Name: Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Leer live imaging van secundaire verhemeltefusie bij muizenembryo's met confocale microscopie. Deze methode maakt directe observatie van celprocessen tijdens craniale ontwikkeling mogelijk voor onderzoekers.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken M. Douglas Benson voor de eerste gesprekken over secundaire paletbeelden. We erkennen ook David Castaneda-Castellanos (Leica) en Chris Rieken (Zeiss) voor hun hulp om beeldvormende omstandigheden in confocale microscopie aan te passen. We waarderen Lynsey Hamilton (Bitplane) voor nuttige suggesties voor kwantitatieve beeldanalyse met behulp van Imaris-software. Dit werk werd gefinancierd door NIH / NIDCR R01 DE025887.

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de protocollen van de Universiteit van Californië bij de Institutional Animal Care and Use Committee van San Francisco. 1. Voorbereiding van Live Imaging Media <ol><li> Bereiding van vloeibare kweekmedia <ol><li> Voeg 20% ​​foetaal runder serum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 μg / ml streptomycine, 200 μg / ml L-ascorbinezuur, 15 mM HEPES toe aan Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 media. OPMERKING: Live imaging media is vers gemaakt direct voor de imaging. Deze media bevat fenol-rood, wat kan leiden tot fototoxiciteit over lange tijdscursussen van livebeeldvorming. Het vervangen van media zonder fenol-rood kan de langetermijnbeelden verbeteren. </li></ol></li><li> Bereiding van laagsmeltende agarose oplossing <ol><li> Los 350 mg laagsmeltende agarose op in 10 ml geautoclaafdestilleerd water om een ​​3,5% voorraadoplossing te maken. </li><li> Meng de agarose oplossing goed en incubeer bij 70 ° C in een waterbad om de agarose volledig op te lossen. </li><li> Afkoel de agarose-oplossing in een waterbad van 37 ° C voordat u hem aan de livebeeldvorming plaatst. </li><li> Voeg 1 ml van de agarose voorraadoplossing toe aan 5 ml van de vloeibare levende beeldvormende media om een ​​uiteindelijke concentratie (0,6%) te maken. </li><li> Bewaar de media met agarose in een waterbad van 37 ° C om te voorkomen dat het voortijdig wordt gestollificeerd. </li></ol></li></ol> 2. Bereiding van Palate Explant Cultuur voor Live Imaging <ol><li> Dissectie van recent gehandhaafde E14.5 secundaire palatale planken OPMERKING: In onze ervaring vereist beeldvormende fusie dat het begint met een licht gehandhaafde paar palatale planken; Deze aanhechting voorkomt explantieve bewegingen die voorkomen dat fusie tijdens het imaging optreedt. <ol><li> Dissect E14.5-stadium embryo&#39;s in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en kies groen fluorescerend eiwit (GFP) -expressie (vanK14-cre; ROSA26-mTmG flox ) of (Rood fluorescerend eiwit) RFP-expressie (van Lifeact-mRFPruby ) positieve embryo&#39;s met behulp van een dissectiemicroscoop uitgerust met fluorescerende lampen. Overdracht weefsel naar voorverwarmd live imaging culture media zonder agarose. </li><li> Knip het embryo hoofd en verwijder het bovenste hersengebied door gebruik te maken van twee fijne nr. 5 tang ( Figuur 1 A-C ). Gebruik een nr. 5 pincet om het embryo vast te houden terwijl de andere nr. 5 tikt om extra weefsel buiten de palatale planken af ​​te snijden. OPMERKING: Met een fijne schaar kunt u het embryo-hoofd (de eerste stap) knippen in plaats van één nr. 5 pincet. Echter, twee nr. 5 fijne tangjes geven betere controle om precieze bezuinigingen te maken. </li><li> Verwijder de mandibel zorgvuldig zonder de palatale planken te beschadigen, zoals weergegeven in Figuur 1 D en 1E . Om de kans op beschadiging van palaten te verminderen, houd de tong door dissectie van de mandibel, fVeroorzaakt door voorzichtig verwijderen van de tong. </li><li> Nadat u de mond en de tong hebt verwijderd, controleer u de mondelinge kant van het secundaire verhemelte met een stereomicroscoop met fluorescentie om een ​​sterk verslaggever in het MES te bevestigen ( Figuur 1 M ). </li><li> Dissecter de achterste delen, waaronder de achterhaar en de hersenstam, na het verwijderen van de mandibele en de tong ( Figuur 1 F ). </li><li> Verwijder beide maxillae met gehechte palatale planken ( Figuur 1 G ). </li><li> Snijd het voorste bovenkaakweefsel, zodat zowel het primaire als het secundaire verhemelte intact blijft ( Figuur 1 H en I ). </li><li> Verwijder nasale septum op de nasale kant van de explant die de MES blootstelt. OPMERKING: Deze latere stappen van dissecties hebben zorgvuldige aandacht nodig om de contacten tussen twee secundaire palatale planken niet te verstoren. Verwijdering van de nasale septum helptVerminder het achtergrondsignaal van andere gebieden en verminder ook de verticale weefselbeweging, waardoor stabiele beeldvorming mogelijk is ( Figuur 1 J-L ). </li><li> Nadat u de palatale planken heeft opgesplitst, moet u het middelste reporterssignaal opnieuw onderzoeken om er zeker van te zijn dat de epitheliale laag tussen de weefsels niet wordt beschadigd. </li></ol></li><li> Palexplanten opstellen in cultuurschotel met live imaging media <ol><li> Leg live imaging media in 35 mm glasbodemschotel. </li><li> Zet dissected palatal planken mondelinge kant naar beneden gericht zo dicht bij de glazen bodem mogelijk voor imaging met een omgekeerde confocale microscoop ( Figuur 1 N ). </li><li> Plaats droogijspellets op een geleidend oppervlak in de buurt van de kweekschotel om agaroseversterking te versnellen door snel de temperatuur te verlagen of de kweekschotel bij 4 ° C te zetten. Een koude plaat, zoals die gebruikt kan worden voor de inbouw van paraffine, zou ook bij deze s kunnen worden gebruikttage. OPMERKING: Wanneer droogijs wordt gebruikt, moet de agarose-mediaverandering zorgvuldig worden gecontroleerd om het bevriezen van media te voorkomen. </li></ol></li></ol> 3. Confocal Time-lapse Imaging of Palate Explant <ol><li> Imaging en Data acquisitie <ol><li> Nadat de agarose halfgestolideerd was, monteer de kweekschotel in een omgekeerde confocale microscoop uitgerust met een incubatiekamer van 37 ° C. Gebruik een confocal microscoop van witte licht en de confocal microscope van de waarnemer. OPMERKING: We gebruikten een gemodificeerd medium dat 15 mM HEPES zonder CO 2 gas bevat. </li><li> Breng petroleumjelly tussen de kweekschotel en deksel met behulp van een spuit om de verdamping van de media te vermijden ( Figuur 1 N ). OPMERKING: sommige condensatie bovenop de kweekschoteldekking na een nacht (O / N) -cultuur komt voor, maar het volume van de media verandert niet, wat suggereert dat de petroleumjess voorkomt dat de media verdampen. </li><li> Zoek de regio met belangstelling met lage vergrotingsdoelstellingen (10x) en gebruik de grotere vergrotingsdoelstellingen (20x objectief met 3x digitale zoom of een 40x objectief met Immersol W) voor time-lapse live imaging. OPMERKING: Dissected secundaire palatale planken zijn niet plat. Het secundaire palet is een gebogen structuur en dit maakt het moeilijk om de gehele MES in hetzelfde vliegtuig te maken. Lage vergroting (10x) beeldvorming kan gehele beeldvorming van de galerij toelaten, maar 40x doelstellingen zorgen voor betere beeldresolutie om gedetailleerde cellulaire bewegingen in dieper Z-posities te onderzoeken. De kromming is hoog in het middenpaleisgebied. Anterior en posterior verhemelte zijn relatief vlak in vergelijking met de middelste verhemelte. We zien vaak naar het midden van de secundaire verhemelte om regio&#39;s met de grootste kromming te vermijden. </li><li> Scan meerdere Z-stacks met 5 μm elke stap gedurende 16-24 uur met behulp van een goede laser excitatie (488 nm voor GFP en 532/561 nm voor RFP) ( Figuur 2 ). OPMERKING: Gebruik de minimale laservermogen en belichtingstijd om de potentiële fototoxiciteit te verminderen. Dit is vooral belangrijk bij multicolor beeldvorming. Gebruik 22% van 552 nm laservermogen voor membraanTomato (mT), 30% van 495 nm laservermogen voor membraanGFP (mG) en 25% van 561 nm laservermogen voor membraanRFP. De gemiddelde belichtingstijd was 550 ms. </li><li> Gebruik beeldanalysesoftware om cijferopsporing en kwantitatieve analyse uit te voeren. </li></ol></li></ol> 4. Data Image Analysis OPMERKING: Hier werd Imaris gebruikt. Soortgelijke data analyses kunnen ook worden uitgevoerd met ImageJ of Volocity software pakketten. <ol><li> 3D-oppervlakken maken van beeldsequenties. OPMERKING: Dit gedeelte maakt het mogelijk om een ​​oppervlak te genereren vanuit een film die wordt gegenereerd met een membraan GFP-signaal. <ol><li> Klik op Bewerken | Toon weergave aanpassing en gebruik de schuifregelaar van het histogram om de signaalintensiteit aan te passen, zodat het membraan signaal helder isDe lengte van de film uit ( figuur 3 A ). </li><li> Correct gebleekt signaal met behulp van Image Verwerking | Verzwakking correctie . Stel de intensiteitsintensiteit voor en intensiteit terug, zodat het membraansignaal helemaal over de lengte van de film is. Er kan een fout worden gemaakt bij het instellen van deze waarden. OPMERKING: De waarde Intensity Back (Dier Z-positie) zal lager zijn dan de intensiteit van de Intensity Front (Oppervlak Z-positie) door beperkte laserpenetratie. Deze waarden kunnen daarom ook worden veranderd om de signaalintensiteit in de Z-serie te normaliseren. Beide waarden kunnen worden aangepast om bleekcorrectie te bereiken. De verzwakkingscorrectie wordt ook genoemd Emissiereductiecorrectie 19 . </li><li> Om een ​​oppervlak van het membraansignaal te genereren, selecteer Surpass | Oppervlakken , kies een bronkanaal en Drempeltype (Absolute Intensiteit) en onder de Algoritme InstellingenlECT Segment alleen een regio van belang En proces van volledige afbeelding eindelijk , gevolgd door te klikken op de voorwaartse pijl; Blijf de pijl naar voren bewegen (gebruik standaardinstellingen, of specificeer Oppervlakgebied Detail Niveaus en Drempelmethode door trial and error), controleer of het gegenereerde oppervlak het fluorescentiesignaal weerspiegelt. Om een ​​regio van belang te specificeren, selecteer regio en tijd (en) die worden weergegeven door X, Y, Z posities te bezuinigen. OPMERKING: Selecteer Proces van volledig beeld uiteindelijk, zodat aanpassingen en drempels over de gehele film worden toegepast. </li><li> Genereer een oppervlak door opnieuw op de pijl naar voren te klikken. Zet dan de drempel aan door het histogram in Filters te wijzigen om te corresponderen met het membraansignaal. </li><li> Nadat het oppervlak is gegenereerd, kies het oppervlak in Oppervlakken / Instellingen om het oppervlaksignaal te visualiseren en het oppervlakgeneratieproces te beëindigen door de dubbele voorwaartse druk te drukkenArd pijlknop ( Figuur 3 B ). </li><li> Ga naar Oppervlakte | Bewerk en klik op Masker alles in de Mask eigenschappen om een ​​gemaskerde kanaal afbeelding te genereren. </li><li> Nadat u op OK hebt geklikt, wordt het venster Mask Channel automatisch geopend; Selecteer het GFP-kanaal, stel voxels buiten het oppervlak in op de maximale signaalintensiteitswaarde (gevonden in Edit | Display aanpassing ) en voxels in het oppervlak tot de minimale GFP-intensiteitswaarde (ook gevonden in Bewerken | Display aanpassing ), in Maskerinstellingen om een ​​masker van het membraan signaal te genereren. </li><li> Als het masker van het membraan signaal zal worden getoond in Volume uitzicht, het genereren van beelden omgekeerd met behulp van Image Processing | Contrast Change | Omkeren ( Figuur 3C ). </li></ol></li><li> Het detecteren van vlekken van omgekeerde oppervlakbeelden. OPMERKING: In deze sectie kan het midden van elke cel wordenGemarkeerd met een unieke plek en opgespoord over ruimte en tijd. <ol><li> Selecteer Scène overschrijven | Spots | Creëren ; In algoritminstellingen selecteer Segment alleen een regio van belang , het proces van het volledige beeld eindelijk en track spots (over tijd) . </li><li> Klik op de voorpijl en geef een regio van belangstelling op; Selecteer de regio en tijd (en) om plekken te volgen; Blijf door de voorpijl door te drukken, kies het gemaskeerde kanaal als bronkanaal en bepaal de geschatte XY-diameter van de plekken. </li><li> Als u op de pijl naar voren klikt, wordt automatisch een filtervenster geopend; Pas de spotdetectiedrempel aan door de waarden in het histogram te veranderen om enkele vlekken in het midden van elke cel te genereren ( Figuur 3 D ). </li><li> Als u opnieuw klikt op de pijl naar voren, wordt het venster Algoritme geopend. Kies Autoregressief bewegingsmodel 20 en geef de maximale tracking diHouding en maximale kloofgrootte om tracks die voor een korte periode discontinu zijn, te verbinden. </li><li> Als u op de knop voorwaarts pijltje klikt, verschijnt het venster Filters, stelt u de drempel voor de duur van de track vast door het histogram aan te passen, zodat elke cel wordt gevolgd. Door op de dubbele voorwaartse pijlknop te drukken, wordt de spotdetectie voltooid. </li><li> Om de weefselafwijking te corrigeren klikt u op Spots | Track Editor en selecteer Correct Drift . Een algoritm venster wordt automatisch geopend; Selecteer de optie Translational drift, Include hele resultaat en Correct objectenposities . </li></ol></li><li> Genereer voordelen voor kwantitatieve analyse. OPMERKING: De scatterplot van het programma is een tool om multidimensionale grafieken (X, Y, Z, Kleur en Schaal) met meerdere objecten te genereren. Deze plots zijn nuttig om de trends van veel celbewegingen in de loop der tijd te bekijken. <ol><li> Maak 2D- of 3D-plottingen van celvolgdata met behulp van deVantage-Add New Vantage plot menu ( Afbeelding 3 E en 3F ). </li><li> Selecteer Volume of Spots en kies Create / Category en Plot Type </li><li> Stel plotwaarden aan om verschillende Vantage-grafieken te genereren. </li><li> Grafieken exporteren met de Snapshot- functie. OPMERKING: Statistische gegevens kunnen ook worden geëxporteerd als een spreadsheet voor verdere kwantitatieve analyse door op Plot Numbers Area te klikken | Opslaan . </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ray, H. J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+tissue+fusion+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Camb.+Engl%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of tissue fusion during development.</a> Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).</li>
<li>Dudas, M., Li, W. -Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palatal+fusion+-+where+do+the+midline+cells+go%3F+A+review+on+cleft+palate%2C+a+major+human+birth+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect.</a> Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).</li>
<li>Bush, J. O., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palatogenesis%3A+morphogenetic+and+molecular+mechanisms+of+secondary+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development.</a> Development. 139, 231-243 (2012).</li>
<li>Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+Molecular+Mechanisms+of+Palatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).</li>
<li>Taya, Y., O'Kane, S., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10433915">Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice.</a> Development. 126, 3869-3879 (1999).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+and+Extrusion+Are+Required+for+Normal+Fusion+of+the+Mammalian+Secondary+Palate%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate.</a> PLOS Biol. 13, 100122(2015).</li>
<li>Yoshida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periderm+cells+covering+palatal+shelves+have+tight+junctions+and+their+desquamation+reduces+the+polarity+of+palatal+shelf+epithelial+cells+in+palatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis.</a> Genes Cells. 17, 455-472 (2012).</li>
<li>Fitchett, J., Hay, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medial+edge+epithelium+transforms+to+mesenchyme+after+embryonic+palatal+shelves+fuse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse.</a> Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).</li>
<li>Akira, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+TGF-beta3+for+epithelial-mesenchyme+transdifferentiated+MEE+in+palatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Hist%22%5BJournal%5D)">The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis.</a> J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).</li>
<li>Sani, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate-mapping+of+the+epithelial+seam+during+palatal+fusion+rules+out+epithelial-mesenchymal+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation.</a> Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).</li>
<li>Jin, J. -Z., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+migration%2C+transdifferentiation+and+apoptosis+during+mouse+secondary+palate+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion.</a> Development. 133, 3341-3347 (2006).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+autonomous+requirement+for+Tgfbr2+in+the+disappearance+of+medial+edge+epithelium+during+palatal+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion.</a> Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).</li>
<li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://dev.biologists.org/content/develop/114/2/379.full.pdf">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy.</a> Development. 114, 379-388 (1992).</li>
<li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
<li>Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+regulates+growth+and+morphogenesis+of+the+tooth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth.</a> Development. 127, 4775-4785 (2000).</li>
<li>Eisenhoffer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crowding+induces+live+cell+extrusion+to+maintain+homeostatic+cell+numbers+in+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia.</a> Nature. 484, 501-546 (2012).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nat Methods. 7, 168-169 (2010).</li>
<li>Can, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+correction+in+confocal+laser+microscopes%3A+a+novel+two-view+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach.</a> J Microsc. 211, (2003).</li>
<li>Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/899946/">Resolving motion correspondence for densely moving points.</a> IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).</li>
<li>Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+cell+dynamics+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy.</a> Development. 141, 4406-4414 (2014).</li>
<li>Stoller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+reporter+mouse+expressing+a+nuclear+localized+fusion+of+GFP+and+beta-galactosidase+reveals+new+derivatives+of+Pax3-expressing+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors.</a> Genesis. 46, 200-204 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Live beeldvorming van weefselmorfogenese met 3D-organische explantatiecultuur kan gedetailleerde informatie verschaffen over cellulaire processen die niet kunnen worden aangetoond in conventionele kleuranalyse van vaste weefselsecties. Met behulp van in vitro explant cultuur van muis embryonale secundaire verhemelte, we observeren verschillende interessante cellulaire gedragingen die ons leiden tot een nieuw mechanisme van verhemelte fusie die epitheliale convergentie en cel extrusie omvat. <p class="jove_c...

Weefselfusie is een belangrijke stap in de ontwikkeling van meerdere organen. Grote menselijke geboorteafwijkingen zoals gespleten lip en verhemelte, spina bifida en misvormingen van het hart kunnen het gevolg zijn van gebreken in weefselfusie 1 . Muis secundaire palet fusie is uitgebreid bestudeerd om de cellulaire en moleculaire mechanismen die weefselfusie in ontwikkeling 2 , 3 , 4 bepalen, te identificeren. In de muis begint secundaire paletontwikkeling bij ongeveer E11.5 met de uitgroei van een secundaire palatale plank uit elk van de bilaterale maxillaire processen. De initiële groei van de palatale planken vindt verticaal langs de tong plaats, tot ongeveer E14.0, op dat moment worden de palatale planken horizontaal boven de tong verhoogd. Mediaal gerichte groei resulteert in fysiek contact tussen de toepassende epithelia van de twee palatale planken, waardoor de middelste epithelie vormtAl Seam (MES) op E14.5. De tussenliggende MES moet verwijderd worden tussen de secundaire palatale planken om mesenchymale samenvloeiing mogelijk te maken en de ontwikkeling van een intact, volledig gesmolten secundair verhemelte door E15.5 3 te ontwikkelen . Hoe is een gedeelde epitheliale MES cellaag gevormd tussen twee afzonderlijke palatale planken, en vervolgens verwijderd om mesenchymale samenvloeiing te bereiken, is een centrale vraag in de ontwikkeling van de verhemelte. Gebaseerd op histologische en elektronenmicroscopie (EM) studies, explorante cultuurstudies en functionele muisgenetische experimenten, zijn er in dit proces verschillende fundamentele celgedragen betrokken. Filopodia-achtige projecties van het mediale randepitheel MEE van elke palatale plank vergemakkelijkt het eerste contact 5 , 6 , gevolgd door intercalatie van deze epitheliale cellen naar een gedeelde single MES 6 , 7 . Verwijdering van de resulterende gedeelde MESIs voorgesteld om door drie niet-exclusieve mechanismen te gaan. Vroege studies waarbij histologische observaties en ex vivo lijnsporen met vitale kleurstoffen werden gebruikt, wijzen erop dat het MES kan worden verwijderd door epitheliale tot mesenchymale overgang (EMT) van MES-cellen 8 , 9 , alhoewel recentere genetische afstamming van epitheliale cellen onzekerheid heeft opgedaan met betrekking tot De langetermijnbijdrage van epitheelcellen aan de palatale plank mesenchymme 10 , 11 , 12 . Significante aantallen apoptotische cellen, en een vermindering van hun aantal in sommige mutanten die geen goede palatefusie ondergaan, heeft geleid tot het idee dat apoptose een belangrijke aandrijving van MES-oplossing 2 , 3 kan zijn . Ten slotte, oorspronkelijk gebaseerd op studies met epitheliale etikettering en statische observatie bij progressieve tijdpunten, MES-cellenWerden voorgesteld om te migreren in de oronasale en anteroposterior afmetingen 11 , 13 , maar dergelijke dynamische celgedragen waren aanvankelijk onbevestigd doordat ze niet in staat waren om ze in levend palatale weefsel te observeren. Onlangs waren we in staat om deze gedragingen direct te observeren door een nieuwe live imaging methodologie te ontwikkelen die muisgenetische methoden van fluorescerende etikettering combineert met confocale livebeelden van explanted palatale planken. Ten eerste, voor het visualiseren van dynamisch cellulair gedrag in gomepitheelcellen tijdens de gomfusie , genereren we een epitheliale-specifieke reportermuis door ROSA26-mTmG floxmuizen met Keratin14-cre muizen 14 , 15 te oversteken. Confocale levende beeldvorming van de verhemelte-explorante cultuur van de resulterende embryo&#39;s bevestigde een aantal eerder voorgestelde cellulaire gedragingen en geïdentificeerde nieuwe gebeurtenissen in het fusieproces 6 </sup&gt;. Epitheliale celmembraan uitsteeksels voorafgegaan aan initieel cel-celcontact gevolgd door epitheelconvergentie door celintercalatie en oronasale celverplaatsing. In het bijzonder ontdekten we dat cel extrusie, een proces dat belangrijke rollen speelde in epitheliale homeostase, een belangrijk mechanisme was om muis secundaire paletfusie 6 , 16 te beheren. Deze beeldvormingsmethode kan gebruikt worden bij andere reporterlijnen; We hebben Lifeact-mRFPruby transgene muizen 17 , 18 gebruikt om actin cytoskeletale dynamiek te onderzoeken tijdens het fusieproces. Andere verslaggevers kunnen ook worden gebruikt om andere specifieke aspecten van verhemeltefusie te observeren en deze methode kan worden aangepast aan laserscanning-confocal microscopie of draaibare confocal microscopie, afhankelijk van beeldbehoeften en beschikbaarheid van microscoop. Live imaging wordt steeds meer een keystone-aanpak in ontwikkelingsbiologie. PartiCulariofaciale morfogenese is complex en menselijke geboorteafwijkingen die het gezicht beïnvloeden zijn gebruikelijk. Deze confocal live imaging methode zal bijdragen tot een beter inzicht in onderliggende basisontwikkelingsmechanismen, alsmede de oorsprong van menselijke craniofaciale afwijkingen.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life technology</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life technology</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Life technology</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic acid</td><td>Sigma</td><td>A4544-100G</td><td></td></tr><tr><td>Pennicillin/Streptomycin</td><td>Life technology</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Low melting agarose</td><td>BioExpress</td><td>E-3111-125</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass bottom dish</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Petrolieum Jelly (Vaseline)</td><td>Sigma</td><td>16415-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>Mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratin14-cre</td><td></td><td>MGI: J:65294</td><td>Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc</td></tr><tr><td>ROSA26mTmG</td><td></td><td>MGI: J:124702</td><td>Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo</td></tr><tr><td>Lifeact-mRFPruby</td><td></td><td>MGI: J:164274</td><td>Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows</td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>White Light SP5 confocal microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Observer spinning disk confocal microscope</td><td>Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of mouse secondary palate fusion

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

De fusie van de secundaire palatale planken om het intacte secundaire verhemelte te vormen is een belangrijk proces bij zoogdierenontwikkeling en de verstoring ervan kan leiden tot gespleten secundair verhemelte, een gemeenschappelijke aangeboren afwijking bij mensen. Secundaire smaakfusie is uitgebreid bestudeerd, wat leidt tot verschillende voorgestelde cellulaire mechanismen die dit proces kunnen bemiddelen. Deze studies zijn echter meestal uitgevoerd op vaste embryonale weefsels bij progressieve tijdstippen tijdens de ontwikkeling of in vaste explantieve culturen die zijn geanalyseerd op statische tijdstippen. Statische analyse is beperkt voor de analyse van dynamische morfogenetische processen, zoals een gomfusie en welke soorten dynamische cellulaire gedragingen palatal fusie bemiddelen is onvolledig begrepen. Hier beschrijven we een protocol voor livebeelden van ex vivo secundaire paletfusie in muisembryo&#39;s. Voor het onderzoeken van cellulaire gedragingen van verhemeltefusie werd epitheliale-specifieke Keratin14- cre gebruikt om palaatepitheliale cellen in ROS te labelenA26-mTmG flox reporter embryo&#39;s. Voor het visualiseren van filamenteactine werden Lifeact-mRFPruby- reportermuizen gebruikt. Live beeldvorming van secundaire verhemelingsfusie werd uitgevoerd door dissecteren van recent gehandhaafde secundaire palatale planken van embryonale dag (E) 14.5 stadium embryo&#39;s en culturen in agarose bevattende media op een glasbodemschotel om beeldvorming met een omgekeerde confocale microscoop mogelijk te maken. Met behulp van deze methode hebben we een verscheidenheid aan nieuwe cellulaire gedragingen ontdekt tijdens secundaire paletfusie. Een waardering voor het onderscheidend gedrag van de cellen in ruimte en tijd draagt ​​bij aan ons inzicht in dit dynamische morfogenetische proces. Dit protocol kan worden toegepast op mutante muislijnen, of culturen die worden behandeld met farmacologische remmers om verder te begrijpen hoe secundaire paletfusie gecontroleerd wordt.

Live imaging of palate explant cultuur onthulde meerdere cellulaire processen mediating palate fusion 6 . Initiële contacten tussen twee epitheelcellen worden gemaakt door membraanuitsteeksels ( Figuur 2 B-2E ). Wanneer twee epitheliale lagen elkaar ontmoeten vormen ze een multi-cel gelaagde MES, gevolgd door intercalatie om een ​​geïntegreerde enkele cellaag MES te vormen door epitheliale convergentie ( <strong class...

Hier presenteren we een protocol voor live imaging van muis secundaire paletfusie met behulp van confocale microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt in combinatie met een verscheidenheid aan fluorescerende reporter muis lijnen, en met pathway inhibitors voor mechanistisch inzicht. Dit protocol kan aangepast worden voor livebeelden in andere ontwikkelingssystemen.

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Het algemene doel van deze confocale live-imagingmethode is om de cellulaire processen direct te observeren tijdens de versmelting van het secundaire palatum tijdens de craniofaciale ontwikkeling. Begin met het scheiden van de kop van het lichaam van het embryo onder een dissectiemicroscoop in een petrischaal met vers PBS op kamertemperatuur. Pak de kop vast met één paar fijne pincetten nummer vijf en gebruik een tweede paar pincetten om het bovenste deel van de hersenen te verwijderen, waarbij eventueel extra weefsel buiten de palatale platen met een tweede paar pincetten wordt weggesneden.Verwijder de onderkaak voorzichtig zonder de palatinale platen te beschadigen. Wanneer de onderkaak is losgemaakt, verwijdert u voorzichtig de tong en bevestigt u de aanwezigheid van een robuust reportersignaal in de epitheliale naad van de middellijn. Het is belangrijk om deze tijdens de dissectie niet te beschadigen om de epitheliale naad van de middellijn intact te houden.Verwijder vervolgens de rhombencefalon, de hersenstam en beide maxillae met de vastgehechte palatinale platen. Snijd het weefsel van de bovenkaak aan de voorzijde door, waarbij zowel het primaire als het secundaire palatum intact blijven. Verwijder het neustussenschot aan de nasale zijde van het explantaat om de epitheliale naad in de middellijn bloot te leggen en bevestig dat de epitheellaag tussen het weefsel intact is.Voeg nu live-imagingmedium toe aan een glazen schaaltje van 35 millimeter en plaats de gedissecteerde palatumplaten met de orale zijde naar beneden in het schaaltje, zo dicht mogelijk bij de glazen bodem. Plaats vervolgens pellets droogijs op een geleidend oppervlak nabij het kweekschaaltje om de stolling van de agarose in het imagingmedium te versnellen. Wanneer de agarose halfvast is, wordt het kweekschaaltje geplaatst in een omgekeerde confocale microscoop die is uitgerust met een incubatiekamer van 37 degree celsius, en wordt er met een spuit vaseline aangebracht tussen het kweekschaaltje en de kweekafdekking om verdamping van het imagingmedium te voorkomen.Selecteer een objectief met lage vergroting om het gebied van interesse te lokaliseren. Selecteer vervolgens een objectief met hoge vergroting en scan meerdere z-stacks met stappen van vijf micron gedurende 16 tot 24 uur, met gebruik van de juiste laser-excitatie. Live imaging van een palate-explantaatcultuur onthult meerdere cellulaire processen die de palatumfusie mediëren, waarbij de eerste contacten tussen de twee epitheelcellen worden gelegd door membraanuitstulpingen.Wanneer de twee epitheellaagen elkaar ontmoeten, vormen zij een meerlaagse midline epitheliale naad, gevolgd door intercalatie om via epitheliale convergentie een geïntegreerde enkellaag, de midline epitheliale naad, te genereren. De epitheelcellen in diepere z-niveaus worden ook geleidelijk verplaatst naar de orale zijde van de midline epitheliale naad, wat bijdraagt aan het proces van epitheliale convergentie. Posterieur gerichte celmigratie wordt waargenomen in de midline epitheliale naad van het middenpalatum.Er werden epitheliale cel-extrusiegebeurtenissen waargenomen tijdens de palatumfusie, wat suggereert dat de epitheelcellen in de mediane epitheliale naad door dit actieve proces kunnen worden verwijderd. Deze geïntegreerde epitheliale naad zal uiteindelijk afbreken om confluentie te bereiken. Verder raakt filamenteus actine verrijkt op de grens tussen de epitheliale en mesenchymale gebieden, waardoor een kabelachtige structuur langs de anterieur-posterieure as wordt gevormd.Software kan worden gebruikt om specifieke cellulaire gedragingen van belang te volgen tijdens de palatumfusie, waarbij de beste methode voor celtracking afhangt van het in het experiment gebruikte reportersignaal.

live-imaging-of-mouse-secondary-palate-fusion

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een methode om celfusie track in levende organismen na verloop van tijd wordt beschreven. De aanpak maakt gebruik van...

Een Cre-Lox P Recombinatie Aanpak voor de detectie van celfusie In Vivo</em

Source: Pietruczyk, E. A., et al. Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the implantation of a spinal cord window in an anesthetized mouse for in vivo imaging. The protocol stabilizes the exposed spinal cord using a borosilicate cover glass and a 3D-printed backplate. This method enables high-resolution two-photon microscopy to study blood-brain barrier dynamics and neurovascular interactions.

Spinal Cord Window Implantation in a Mouse for In Vivo Imaging

Progenitorceltransplanten mitose is een kritische parameter van neurogenese. Veel van onze kennis van neurale voorlopercellen mitose is gebaseerd op de analyse van vaste weefsel. Live-beeldvorming in de embryonale hersenen plakjes is een veelzijdige techniek om mitose te beoordelen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in een gecontroleerde omgeving.

Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

Studies van gehemelte ontwikkeling worden gemotiveerd door de incidentie van gespleten gehemelte, een aangeboren afwijking die een enorme gezondheid last oplegt en kunnen verlaten blijvende verminking. We tonen hier een techniek om cultuur palatini die kunnen worden gebruikt om verschillende signaalwegen betrokken bij palatinale ontwikkeling en fusie bestuderen.

Wijze van Studeren Palatal Fusion met statische Organ Cultuur

Dit protocol beschrijft de detectie van CCL5-gemedieerde periostale skeletstamcelmigratie in realtime met behulp van levende intravitale microscopie van dieren.

Real-time beeldvorming van CCL5-geïnduceerde migratie van periosteale skeletstamcellen bij muizen

We presenteren een protocol voor isolatie en kweek van primaire muisembryogene palatale mesenchymale cellen voor time-lapse beeldvorming van tweedimensionale (2D) groei- en wondhersteltests. We bieden ook de methodologie voor de analyse van de time-lapse beeldvormingsgegevens om de vorming van celstromen en directionele beweeglijkheid te bepalen.

Isolatie en time-lapse beeldvorming van primaire muisembryo's van palatale mesenchymcellen om collectieve bewegingskenmerken te analyseren

Dit protocol beschrijft een nieuw mammabeeldvormingsvenster met een vervangbaar deksel (R.MIW). Intravitale microscopie na implantatie van de R.MIW maakt longitudinale en meerdaagse beeldvorming van de gezonde en zieke borstklier mogelijk met een cellulaire resolutie tijdens de verschillende ontwikkelingsstadia.

Longitudinale intravitale microscopie met behulp van een mammabeeldvormingsvenster met vervangbaar deksel

Dit artikel schetst een stapsgewijze procedure voor het opstellen van een muizenmodel met een oronasale fistel. De oronasale fistel werd gecreëerd door gebruik te maken van verwarmde oftalmologische cauterisatie om het middellijngedeelte van het harde gehemelte te beschadigen, wat resulteerde in de vorming van een opening tussen de mond- en neusholte.

Opstelling van een oronasale fistelmuizen

Immunofluorescerende beeldvorming wordt beperkt door het vermogen om complexe, tijdsafhankelijke biologische processen in slechts één momentopname in de tijd waar te nemen. Deze studie schetst een live-imaging-benadering die wordt uitgevoerd op nauwkeurig gesneden plakjes submandibulaire klier van muizen. Deze aanpak maakt de real-time observatie mogelijk van cel-cel interacties tijdens homeostase en de processen van regeneratie en herstel.

Ondervraging van cel-celinteracties in de speekselklier via ex vivo beeldvorming van levende cellen

Ex vivo live beeldvorming is een krachtige techniek voor het bestuderen van de dynamische processen van cellulaire bewegingen en interacties in levende weefsels. Hier presenteren we een protocol dat twee-fotonmicroscopie implementeert om tandepitheelcellen live te volgen in gekweekte snijtanden van hele volwassen muizen.

Ex vivo live beeldvorming gebruiken om celdelingen en bewegingen tijdens tandvernieuwing bij muizen te onderzoeken

De vertaling van de bevindingen van intravitale microscopie wordt uitgedaagd door de geringe dieptepenetratie in het weefsel. Hier beschrijven we een muismodel met dorsale vensterkamer dat co-registratie van intravitale microscopie en klinisch toepasbare beeldvormingsmodaliteiten (bijv. CT, MRI) mogelijk maakt voor directe ruimtelijke correlatie, waardoor de klinische vertaling van intravitale microscopiebevindingen mogelijk wordt gestroomlijnd.

Een dorsaal huidplooi raamkamer tumor muismodel voor gecombineerde intravitale microscopie en magnetische resonantie beeldvorming in translationeel kankeronderzoek

Leer live imaging van secundaire verhemeltefusie bij muizenembryo's met confocale microscopie. Deze methode maakt directe observatie van celprocessen tijdens craniale ontwikkeling mogelijk voor onderzoekers.

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Meer video's verkennen