DNA Nanotubes als een veelzijdig instrument om te studeren van Semiflexible polymeren
25 oktober 2017
Semiflexible polymeren weer unieke mechanische eigenschappen die uitgebreid door levende systemen worden toegepast. Systematische studies over biopolymeren zijn echter beperkt omdat eigenschappen zoals polymeer rigiditeit niet toegankelijk zijn. Dit manuscript wordt beschreven hoe is deze beperking omzeild door programmeerbare DNA nanobuisjes, waardoor experimentele studies over de gevolgen van de stijfheid van de gloeidraad.
Het algemene doel van dit nieuwe op DNA gebaseerde modelsysteem is om de fundamentele eigenschappen van een klasse semiflexibele polymeren te begrijpen, die ook het gedrag van een vitale klasse biopolymeren beschrijft. Deze nieuwe methode stelt ons in staat om belangrijke vragen op het gebied van zachte metafysica te bestuderen, specifiek om het gedrag van semiflexibele filamenten en hun arrangementen in netwerken te verkennen. Het grote voordeel van deze techniek is dat de mechanische eigenschappen van intravisieve filamenten experimenteel toegankelijk zijn en nauwkeurig kunnen worden afgesteld.
Semiflexibele polymeren worden gedefinieerd door de speciale eigenschappen van de filamenten die voorheen alleen in het theoretische kader werden behandeld vanwege het ontbreken van een instelbaar experimenteel systeem. Hoewel deze methode inzicht biedt in de definiërende hoeveelheid van semiflexibele polymeren, kan deze ook worden toegepast als een nieuwe hydrogel om celmigratie in matrices met verschillende stijfheden te bestuderen zonder de onderliggende maaswijdte te veranderen. De kleinste herhalende eenheid in de nanobuis kan worden gezien als een eenheidsring.
Verschillende van deze eenheidsringen stapelen zich tijdens hybridisatie. Dit leidt tot de vorming van langwerpige nanobuizen. Om te beginnen, suspendeer gelyofiliseerd oligonucleotiden opnieuw in gezuiverd water en volg de verdere hersuspenderingsstappen die in de bijbehorende handleiding van het bedrijf worden gegeven.
Pas de hoeveelheid water aan om een eindconcentratie van 200 micromolar te verkrijgen. Bepaal de concentraties van de enkele DNA-strengen om de door de distributeur gegeven waarden te verifiëren, aangezien de exacte stoichiometrie cruciaal is voor het assemblageproces. Gebruik een micropipet om de DNA-strengen, elk van dezelfde concentratie, in een container geschikt voor de thermocycler te mengen om de gewenste DNA- en helixbuizen te vormen.
Hybridiseer de DNA- en helixbuizen in een thermocycler met behulp van de in het tekstprotocol gevonden parameters. Bewaar de gehybridiseerde DNA- en helixbuizen maximaal 3 weken bij 4 graden Celsius zonder detectabele degradatie. Voordat u reologie uitvoert, verdunt u het monster zorgvuldig tot de gewenste eindconcentratie met behulp van de monsterstofbuffer indien nodig.
Kies een geschikte geometrie voor de dynamische schuinvloeikundige. Laad vervolgens het monster op de rheometer. Om mogelijke verdampingseffecten te voorkomen, passiveer de luchtvochtgrens van het monster en de omgeving door 1 van de 3 technieken.
Omring het monster met 2,5 milliliter van de monsterstofbuffer. Of voeg een oppervlakteactieve stof toe net onder de micelconcentratie in het monster. Of gebruik de hamilton-spuit om het monster met lipiden te omringen om direct contact van het monster met lucht te voorkomen.
Versluit de monsterkamer met een dop voorzien van natte sponzen. En gebruik indien mogelijk een extra waterbad om verdamping verder te onderdrukken. Start de meting met behulp van de rheometerspecifieke software bij kamertemperatuur en laat het monster 2 uur bij kamertemperatuur gelijkmaken.
De gelijkmakingstijd is cruciaal om het thermoflect-systeem een volledige isotrope gerandomiseerde toestand te laten bereiken, omdat dit de enige bevestiging is die vergelijking tussen de verschillende metingen mogelijk maakt. Na meting, verwerk de gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid 8 aliquots van 12 microliter voor elk monster voor met behulp van 1 tot 4 micromolar DNA per streng, 12,5 millimolair magnesiumchloride en 1x nucleïnezuurgelkleurmiddel.
Maak ook een negatieve controle zonder DNA, maar inclusief het nucleïnezuurgelkleurmiddel. Breng de aliquots over naar een realtime PCR-plaat en verzegel met kleeffolie. Centrifugeer de plaat 100 keer G gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur om de gasbellen te verwijderen.
Het is van cruciaal belang om de gasbellen te verwijderen, omdat deze zich tijdens metingen kunnen uitzetten en de monsters niet kunnen worden geanalyseerd. Na centrifugatie, laad de verzegelde plaat in een realtime kwantitatief PCR-systeem. Programmeer een annealingprogramma om het DNA te denatureren bij negentig graden Celsius gedurende 10 minuten en laat de temperatuur snel dalen tot zeventig graden Celsius.
Vervolgens moet de temperatuur langzaam dalen met 0,5 graden Celsius elke dertig minuten. Nadat het signaal is vervaagd, versnelt u de temperatuurstijging. Zorg ervoor dat de deksel van de cycler opwarmt tot minimaal honderd graden Celsius om de condensatie van verdampt monster op de kleeffolie te voorkomen.
Tijdens de assemblage, exciteer de monsters met een argonionlaser op vierhonderdachtenveertig nanometer en detecteer de fluorescentie op vijfhonderdvijftig nanometer bij gebruik van een CY3-kleurmiddel. Kies voor andere kleurmiddelen een geschikte excitatie-emissiecombinatie. Meet het fluorescentiesignaal zo vaak mogelijk om de algehele signaalkwaliteit te verhogen met behulp van de ingebouwde camera.
Vertegenwoordigde ruwe gegevens van een reologische meting worden getoond en onthullen de elasticiteit van het netwerk. Hier is de tijdssweep tijdens de gelijkmakingstijd weergegeven. Deze grafiek toont het spanningsafhankelijke gedrag van het netwerk.
In deze grafiek is het frequentieafhankelijke gedrag van het netwerk duidelijk. Op dit punt worden de waarden bij een specifieke frequentie gekozen. De waarden voor de specifieke DNA-helixbuispopulatie werden uitgezet tegen de concentratie.
Dit proces werd herhaald voor alle DNA- en helixbuizen. De helling werd vervolgens geëxtraheerd in een log-logge plot, waardoor de exponent van de machtswet werd verkregen. Ten slotte werden de waarden opnieuw uitgezet tegen de aanhoudende lengte voor elke gemeten concentratie.
Deze grafieken maken de extractie van de schaling van de elastische plateaumodulus ten opzichte van de concentratie en persistentielengte mogelijk. Na ontwikkeling, heeft deze techniek de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van zachte materie en polymeerfysica om het effect van de stijfheid van filamenten voor de klasse semiflexibele polymeren te verkennen. Volgens deze procedure kunnen aanvullende effecten zoals de recitatie van de verstrengelde netwerken, kruisende netwerken in het algemeen en structuurvormingsproces worden aangepakt.
Na het bekijken van deze video zou u een go
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie introduceert een op DNA gebaseerd modelsysteem om semiflexibele polymeren te onderzoeken, die essentieel zijn voor het begrijpen van het gedrag van biopolymeren. De methode biedt experimentele toegang tot de mechanische eigenschappen van deze polymeren, waardoor inzicht wordt verkregen in hun stijfheid en netwerkstructuren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Biopolymeren
- Zachte materie fysica
- Mechanische eigenschappen van polymeren
Achtergrond
- Semi-flexibele polymeren hebben unieke mechanische eigenschappen.
- Eerdere studies naar deze polymeren waren grotendeels theoretisch.
- Inzicht in hun stijfheid is essentieel voor diverse biologische toepassingen.
- Programmeerbare DNA-nanobuizen bieden een nieuwe experimentele benadering.
Doel van de studie
- Om het gedrag van semiflexibele filamenten te verkennen.
- Om hun organisatie in netwerken te onderzoeken.
- Om een instelbaar experimenteel systeem te bieden voor het bestuderen van mechanische eigenschappen.
Gebruikte methoden
- Ontwikkeling van programmeerbare DNA-nanobuizen.
- Experimentele afstemming van de stijfheid van filamenten.
- Toepassing van het systeem voor het bestuderen van celmigratie in hydrogels.
- Analyse van mechanische eigenschappen in relatie tot netwerkvorming.
Belangrijkste resultaten
- De DNA-nanobuizen maken een nauwkeurige controle over de stijfheid van de filamenten mogelijk.
- Er is inzicht verkregen in de mechanische eigenschappen van semiflexibele polymeren.
- De methode kan worden toegepast om celgedrag in matrices met variërende stijfheid te bestuderen.
- Experimentele resultaten ondersteunen theoretische voorspellingen over het gedrag van polymeren.
Conclusies
- Deze studie biedt een nieuw kader voor het begrijpen van semiflexibele polymeren.
- Programmeerbare DNA-nanobuizen zijn een waardevolle tool voor de experimentele biologie.
- Toekomstig onderzoek kan deze methode benutten voor bredere toepassingen in de biofysica.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Topprofessionals
Programmeerbare DNA-nanobuisjes bieden een instelbaar experimenteel systeem om semiflexibele polymeren te bestuderen, waarmee een belangrijke beperking bij het modelleren van de mechanica van biopolymeren wordt weggenomen. Dit maakt mechanische risicoreductie bij targetvalidatie mogelijk door de stijfheid van filamenten te koppelen aan netwerkgedrag dat relevant is voor cellulaire omgevingen. Deze aanpak ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid in preklinische modellen van interacties in de extracellulaire matrix en hydrogel-gebaseerde systemen voor geneesmiddelentoediening.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om te onderzoeken hoe de persistentielengte de filamentmechanica en netwerkvorming beïnvloedt.
- Operationele waarde: Biedt een stabiel, instelbaar systeem gedurende meerdere weken, waardoor de variabiliteit bij vroege hypothesetests wordt verminderd.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de functionele validatie van targets door semiflexibele biopolymeren zoals actine in een controleerbaar formaat te modelleren.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare rheologische resultaten (elastische plateau-modulus) die gecorreleerd zijn met de persistentielengte en de concentratie.
- Operationele waarde: Maakt gestandaardiseerde preparatie van filamenten met een lengte in micrometers mogelijk met reproduceerbare polymerisatiekinetiek.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de ontwikkeling van assays voor het screenen van verbindingen die de mechanica van semiflexibele polymeernetwerken beïnvloeden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Modelleert de mechanica van de extracellulaire matrix om celmigratie te bestuderen in hydrogels met instelbare stijfheid zonder de maaswijdte te veranderen.
- Operationele waarde: Maakt langdurige bewaring mogelijk (tot 3 weken bij 4°C) zonder degradatie, wat meerdaagse preklinische assays ondersteunt.
- Wetenschappelijke waarde: Slaat een brug tussen metingen van de persistentielengte van enkelvoudige moleculen en de mechanica van het bulknetwerk voor translationele continuïteit.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot preklinische evaluatie door een instelbaar platform te bieden om te beoordelen hoe filamentstijfheid biologische resultaten beïnvloedt in matrix-afhankelijke assays.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing over het gedrag van semiflexibele polymeren door middel van nauwkeurige experimentele afstelling van de stijfheid.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare rheologische resultaten die betrouwbare compound-screening in hydrogelmatrices mogelijk maken.
- Analytica: Levert machtswet-exponenten en schalingsrelaties tussen de elastische modulus, concentratie en persistentielengte voor datagestuurde vergelijkingen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt stijfheid op moleculaire schaal met mechanica op netwerkniveau die relevant zijn voor weefselengineering en studies naar celmigratie.
- Herbruikbaarheid in de praktijk: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van de mechanica van semiflexibele polymeren in meerdere projecten binnen de biofysica en biomaterialen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar semiflexibele polymeren door het leveren van een instelbaar, stabiel modelsysteem.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde protocollen voor hybridisatie, verdunning en rheometrie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen bij het ontwerp van biomaterialen door netwerkmechanica te voorspellen op basis van moleculaire ontwerpparameters.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde verdere ontwikkeling van hydrogelformuleringen mogelijk op basis van gevalideerde structuur-eigenschaprelaties.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in DNA-hybridisatie, rheometrie en fluorescentiegebaseerde kwantificering.
- Toegang tot een thermocycler, dynamische afschuifrheometer en real-time PCR-systeem is nodig voor assemblage en validatie.
- Vereist standaardisatie van oligonucleotideconcentraties en magnesiumchloridecondities tussen teams.
- Omvat aanpassingsfactoren bij het vertalen van nanobuismechanica naar natuurlijke biopolymeer- of hydrogelsystemen.
- Bevat praktische beperkingen, zoals de noodzaak om verdamping tijdens rheometrie te voorkomen en gasbellen te verwijderen voorafgaand aan qPCR-analyse.
