Met behulp van In Vivo en weefsel en cel Explant benaderingen te bestuderen van de voedselproductie en de pathogenese van de embryonale en perinatale Aorta

Het algemene doel van deze procedures is om de vorming van de embryonale en perinatale aortawanden te bestuderen tijdens normale ontwikkeling, evenals verstoringen in dit proces tijdens ziekte. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van vasculaire ontwikkeling te beantwoorden, zoals wat de bron is van de cellen die bijdragen aan de embryonale en perinatale vasculaire medium. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat ze de evaluatie van de gladde spier pathogenese en morfogenese die plaatsvinden tijdens de embryonale en perinatale ontwikkelingsstadia mogelijk maken.

De implicatie van deze technieken is gericht op de therapie van vasculaire ziekten zoals, supravalvulaire aortastenose van periodieke ziekte die overmatige sumo-celproductie veroorzaakt. De mini-pompplaatsingprocedure zal worden uitgevoerd door Dr. Jiasheng Zhang, een onderzoekswetenschapper die een microchirurgie-kern leidt en Yale University. Begin met het instellen van paringsparen tussen twee tot zes maanden oude muizen met Cre ER en muizen met een cre-reporter.

Gebruik een metalen sonde om elke ochtend op vaginale pluggen te controleren en scheid de vrouwtjes van de mannetjes wanneer een plug wordt gedetecteerd. Voor vroege embryonale inductie, injecteer tamoxifen intraperitoneal in de zwangere vrouw. Om cellen te markeren in de midden tot late zwangerschapsperiode en om hun lot of clonaliteit in de post-natale muis te traceren, injecteer progesteron in de intraperitoneale holte van de zwangere vrouw incompetent met tamoxifen in een verhouding van een tot twee doses.

Om de embryo's op de juiste embryonale datum te oogsten, reinig de buik van de zwangere vrouw met 70% ethanol en gebruik schaar om de buik te openen om de baarmoeder te verwijderen. Verzamel de embryo's uit de baarmoeder met behulp van pincetten en een stereomicroscoop om ze voorzichtig te scheiden van de placenta en dooierzak. Fixeer de embryo's in 4% paraformaldehyde bij vier graden Celsius gedurende twee uur.

Gevolgd door drie wasbeurten in PBS om het overtollige fixatief te verwijderen. Na de derde wasbeurt, incubeer de embryo's in 30% sucrose in PBS, in individuele 15 milliliter buizen totdat de embryo's zinken. Vul vervolgens plastic vriesvormen met optimum snijtemperatuurscompound tot twee derde van het maximale volume en plaats één embryo verticaal in elke mal.

Na 10 minuten op kamertemperatuur, bevries de weefsels rechtop in een dry ice 70% ethanol bad en stel de cryostat-temperatuur in op 22 graden Celsius. Snijd de weefselblokken om 10 tot 20 micrometer dikke transversale weefselsneden te genereren door de hele aorta, waarbij elk segment op een glazen microscoopglas wordt vastgelegd zodra ze zijn verkregen. Wanneer alle monsters zijn verkregen, droog de slides bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten voordat ze worden opgeslagen bij 80 graden Celsius.

Om de weefselmonsters te kleuren, ontdooi de slides bij kamertemperatuur, bescherm ze tegen licht om fluorofoorverkleuring te voorkomen en was de slides in 0,1% PBS twin 20. Voor clonale analyse, kleuren de weefsels met een geschikte nucleaire kleurstof en beeld direct de andere fluroforen van de regenboog cre-reporter af op een fluorescerende microscoop. Voor lot-mapping, met de mTmG cre-reporter, visualiseer de GFP-expressie door directe beeldvorming met of zonder immunokleuring.

Om een embryonale aorta te kweken en explanteren, plaats de embryo in de rugligging en bevestig de uitgerekte ledematen aan een dissectiebord onder een stereomicroscoop. Gebruik schaar om een verticale incisie te maken vanaf de buik door het borstbeen tot aan de bovenste thorax. Disseceer de fijne trachea, longen, slokdarm, lever en darm weg.

Gebruik pincetten om voorzichtig het hart ventraal te trekken en gebruik schaar om de aorta weg te disseceren van de dorsale aspecten van de thoracale en abdominale holtes. Snijd de aorta bij de proximale wortel en de distale abdominale posities om het los te maken en plaats de geoogste aorta in steriele ijskoude PBS in een cellencultuurkap. Na een korte wasbeurt, breng de aorta over naar één put van een 24-putsplaat, bevattende DMEM-medium aangevuld met 0,5% PBS en plaats de plaat in een cellencultuurincubator gedurende maximaal 24 uur.

Aan het einde van de incubatie, was de aorta twee keer met PBS en fixeer het weefsel in 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten. Na drie extra PBS-wasbeurten, breng de aorta over naar een 1,5 milliliter buis met 30% sucrosine PBS totdat het weefsel zinkt. Voor isolatie van soepele spiercellen van de perinatale aorta, gebruik een 23 gauge naald om de linker ventrikel van een postnatale dag 0,5 muis te doorboren en gebruik plastic buisleidingen om de naald aan te sluiten op een steriele PBS-bevattende spuit, verticaal gehouden in een verhoogde positie, zodat de PBS door zwaartekracht in de linker ventrikel stroomt.

Wanneer de lever kleurt, gebruik pincetten om het adventitiële weefsel aan de buitenkant van de aorta te verwijderen en oogst de aorta zoals net gedemonstreerd. Dissocieer het aortaweefsel in 500 microliters spijsverteringsoplossing met handmatig schudden elke vijf tot 10 minuten. Na 45 minuten, breng de buis over naar een steriele cellencultuurkap en gebruik een 200 microliter pipette om het weefselslurry te trituren totdat een enkele cel suspensie is verkregen.

Breng de cellen over naar een 15 milliliter conische buis en voeg vervolgens twee milliliters DMEM toe en verzamel de cellen door centrifugatie. Resuspendeer de pellet in drie milliliters soepele spiercelcultuurmedium en zaai de cellen op een 35 millimeter cultuurplaat. Plaats vervolgens de plaat in een 37 graden Celsius incubator, waarbij het cellencultuurmedium elke drie dagen wordt ververst.

Om een subcutane osmotische minipomp te plaatsen, begin door de onderrug van een verdoofde muis te scheren met een scheermes en plaats de muis in de buikligging op een verwarmde chirurgische plaat. Was de rug met betadine en isopropylalcohol en plaats de muis onder een stereomicroscoop. Gebruik vervolgens een scalpel om een horizontale huidsneding van 0,5 tot een centimeter te maken, ongeveer drie tot vijf centimeter rostrale tot de basis van de staart, zonder de onder