de vierde protocol sectie bakent de plaatsing van een subcutane osmotische mini pomp geladen met farmacologische agenten in zwanger (of niet-drachtige) muizen. Deze methode vereenvoudigt de analyse van het effect op de ontwikkeling van het embryo veroorzaakt door agentia die continue infusie vanwege snelle stofwisseling vereisen. Het alternatief voor frequente injecties is niet praktisch voor veel agenten en moet worden voorkomen, aangezien het groot ongemak in de zwangere dam veroorzaken kan.

<table><tbody><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Corn oil</td><td>Sigma</td><td>C-8267</td><td>Vehicle voor tamoxifen</td></tr><tr><td>4-OH-tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>Actieve metaboliet van tamoxifen</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783-5G</td><td>Gebruik in de helft van de concentratie van tamoxifen</td></tr><tr><td>OCT compound</td><td>Sakura tissue tek</td><td>4583</td><td>Voor het maken van cryoblokken</td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Polysciences inc</td><td>18986</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>IHC kleuring van de kern, eindconcentratie 5 mg/mL</td></tr><tr><td>Cy3 rechtstreeks geconjugeerd anti-SMA antilichaam</td><td>Sigma</td><td>A2547</td><td>IHC kleuring van SMA, eindverdunning 1:500</td></tr><tr><td>Anti-CD31 antilichaam</td><td>BD Pharmingen</td><td>550274</td><td>IHC kleuring van GFP, eindconcentratie 0,006 mg/mL</td></tr><tr><td>Anti-GFP antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11121</td><td>IHC kleuring van CD31, eindconcentratie 0,0016 mg/mL</td></tr><tr><td>Secundair antilichaam geit anti-konijn, Alexa 647</td><td>Life Technologies</td><td>a21244</td><td>IHC kleuring, eindconcentratie 0,004 mg/mL</td></tr><tr><td>Secundair antilichaam geit anti-konijn, Alexa 488</td><td>Life Technologies</td><td>a11008</td><td>IHC kleuring, eindconcentratie 0,004 mg/mL</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10567-014</td><td>Voor celcultuur</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Anti-integrine bèta3 blokkerend antilichaam</td><td>BD Biosciences</td><td>553343</td><td>Clone 2C9.G2, eindconcentratie 0,02 mg/mL</td></tr><tr><td>Collageenase</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>44H14977A</td><td>Voor het verteren van aorta</td></tr><tr><td>Elastase</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>34K15139</td><td>Voor het verteren van aorta</td></tr><tr><td>Antibioticum-antimycoticum (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant humaan FGF</td><td>Promega</td><td>G5071</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant humaan EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>Weefselcultuur platen</td><td>Corning</td><td>CLS430165</td><td></td></tr><tr><td>Alzet osmotische mini-pomp</td><td>Durect Corporation</td><td>2001</td><td></td></tr><tr><td>ECLIPSE 80i Upright Fluorescerende Microscoop</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;TCS&nbsp;SP5</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Branson Sonifier 450</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myh11-CreERT2 muizen</td><td>The Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>19079</td><td></td></tr><tr><td>Acta2-CreERT2 muizen</td><td></td><td></td><td>Verkregen van het laboratorium van Dr. Pierre Chambon en Daniel Metzger</td></tr><tr><td>ROSA26R-CreERT2 muizen</td><td>The Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>8463</td><td></td></tr><tr><td>ROSA26R(mTmG/mTmG) muizen</td><td>The Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>&nbsp;026862</td><td></td></tr><tr><td>ROSA26R(EYFP/EYFP) muizen</td><td>The Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>&nbsp;006148&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ROSA26R(Confetti/Confetti) muizen</td><td>The Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>13731</td><td></td></tr><tr><td>ROSA26R(Rb/Rb) muizen</td><td>Lab of Dr. Irv Weissman</td><td></td><td>Verkregen van het laboratorium van Dr. Irv Weissman</td></tr></tbody></table>

met behulp van in vivo en weefsel en cel explant benaderingen te bestuderen van de voedselproductie en de pathogenese van de embryonale en perinatale aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

De aorta is de grootste slagader in het lichaam. De aorta muur bestaat uit een binnenlaag van endotheliale cellen, een middenlaag van wisselende elastische lamellen en zachte spiercellen (SMCs) en een buitenlaag van fibroblasten en extracellulaire matrix. In tegenstelling tot de wijdverbreide studie van pathologische modellen (bijvoorbeeld atherosclerose) in de volwassen aorta, is veel minder bekend over de embryonale en perinatale aorta. Hier, wij richten ons op SMCs en protocollen voor de analyse van de voedselproductie en pathogenese van embryonale en perinatale aorta SMCs in normale ontwikkeling en ziekte. In het bijzonder de vier protocollen opgenomen zijn: ik) in vivo embryonale lot mapping en klonen analyse; II) explant embryonale aorta cultuur; III) SMC isolatie van de perinatale aorta; en iv) plaatsing van de subcutane osmotische mini pomp bij zwangere (of niet-drachtige) muizen. Dus, deze benaderingen vergemakkelijken het onderzoek van de origin(s), lot en klonen architectuur van SMCs in de aorta in vivo. Zij maken voor het moduleren van embryonale aorta morfogenese in utero door voortdurende blootstelling aan een farmacologische agenten. Bovendien, geïsoleerde aorta weefsel explants of aorta SMCs inzichten te krijgen in de rol van de specifiek gen doelen tijdens fundamentele processen zoals muscularization, proliferatie en migratie kunnen worden gebruikt. Deze hypothese genererende experimenten op geïsoleerde SMCs en het transplanteren aorta kunnen vervolgens worden beoordeeld in het kader in vivo via farmacologische en genetische benaderingen.

In een representatieve klonale analyse van SMCs in embryo's mutant voor Eln (het gen codering van de extracellulaire matrix proteïne elastine), Eln(+/-), Acta2-CreERT2 muizen werden gedekt door Eln(+/-) muizen ook dragen de Multi kleur ROSA26R(Rb/Rb) verslaggever. Zoals beschreven in stap 1, stekkers werden gecontroleerd, zwangere dammen waren geïnduceerde met een enkele tamoxifen injectie (1,5 mg) bij E12.5 en zij w...

Protocollen voor het bestuderen van de embryonale en perinatale lymfkliertest aorta met behulp van in vivo klonale analyse en lot toewijzing, aorta explantaten en geïsoleerde gladde spier cellen zijn gedetailleerd hier. Deze uiteenlopende benaderingen vergemakkelijken het onderzoek van de morfogenese van de embryonale en perinatale aorta in normale ontwikkeling en de pathogenese in ziekte.

Met behulp van In Vivo en weefsel en cel Explant benaderingen te bestuderen van de voedselproductie en de pathogenese van de embryonale en perinatale Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Het algemene doel van deze procedures is om de vorming van de embryonale en perinatale aortawanden tijdens een normale ontwikkeling te bestuderen, evenals verstoringen in dit proces tijdens ziekte. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de vasculaire ontwikkeling, zoals de herkomst van de cellen die bijdragen aan de embryonale en perinatale vasculaire media. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat ze de evaluatie mogelijk maken van de pathogenese en morfogenese van de gladde spieren die plaatsvinden tijdens de embryonale en perinatale ontwikkelingsstadia.De implicaties van deze technieken zijn gericht op de therapie van vaatziekten, zoals supravalvulaire aortastenose of periodieke aandoeningen die leiden tot overmatige productie van gladde spiercellen. De procedure voor het plaatsen van de minipomp wordt uitgevoerd door Dr. Jiasheng Zhang, een wetenschappelijk onderzoeker die een microsurgery core aan de Yale University leidt. Begin met het opzetten van paringsparen tussen muizen van twee tot zes maanden oud met Cre ER en muizen met een cre-reporter.Controleer elke ochtend met een metalen sonde op vaginale pluggen en scheid het vrouwtje van het mannetje zodra er een plug wordt waargenomen. Voor vroege embryonale inductie wordt tamoxifen intraperitoneaal geïnjecteerd bij het drachtige vrouwtje. Om cellen in de midden- tot late drachtperiode te markeren en hun lot of clonaliteit in de postnatale muis te volgen, wordt progesteron samen met tamoxifen in een doseringsverhouding van één op twee in de intraperitoneale holte van het drachtige vrouwtje geïnjecteerd.Om de embryo's op de juiste embryonale datum te oogsten, wordt de buik van de drachtige muis gereinigd met 70%ethanol en wordt de buik met een schaar geopend om de uterus te verwijderen. Verzamel de embryo's uit de uterus met een pincet en een stereomicroscoop om ze voorzichtig te scheiden van de placenta en de dooierzak. Fixeer de embryo's in 4%paraformaldehyde bij vier graden celsius gedurende twee uur.Vervolg met drie wasbeurten in PBS om het overtollige fixatief te verwijderen. Na de derde wasbeurt worden de embryo's geïncubeerd in 30% sucrose in PBS, in individuele buisjes van 15 milliliter, totdat de embryo's naar beneden zakken. Vul vervolgens plastic vriesmallen voor twee derde van het maximale volume met optimum cutting temperature compound en plaats in elke mal één embryo verticaal.Na 10 minuten bij kamertemperatuur worden de weefsels rechtopopgevroren in een bad van droogijs en 70% ethanol, waarna de temperatuur van de cryostaat wordt ingesteld op 22 °C. Snijd de weefselblokken om transversale weefselcoupes van 10 tot 20 µm dikte te verkrijgen door de gehele aorta, waarbij elke sectie direct na verkrijging op een glazen microscoopdia wordt opgevangen. Wanneer alle monsters zijn verzameld, worden de dia's 30 minuten bij kamertemperatuur gedroogd voordat ze worden opgeslagen bij 80 °C.Om de weefselmonsters te kleuren, ontdooi de coupes bij kamertemperatuur, bescherm ze tegen licht om bleken van de fluoroforen te voorkomen en was de coupes in 0,1% PBS twin 20. Voor clonale analyse kleuren de weefsels met een geschikte kernkleurstof en beelden de overige fluoroforen van de rainbow cre-reporter direct af met een fluorescentiemicroscoop. Voor fate mapping, met de mTmG cre-reporter, visualiseert de GFP-expressie door directe beeldvorming met of zonder immunokleuring.Om een embryonale aorta te kweken en te explanteren, plaatst u het embryo in rugligging en bevestigt u de uitgestrekte ledematen aan een dissectieplank onder een stereomicroscoop. Maak met een schaar een verticale incisie vanaf de buik via het borstbeen naar de bovenste thorax. Disseceer de trachea, longen, slokdarm, lever en darmen voorzichtig weg.Gebruik een pincet om het hart voorzichtig ventraal te trekken en gebruik een schaar om de aorta te dissekeren van de dorsale zijde van de borst- en buikholtes. Snijd de aorta door bij de proximale wortel en op de distale abdominale posities om deze los te maken en plaats de geoogste aorta in steriele, ijskoude PBS in een cellculture-kap. Na een korte wasbeurt wordt de aorta overgebracht naar één putje van een 24-wells plaat met DMEM-medium aangevuld met 0,5% PBS, waarna de plaat voor maximaal 24 uur in een cellculture-incubator wordt geplaatst.Was na afloop van de incubatie de aorta twee keer met PBS en fixeer het weefsel gedurende 20 minuten in 4%paraformaldehyde. Na nog drie wasbeurten met PBS wordt de aorta overgebracht naar een buisje van 1,5 milliliter met 30%sucrosine PBS totdat het weefsel zinkt. Voor de isolatie van gladde spiercellen uit de perinatale aorta wordt een naald van 23 gauge gebruikt om de linker ventrikel van een muis van 0,5 postnatale dagen te puncteren; gebruik plastic slangetjes om de naald te verbinden met een spuit met steriele PBS, die verticaal in een verhoogde positie wordt gehouden, zodat de PBS door zwaartekracht in de linker ventrikel stroomt.Wanneer de lever bleek wordt, gebruik dan een pincet om het adventitiaal weefsel aan de buitenkant van de aorta te verwijderen en oogst de aorta zoals zojuist gedemonstreerd. Dissocieer het aortaweefsel in 500 µL digestiesolution door elke vijf tot 10 minuten handmatig te schudden. Breng de buis na 45 minuten over naar een steriele cellenturekap en gebruik een 200 µL pipette om het weefselsuspensa te tritureren totdat een suspensie van enkelvoudige cellen is verkregen.Breng de cellen over naar een conische buis van 15 milliliter, voeg vervolgens twee milliliters DMEM toe en verzamel de cellen door middel van centrifugatie. Resuspendeer het pellet in drie milliliters kweekmedium voor gladde spiercellen en zaai de cellen uit op een kweekplaat van 35 millimeter. Plaats de plaat vervolgens in een incubator van 37 degree celsius en ververs het celkweekmedium elke drie dagen.Om een subcutane osmotische minipomp te plaatsen, begint u met het scheren van de onderrug van een geanestheseerde muis met een trimmer en plaatst u de muis in buikligging op een verwarmde chirurgische plaat. Reinig de rug met betadine en isopropylalcohol en plaats de muis onder een stereomicroscoop. Maak vervolgens met een scalpel een horizontale huidincisie van 0,5 tot 1 centimeter, ongeveer drie tot vijf centimeter rostrocaudaal ten opzichte van de staartbasis, zonder de onderliggende spier te beschadigen.Plaats een hemostaat in de incisie en open en sluit de kaken van de hemostaat om een subcutane pocket te creëren. Plaats een osmotische minipomp, gevuld met de betreffende stof, in de pocket en gebruik 6 niet-absorbeerbare hechtingen om de incisie te sluiten. Laat de muis vervolgens herstellen onder bewaking totdat deze in stand bij sternale recumbency is.Embryo's met een mutatie in het gen dat codeert voor het extracellulaire matrixeiwit elastine, hopen vanaf embryonale dag 15,5 een overschot aan gladde spiercellen op in de binnenste lagen van de aorta. Clonale analyse van de gladde spiercellen met de multicolor cre-reporter tijdens dit proces geeft aan dat de cellen meerdere kleuren hebben en dus polyklonaal zijn. Immunokleuring van geëxplante aortasneden onthult dat aorta's van elastine-mutanten op embryonale dag 15,5 binnen 18 uur kweek hypermusculair en stenotisch worden, een proces dat wordt afgezwakt door de toevoeging van een blokkerend antilichaam tegen integrine bèta drie.Gladspiercellen geïsoleerd uit de aorta van wildtype muizen op postnatale dag 0,5 brengen markers voor gladspiercellen tot expressie, maar geen CD31. Continue infusie van een integrine bèta drie-remmer in zwangere moeders vanaf embryonale dag 13,5 vermindert aortastenose en hypermuscularisatie significant bij muizen die mutant zijn voor het extracellulaire matrixeiwit elastine, maar verandert de aorta van wildtype muizen niet.Zodra de techniek voor het plaatsen van de osmotische minipomp onder de knie is, kan deze bij correcte uitvoering in minder dan 10 minuten worden voltooid. Door deze procedures te volgen, kunnen deze benaderingen ook worden geëxtrapoleerd naar de studie van gladde spiercellen in niet-vasculaire weefsels, zoals weefsel van het maagdarmkanaal of longgebieden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u in-vivo embryonale fit-mapping en clonale analyse uitvoert, geëxplanteerde embryonale aorta's en perinatale aortaglattespiercellen kweekt, en subcutane osmotische minipompen explanteert.Vergeet niet dat het werken met muizen, tamoxifen en een vaste reducer gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedures, zoals het dragen van handschoenen en een labjas en het betrachten van extra zorgvuldigheid.

using-vivo-tissue-cell-explant-approaches-to-study-morphogenesis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We introduceren een hele-mount immunohistochemie en laser scanning confocale microscopie met meerdere etikettering voor het analyseren van complexe vasculaire netwerk-vorming in de muis embryonale ledematen huid.

Whole-mount Immunohistochemische Analyse voor Embryonale Limb Skin vaatstelsel: een modelsysteem voor Vasculaire Vertakkingen Morphogenesis in Embryo Study

De neonatale muizen netvlies biedt een goed gekarakteriseerd fysiologisch model van angiogenese, die onderzoeken van de rol van de verschillende genen of medicijnen die angiogenese moduleren in een...

Hele Mount immunofluorescentiekleuring van de Neonatale Mouse Retina naar Angiogenese Onderzoek<em&gt; In vivo</em

We beschrijven een aantal methoden om kleurstoffen injecteren van DNA vectoren, virussen en cellen om zowel cellot en fenotype van endogene en geënte cellen uit embryonale of pluripotente cellen in muizenembryo's op embryonale dag (E) 9,5 en latere stadia bewaken ontwikkeling.

Cell Labeling en Injectie in ontwikkelingslanden Embryonale Mouse Hearts

Pathologie van de aorta kan leiden tot ernstige morbiditeit en mortaliteit, daarom is onderzoek naar de progressie van de ziekte en mogelijke therapieën gerechtvaardigd. Hier presenteren we een protocol om de muisaorta te isoleren en te verwijderen om onderzoekers te helpen bij hun onderzoek naar hart- en vaatziekten.

Isolatie en Excisie van Muriene Aorta; Een veelzijdige techniek in de studie van hart- en vaatziekten

Dit manuscript beschrijft een techniek voor de visualisatie van de zich ontwikkelende vasculaire structuur. Hierbij hebben we in utero intra-cardiale FITC-gelabelde tomatenlectin micro-injecties gebruikt op muizenembryo's. Met behulp van deze techniek, bepalen we de geperfuseerde en niet-geperfuseerde vaten in de hele embryonale nier.

In Utero van intracardiale Tomaat-lectine Injecties op muis embryo&#39;s in te schatten nierdoorbloeding

Voor de eerste keer presenteren we hier een reproduceerbare bandingprocedure om de hemodynamiek in het zich ontwikkelende hart ex ovo te veranderen. Dit wordt bereikt door de uitstroomtractus (OFT) gedeeltelijk te constricten.

Een roman<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Banding techniek voor Intracardiale Hemodynamica Alter in een embryonale Chicken System

We presenteren een protocol voor de analyse van coronairvaten geheel muriene embryonale hart tot E15.5, met behulp van standaard immunologische werkwijzen kleuring gevolgd door optische klaring en confocale microscopie. Deze techniek maakt visualisatie van bloedvaten door het gehele hart zonder dat tijdrovende analyse van seriële secties.

Analyse van de coronaire vaten in Gewist Embryonale Hearts

Dit protocol toont een fluorescentie gebaseerde methode om de vasculatuur te visualiseren en de complexiteit ervan te kwantificeren in Xenopus tropicalis . Bloedvaten kunnen na de injectie van een fluorescerende kleurstof in het kloppende hart van een embryo worden gedetecteerd na genetische en / of farmacologische manipulaties om in vivo cardiovasculaire ontwikkeling te bestuderen.

Visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Bij deze methode zijn embryonale cardiale weefsels chirurgisch microdissected, losgekoppeld, fluorescently label en host embryonale weefsels ingeplant. Dit biedt een platform voor het bestuderen van de individu of weefsel niveau developmental organisatie onder ectopische hemodynamische voorwaarden en/of veranderde omgevingen van de paracrine/juxtacrine.

Microinjection-gebaseerd systeem voor In Vivo implantatie van embryonale Cardiomyocytes in het aviaire Embryo

Klassiek is het endocardium van de embryonale klep primordium van de muis geanalyseerd met behulp van transversale, coronale of sagittale secties. Onze nieuwe benadering voor en face, tweedimensionale beeldvorming van het endocardium in valvulogene gebieden maakt planaire polariteit en celherschikkingsanalyse van het endocardium mogelijk tijdens de ontwikkeling van de klep.

En Gezicht Endocardiale kussenvoorbereiding voor planaire morfogeneseanalyse bij muizenembryo's

Leer in vivo clonale analyse en fate mapping om de morfogenese van de embryonale en perinatale aorta te bestuderen. Deze methoden onthullen de oorsprong van gladde spiercellen en helpen bij het begrijpen van vasculaire ontwikkeling en ziekte.

Met behulp van In Vivo en weefsel en cel Explant benaderingen te bestuderen van de voedselproductie en de pathogenese van de embryonale en perinatale Aorta (Video) | JoVE Journal

Met behulp van In Vivo en weefsel en cel Explant benaderingen te bestuderen van de voedselproductie en de pathogenese van de embryonale en perinatale Aorta

Meer video's verkennen