Live beeldvorming van primaire hersenschors cellen met behulp van een systeem van 2D cultuur

Het algemene doel van dit experiment is het observeren van celgedrag tijdens de progressie van neurale stamcellen naar neuronen of gliacellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen in het gebied van neurodevelopmentale vraagstukken, zoals de rol van symmetrische en asymmetrische celdelingen, celcyclusverlenging en celgroeisnelheden. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de observatie van cellijnen gedurende lange periodes mogelijk maakt.

Dit maakt de observatie van de overgang van neurogenese naar gliacogeneze mogelijk binnen een enkele lijn en een directe vergelijking van sublineaire neurale en gliale progenitorcellen. Begin door de hersenen van 5 tot 10 e14 embryo's in een petrischaal met koud dissectiemedium te verwijderen. Gebruik pincetten om voorzichtig de huid en schedel te verwijderen en de hersenen te isoleren.

Tijdens het werk onder de stereomicroscoop, gebruik dissectieforseps om de hersenvliezen te verwijderen. Splits vervolgens het telencephalon in het midden om de hemisferen te scheiden. Om het dorsolaterale telencephalon te isoleren, snijd langs de dorsomediale curve en de grens tussen het pallium en subpallium.

Breng de dorsolaterale telencephalons over naar een 2mL buis met dissectiemedium op ijs totdat alle hersenen zijn gedissecteerd. Na microdissectie van het dorsolaterale telencephalon, plaats het weefsel in een 15mL kegelbuis. Centrifugeer vervolgens de buis met het verzamelde weefsel in koud dissectiemedium gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en 340 keer G om het weefsel te laten bezinken.

Na het centrifugeren, verwijder het supernatant met een pipette en voeg 1mL van 37 graden Celsius 0,05% Trypsin-EDTA toe voor chemische vertering. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg na de incubatie 2mL proliferatiemedium toe om Trypsim-activiteit te remmen.

Polijst vervolgens de punt van een glazen Pasteur-pipet gedurende enkele seconden boven een gasbrander of Bunsenbrander om de opening lichtjes te verkleinen. Zuig FCS op om de punt van de pipet te coaten. Dissocieer vervolgens de cellen mechanisch met de gepolijste en met FCS gecoate Pasteur-pipet door op en neer te pipetten, terwijl u voorzichtig bent om geen bubbels te genereren.

Centrifugeer de gedissocieerde cellen gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius bij 340 keer G. Verwijder het supernatant met een pipette, voeg vervolgens één millimeter proliferatiemedium toe en resuspendeer de cellen met behulp van een pipette. Verwijder het PBS van de voorbehandelde plaat met Poly-D-Lysine. Trek vervolgens een tekening op de bodem van de plaat die kan worden gebruikt als referentie om het nulpunt te bepalen.

Na het tweede resuspenderen van de cellen in proliferatiemedium, bereid een een-op-een verdunning van de celsuspensie voor met behulp van een 0,4% Trypan blauw-oplossing. Laad in tellingskamerglazen en tel het aantal ongekleurde levensvatbare cellen. Niet-levensvatbare cellen zullen blauw zijn.

Verdun de cellen in proliferatiemedium om 10 tot de zesde cellen per millimeter te krijgen. Voeg 500 microliter van de celsuspensie toe aan elke put van een 24-well weefselkweekplaat en incubeer cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Om retrovirus-getransduceerde cellen te beeldvormen, plaats de weefselkweekplaat in een beeldvormingskamer die is aangesloten op temperatuur- en koolstofdioxideregelaars om de cellen onder constante omstandigheden van 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide te houden.

Selecteer een positie op de xy-as om als nulpunt te dienen en kalibreer het nulpunt. Selecteer 10 tot 15 posities per put om te worden geïmagingd bij 10 keer vergroting. Stel de software in om elke vijf minuten fasecontrastbeelden en elke drie uur fluorescentiebeelden te vereisen om fototoxiciteit te verminderen.

Controleer en pas de focus aan in de eerste drie uur van het experiment aan, omdat deze kan veranderen terwijl de temperatuur in evenwicht komt. Na zeven dagen, stop de acquisitie en ga verder met post-imaging immunocytochemie. Start de celtrackingsoftware en kies een gebruikersnaam.

Klik op kies je gebruikersnaam en ga verder. Blader en selecteer de tTt-werkmap om stamboomlijnen, statistieken en geëxporteerde afbeeldingen op te slaan. Selecteer vervolgens het experiment dat moet worden geanalyseerd en geladen.

Als de afbeeldingen eerder zijn geconverteerd door de tTt-converter, klik dan op logbestanden converteren en geef het aantal seconden op tussen twee opeenvolgende tijdstippen in het logbestanden converteren venster. Klik op logbestanden converteren voor het hele experiment. Selecteer en laad de gewenste afbeeldingen handmatig of met behulp van de optie die in het programma wordt weergegeven.

Selecteer bestand, open, nieuwe kolonie. Klik op tracking, gevolgd door start tracking om het volgen in een gekozen positie te starten. Er verschijnt een filmpjesvenster.

Selecteer de cel met behulp van de volgcilinder en druk op de nultoets. De software gaat naar het volgende frame. Blijf de volgcilinder rond de te volgen cel plaatsen met behulp van de muis en klik op nul in elk frame om een volgmarkering op de cel toe te voegen.

Gebruik toetsen één en drie om naar het vorige of volgende frame te gaan. Om een volgmarkering te verwijderen, klikt u gewoon op de juiste positie om te markeren en drukt u op nul. Als de cel is gedeeld, selecteer volgen, stopreden, deling en vervolg het volgen van één dochtercel door een van de cellen in het cellenbewerkingsvenster te selecteren, selecteer vervolgens volgen, start tracking.

Om de tweede dochtercel te volgen, selecteer deze in de cellenbewerker en druk op F2. Als de cel tijdens de videomicroscopie is gestorven, selecteer apoptose. Als de cel het observatieveld verlaat of zich vermengen met aangrenzende cellen waardoor volgen onmogelijk wordt, selecteer verloren. Om het volgen te stoppen en later te hervatten, klikt u op onderbreken.

In het cellenbewerkingsvenster wordt tijdens het volgen een boom gegenereerd. Om de stamboom op te slaan, selecteert u bestand, opslaan, huidige boom in het cellenbewerkingsven