Name: High-throughput Screening op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Leer een high-throughput screeningsmethode voor eiwitgebaseerde overerving in S. cerevisiae. Deze techniek identificeert eiwitten die blijvende fenotypische geheugens induceren en biedt inzicht in prionbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Sohini Chakrabortee, Sandra Jones, David Garcia, Bhupinder Bhullar, Amelia Chang, Richard She en Susan Lindquist voor hun hulp bij de ontwikkeling van de tests die in dit document, evenals de revisoren gebruikt voor hun doordachte opmerkingen.

1. Initiële overexpressie
<ol>
	<li>Transformeer de gistcellen (in dit geval, BY4741 MAT a haploïden) die eerder zijn gekweekt in YPD-vloeistof (10 g gistextract, 20 g pepton en 20 g glucose per 1 L) met de gewenste kandidaatconstructen uit de FLEXGene ORFeome bibliotheek (gist ORF's onder controle van een galactose-induceerbare promotor in de URA3-gemarkeerde centromereplasmide back-bone, pBY01129). 
	OPMERKING: Alle groeistappen worden uitgevoerd bij 30 °C en bij atmosferische CO2-niveaus (407,05 ppm), tenzij anders vermeld.</li>
	<li>Gebruik autoclaved tandenstokers om vier aparte kolonies van deze transformaties te plukken om als biologische replica's te dienen. Laat ze 48-72 uur groeien in 150 µL van SRaffinose-URA (0,74 g van CSM-URA, 6,7 g van gist-stikstofbasis zonder aminozuren, en 20 g raffinose per 1 L) in 96-wells platen. Inoculeer kolonies van de eerste ORF in put A1 van alle platen, kolonies van de tweede ORF in A2 van alle platen, etc. 
	OPMERKING: Om het grootste dynamische bereik voor fenotypische detectie te bereiken, wordt een 2-voudige verdunningsreeks rond de LD50-concentratie van een bepaalde stressor aanbevolen. Dit kan vooraf worden gedaan om de optimale concentratie te bepalen waarbij zowel verbeterde als verminderde groei kan worden waargenomen.</li>
	<li>Bereid tegelijkertijd aparte 384-wells platen met 45 µL van SGal-URA met de stressors van belang (bijv., mangaanchloride bij 20 mM) per put. Inoculeer deze plaat op dezelfde manier als in stap 1.3. 
	OPMERKING: Om het grootste dynamische bereik voor fenotypische detectie te bereiken, wordt een 2-voudige verdunningsreeks rond de LD50-concentratie van een bepaalde stressor aanbevolen. Dit kan vooraf worden gedaan om de optimale concentratie te bepalen waarbij zowel verbeterde als verminderde groei kan worden waargenomen.</li>
	<li>Als een laatste parallelle controle, inoculeer een derde 384-wells plaat op dezelfde manier, met dezelfde stressor in medium dat geen plasmide-expressie zal induceren. Zorg ervoor dat de plaat 45 µL van SD-URA (0,74 g van CSM-URA, 6,7 g van gist-stikstofbasis zonder aminozuren, en 20 g glucose per 1 L) per put bevat en is geïnoculeerd zoals in stappen 1.3 en 1.4.</li>
	<li>Plaats de platen met cellen onmiddellijk op een microplate stacker en stel het protocol in voor een continue lus van 72 uur, meting van de OD600 met een microplate lezer uitgerust met stackers bij kamertemperatuur en atmosferische CO2 (407,05 ppm). 
	Opmerking: De frequentie van de groeimeting zal afhangen van het aantal platen (uiteindelijk bepaald door het aantal genen en condities dat de onderzoeker wil onderzoeken) dat in de run wordt gebruikt. Hoe meer platen worden gebruikt, hoe langer het duurt voordat de plate reader een lus voltooit en dus hoe langer de tijd tussen metingen (meettijd per plaat is ~45 s, afhankelijk van de gebruikte instrumentatie).</li>
	<li>Na de groeimetingen, gebruik dezelfde liquid handling robot om 1 µL per put van de SGal-URA-geïnduceerde culturen (d.w.z. diegenen die eiwit-overexpressie hebben ervaren) over te brengen naar nieuwe 384-wells platen met 45 µL van SD-URA per put (medium dat geen eiwitexpressie van het plasmide toestaat).
	<ol>
		<li>Gevoer in parallel analoge inoculaties van een tweede set van 384-wells platen met 45 µL van SD-URA per put van de culturen die zijn gekweekt in SD-URA in aanwezigheid van de stressors (d.w.z. diegenen van stap 1.5).</li>
		<li>Laat de platen 48 uur groeien bij 30 °C tot verzadiging in een bevochtigde kamer (d.w.z. een afsluitbare plastic bak met een vochtige papieren handdoek erin).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Neem de platen van de vorige stap en reïnoculeer 1 µL per put in 384-wells platen met 45 µL van SD-URA. Voer vervolgens een afzonderlijke reïnoculatie uit van 1 µL per put van dezelfde bronplaat in een afzonderlijke 384-wells plaat met 45 µL van SD-URA met de stressor. 
	OPMERKING: Dit zal bepalen of de gevoeligheids-/resistentiefenotypen voor een stressor aanhouden nadat de eiwit-overexpressie is gestopt.</li>
	<li>Plaats de platen met cellen onmiddellijk op een microplate stacker en stel het protocol in voor een continue lus van 48 uur meting van de OD600 met een microplate lezer bij kamertemperatuur en atmosferische CO2 (407,05 ppm).</li>
	<li>Exporteer de tijd versus OD600 metingen als een XY-tabel met behulp van de plate reader software. Groepeer kolommen van de OD600 voor elke biologische replicaat samen en bereken het gemiddelde. Maak een XY-plot van tijd versus OD600 om groeicurven te genereren.
	<ol>
		<li>Vergelijk de groeisnelheden van culturen die waren onderworpen aan een eerdere overexpressie (d.w.z. die oorspronkelijk geïnduceerd waren in galactose-houdend medium voordat ze opnieuw werden geïnoculeerd in SD-URA) versus culturen die dat niet waren (d.w.z. die in glucose waren gepropageerd), zoals eerder beschreven30.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Voor culturen die significante groiveschillen vertonen in reactie op een bepaalde stressor, afhankelijk van voorouderlijke eiwit-overexpressie, neem 1 µL van elke biologische replicaat, verdun het in 10 mL water en plateer vervolgens 50 µL op platen met 5-

<ol><li>Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions%2C+protein+homeostasis%2C+and+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity.</a> Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).</li>
<li>Byers, J. S., Jarosz, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pernicious+pathogens+or+expedient+elements+of+inheritance%3A+the+significance+of+yeast+prions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions.</a> PLoS Pathog. 10 (4), 1003992(2014).</li>
<li>Jarosz, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-kingdom+chemical+communication+drives+a+heritable%2C+mutually+beneficial+prion-based+transformation+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism.</a> Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).</li>
<li>True, H. L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion+provides+a+mechanism+for+genetic+variation+and+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity.</a> Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).</li>
<li>Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion%2C+Mod5%2C+promotes+acquired+drug+resistance+and+cell+survival+under+environmental+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.</a> Science. 336 (6079), 355-359 (2012).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146 (3), 448-461 (2011).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+polymerization+underlies+signal+transduction+in+antiviral+immune+defense+and+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation.</a> Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).</li>
<li>Majumdar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+amyloid-like+oligomers+of+Drosophila+Orb2+in+the+persistence+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory.</a> Cell. 148 (3), 515-529 (2012).</li>
<li>Khan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloidogenic+Oligomerization+Transforms+Drosophila+Orb2+from+a+Translation+Repressor+to+an+Activator%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator.</a> Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).</li>
<li>Fioriti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Persistence+of+Hippocampal-Based+Memory+Requires+Protein+Synthesis+Mediated+by+the+Prion-like+Protein+CPEB3%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3.</a> Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).</li>
<li>Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+affect+the+appearance+of+other+prions%3A+the+story+of+%5BPIN%28%2B%29%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)].</a> Cell. 106 (2), 171-182 (2001).</li>
<li>Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+survey+identifies+prions+and+illuminates+sequence+features+of+prionogenic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins.</a> Cell. 137 (1), 146-158 (2009).</li>
<li>Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+chaperone+protein+Hsp104+in+propagation+of+the+yeast+prion-like+factor+%5Bpsi%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+].</a> Science. 268 (5212), 880-884 (1995).</li>
<li>Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Support+for+the+prion+hypothesis+for+inheritance+of+a+phenotypic+trait+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast.</a> Science. 273 (5275), 622-626 (1996).</li>
<li>Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BURE3%5D+as+an+altered+URE2+protein%3A+evidence+for+a+prion+analog+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">[URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 264 (5158), 566-569 (1994).</li>
<li>Sondheimer, N., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rnq1%3A+an+epigenetic+modifier+of+protein+function+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast.</a> Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).</li>
<li>Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amyloid-forming+peptide+from+the+yeast+prion+Sup35+reveals+a+dehydrated+beta-sheet+structure+for+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).</li>
<li>Glover, J. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9182769">Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae.</a> Cell. 89 (5), 811-819 (1997).</li>
<li>King, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-inducing+domain+2-114+of+yeast+Sup35+protein+transforms+in+vitro+into+amyloid-like+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp104+catalyzes+formation+and+elimination+of+self-replicating+Sup35+prion+conformers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers.</a> Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).</li>
<li>Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elimination+of+the+yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+by+guanidine+hydrochloride+is+the+result+of+Hsp104+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation.</a> Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).</li>
<li>Caudron, F., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+super-assembly+of+Whi3+encodes+memory+of+deceptive+encounters+by+single+cells+during+yeast+courtship%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship.</a> Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).</li>
<li>Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16793280">How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta].</a> Methods. 39 (1), 3-8 (2006).</li>
<li>Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+SUP35+gene+induces+de-novo+appearance+of+psi-like+factors+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).</li>
<li>Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heritable+switch+in+carbon+source+utilization+driven+by+an+unusual+yeast+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion.</a> Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).</li>
<li>Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+product+of+the+het-s+heterokaryon+incompatibility+gene+of+the+fungus+Podospora+anserina+behaves+as+a+prion+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).</li>
<li>Sopko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).</li>
<li>Chakrabortee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+Disordered+Proteins+Drive+Emergence+and+Inheritance+of+Biological+Traits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits.</a> Cell. 167 (2), 369-381 (2016).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaching+a+complete+repository+of+sequence-verified+protein-encoding+clones+for+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).</li>
<li>Swain, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+time+derivatives+including+cell+growth+rates+using+Gaussian+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes.</a> Nat Commun. 7, 13766(2016).</li>
<li>Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+prion-like+element+converts+wild+fungi+from+metabolic+specialists+to+generalists%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists.</a> Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).</li>
<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li>
<li>Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+high+efficiency+transformation+of+intact+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells.</a> Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425(1992).</li>
<li>Formosa, T., Nittis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressors+of+the+temperature+sensitivity+of+DNA+polymerase+alpha+mutations+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).</li>
<li>Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+proteome+turnover+analyses+of+the+Yeasts+S.+cerevisiae+and+S.+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe.</a> Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).</li>
<li>Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLAAC%3A+a+web+and+command-line+application+to+identify+proteins+with+prion-like+amino+acid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition.</a> Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).</li>
<li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li>
<li>Rogoza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Mendelian+determinant+%5BISP%2B%5D+in+yeast+is+a+nuclear-residing+prion+form+of+the+global+transcriptional+regulator+Sfp1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+as+adaptive+conduits+of+memory+and+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Prions as adaptive conduits of memory and inheritance.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).</li>
<li>Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+variations+in+an+infectious+protein+determine+prion+strain+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences.</a> Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).</li>
<li>Tanaka, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protein+transformation+protocol+for+introducing+prions+into+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).</li>
<li>Roberts, B. T., Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+activity%3A+a+prion+that+propagates+by+covalent+autoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation.</a> Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).</li>
<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistability+in+the+lactose+utilization+network+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli.</a> Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De eerste gist prionen werden geïdentificeerd door hun ongewone fenotypes en verbijsterende patronen van overerving. De kenmerken van deze prionen werden vervolgens gebruikt om te bouwen van algoritmen en computerhulpmiddelen aan het scherm voor extra prion-eiwitten. De hier beschreven methode in tegenstelling, is experimenteel en voorbijgaande overexpressie maken een duurzame verandering-een stabiele staat-gecodeerd in eiwit conformatie afhankelijk. Echter, als de efficiëntie van het "zaaien" prion vergadering door over...

Biologische systemen ervaren vaak voorbijgaande fluctuaties in eiwit overvloed. Het is onduidelijk of deze hebben een blijvende invloed bij het vormgeven van het fenotype van een organisme of van de toekomstige generaties. De bekendste voorbeelden van deze biologie betrekken een zeldzame klasse van eiwitten, prionen, die het ontstaan van erfelijke eigenschappen genoom ongewijzigd rijden. In plaats daarvan zenden deze proteinaceous en infectious deeltjes fenotypen via zichzelf onderhoudende wijzigingen aan eiwit conformatie1,2. Dit soort erfenis werd ontdekt als de oorzaak van de ongewone erfenis patronen van een verwoestende neurodegeneratieve ziekte. Echter, studies in organismen variërend van schimmels aan zoogdieren3,4,5,6,7,8,9,10 aangezien is gebleken dat het prion-achtige elementen adaptieve waarde kunnen verlenen. Prionen hebben echter werd bekeken als een fascinerende maar zeldzame biologische eigenaardigheid.
Deze heersende wijsheid is gedeeltelijk gehouden omdat de karakterisering van proteïne gebaseerde overname lang met een klein aantal voorbeelden is beperkt. Recente systematische screening inspanningen hebben deze foto aanzienlijk verruimd door het identificeren van verschillende nieuwe bona fide prionen11 en bijna twee dozijn eiwit domeinen12 met het vermogen om brandstof prion-achtige conformationele conversie. Echter, omdat deze benaderingen over het algemeen op sterke aminozuur reeks vooroordelen gericht hebben, delen de prionen die zijn ontdekt de biochemische eigenschappen van de stichtende gist prionen [PSI+]13,14, [URE3]15en1611,[RNQ+]. Deze omvatten: 1) modulaire domeinen die rijk zijn aan lang polymere stukken van asparagine (N) en glutamine (Q), 2) vergadering in een amyloïde [PRION+] conformatie17,18,19, en 3) volledige afhankelijkheid van disaggregase Hsp104 functie voor trouwe vermeerdering van moeder op dochter13,20,21. Inderdaad, vele bona fide prionen, waaronder [GAR+], [Het-s], en zelfs de oorspronkelijke prion (PrPSc), onder dergelijke strenge criteria zouden worden gemist. Misschien nog belangrijker, zou ze kunnen vangen elke nieuwe mechanismen van overname op basis van eiwitten22. De echte biologische breedte van dergelijke verschijnselen kunnen dus veel vaker in de natuur dan eerder aangenomen.
Om te onderzoeken van deze vraag, een high-throughput, Proteoom-brede strategie werkte. Een kenmerk van alle prionen, met inbegrip van PrPSc, [GAR+], en [Het-s], is dat de voorbijgaande overexpressie van de causale eiwitten sterk verhoogt het tarief van prion overname15,23,24,25,26. We profiteerde van deze functie te systematisch vragen, over de gehele gist ORFeome, als stabiel op basis van eiwitten, epigenetische Staten kon worden gestart door Transient inducerende de overexpressie van individuele eiwitten. Het is bekend dat eiwit overexpressie fenotypen27kunt wijzigen. Prion-eiwitten zijn echter ongebruikelijk omdat hun tijdelijke overproductie produceert een verandering in fenotype thats erfelijke voor vele honderden generaties na de initiële overexpressie. Eerder hebben we voordeel van deze functie, alsook de ongewone erfenis patronen van op basis van eiwitten genetische elementen te identificeren van tientallen eiwitten die kunnen heritably bedrading opnieuw fenotypische landschappen zonder te veranderen van het genoom28. Hoewel sommige geïdentificeerd waren eiwitten voorheen bekend als prionen, de meeste waren niet onderstrepen van de kracht van deze aanpak te ontdekken van nieuwe vormen van overname op basis van eiwitten.

<table><tbody><tr><td>Guanidine hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>Cat#G3272-25G</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>Mangaanchloride</td><td>Sigma</td><td>Cat#M8054-100G</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>Ethidiumbromide</td><td>Sigma</td><td>E1510</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>5-Fluoroorotinezuur</td><td>Sigma</td><td>Cat#F5013-50MG</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>BY4741 MATa (his3&Delta;1 leu2&Delta;0 LYS2 met15&Delta;0 ura3&Delta;0)</td><td>Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998</td><td>N/A</td><td>Giststam</td></tr><tr><td>BY4741 MAT&alpha; (his3&Delta;1 leu2&Delta;0 lys2&Delta;0 MET15 ura3&Delta;0)</td><td>Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998</td><td>N/A</td><td>Giststam</td></tr><tr><td>Hsp70 (K69M)&nbsp;</td><td>Jarosz et al., 2014b</td><td>N/A</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>FLEXGene bibliotheek</td><td>Hu et al., 2007</td><td>N/A</td><td>Plasmid bibliotheek</td></tr><tr><td>Dextrose (glucose)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Sigma</td><td>R0250-25G</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP656-500</td><td>Media component</td></tr><tr><td>CSM</td><td>Sunrise Science</td><td>1001-100</td><td>Media component</td></tr><tr><td>CSM-URA</td><td>Sunrise Science</td><td>1004-100</td><td>Media component</td></tr><tr><td>CSM-LYS</td><td>Sunrise Science</td><td>1032-100</td><td>Media component</td></tr><tr><td>CSM-MET</td><td>Sunrise Science</td><td>1019-100</td><td>Media component</td></tr><tr><td>CSM-LYS-MET</td><td>Sunrise Science</td><td>1035-100</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Research Products International</td><td>P20240-5000</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Bacto-pepton</td><td>BD</td><td>211677</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-2</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Giststikstofbasis zonder aminozuren</td><td>BD</td><td>291920</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Agar</td><td>IBI Scientific</td><td>IB49172</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Adeninesulfaat</td><td>Sigma</td><td>A3159-25G</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Kaliumacetaat</td><td>Sigma</td><td>P1190-500G</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Histidine</td><td>Sigma</td><td>H8000-100G</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Leucine</td><td>Sigma</td><td>L8000-25G</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Sigma</td><td>L5501-25G</td><td>Media component</td></tr><tr><td>RNase I&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0601</td><td>Enzyme</td></tr><tr><td>Biotinyleerde DNase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1906</td><td>Enzyme</td></tr><tr><td>zymolyase 100T (gist lytisch enzym)</td><td>Sunrise Science</td><td>N0766555</td><td>Enzyme</td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Microplate stacker</td><td>BioTek</td><td>BioStack3</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Plate filler</td><td>BiotTek</td><td>EL406</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Vloeistofmanipulerende robot</td><td>Beckman Coulter</td><td>Biomek FX</td><td>Apparatuur</td></tr></tbody></table>

high-throughput screening op basis van eiwitten erfdeel in s. cerevisiae

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

De codering van biologische informatie die toegankelijk is voor toekomstige generaties wordt over het algemeen bereikt via veranderingen in de opeenvolging van DNA. Ingezien langlevende overname gecodeerd in eiwit conformatie (eerder dan reeks) lang als paradigma-shifting maar zeldzaam. De beste gekarakteriseerd voorbeelden van dergelijke epigenetische elementen zijn prionen, die een zelfassemblerende gedrag dat de erfelijke manifestatie van nieuwe fenotypen rijden kan bezitten. Vele archetypische prionen weergeven een opvallende N/Q-rijke reeks bias en monteren in een amyloïde schoot. Deze ongebruikelijke kenmerken hebben laten weten dat de meeste screening inspanningen te identificeren van nieuwe prion-eiwitten. Ten minste drie bekende prionen (met inbegrip van de stichtende prion, PrPSc) doen echter niet deze biochemische kenmerken haven. Daarom ontwikkelden we een alternatieve methode om de sonde van de werkingssfeer van de op basis van eiwitten overname op basis van een eigenschap van massa-actie: de voorbijgaande overexpressie van prion-eiwitten verhoogt de frequentie waarop zij een zelf-templating bevleesdheid verwerven. Dit document beschrijft een methode voor het analyseren van de capaciteit van de gist ORFeome te verduidelijken met overname op basis van eiwitten. Met behulp van deze strategie, eerder vonden we dat &gt; 1% van gist eiwitten kon brandstof de opkomst van biologische eigenschappen die waren langlevende, stabiel, en vaker dan genetische mutatie is ontstaan. Deze aanpak kan worden gebruikt in hoge-doorvoer over de gehele ORFeomes of als een gerichte screening paradigma voor specifieke genetische netwerken of milieu prikkels. Net zoals voorwaartse genetische schermen talrijke ontwikkelings- en signalering trajecten definiëren, bieden deze technieken een methodologie voor het onderzoek naar de invloed van overname op basis van eiwitten in biologische processen.

Het bekend is dat eiwit-overexpressie cellulaire fenotypes drastisch kan veranderen27. Inderdaad werden met een initiële screeningaanpak honderden nieuwe fenotypes reproduceerbaar aangetroffen na de overexpressie van klonen uit het gist-ORFeome met gebruik van slechts tien stressfactoren. De hierboven beschreven assays maken echter een beoordeling mogelijk of cellen enige langdurig stabiele fenotypes behouden na deze overexpressie. Eén eiwit dat in staat is om een ...

Dit protocol beschrijft een high-throughput methodologie om functioneel scherm op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae.

High-throughput Screening op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

Het algemene doel van deze high-throughput gistfenotypering is het screenen op eiwitten die een blijvend fenotypisch geheugen van eerdere expressie opwekken, als proxy voor eiwitgebaseerde overerving. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van gistprionen, zoals hoeveel eiwitten overerving van dit type kunnen opwekken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat u veel eiwitten en signaalpaden op een onbevooroordeelde manier kunt screenen.Start deze procedure door de juiste gistcellen te kweken in een 96-wells plaat bij 30 °C, zoals beschreven in het tekstprotocol. Inspecteer de culturen visueel om te bevestigen dat de culturen verzadigd zijn; de cellen moeten met het blote oog zichtbaar zijn op de bodem van elke well. Gebruik een vloeistofhandelingsrobot om 384-wells platen voor te bereiden, met 45 µL van het juiste medium per well.Breng eerst Scal-URA aan in de putjes van een 384-wells plaat. Breng vervolgens Scal-URA plus de stressor van belang aan in de putjes van een tweede plaat; in dit experiment wordt 20 millimolar mangaanchloride als stressor gebruikt. Breng ten slotte SD-URA, wat geen plasmidexpressie zal induceren, plus manga

high-throughput-screening-for-protein-based-inheritance-s

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

GFP-fusie-eiwitten worden op grote schaal gebruikt om de organellen visualiseren door confocale microscopie. Echter, screening voor mutaties die de morfologie van organellen invloed vereist in het algemeen individueel mutagenese en is tijdrovend. Hier tonen we een methode om simultaan te nemen organel-GFP markers in bijna 5.000 niet-essentiële genen in gist.

Een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in S. cerevisiae

Hier beschrijven we een plasmide overexpressie scherm...

High-throughput gist Plasmide Overexpressie Screen

We hebben uitgebreide, onpartijdige genoom-brede schermen van gen-drugs-en gen-omgeving interacties te begrijpen. Methoden voor het screenen van deze mutant collecties worden gepresenteerd.

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

Beschrijven we een low cost, high throughput methode voor het screenen op schimmels endoglucanase activiteit...

High Throughput Screening van Fungal endoglucanase activiteit in Escherichia coli</em

Met behulp van eiwit microarrays met bijna het hele S. cerevisiae proteoom wordt gesondeerd voor snelle onpartijdige ondervraging van duizenden proteïne-proteïne interacties in parallel. Deze werkwijze kan worden gebruikt voor eiwit-kleine molecule, posttranslationele modificatie, en andere assays high-throughput.

Probing hoge dichtheid functioneel eiwit Microarrays om eiwit-eiwit interacties Detect

Hier presenteren we een kosteneffectieve methode voor het definiëren van chemisch-genetische interacties in knopgistende gist. De benadering is gebaseerd op fundamentele technieken in moleculaire biologie van gist en is zeer geschikt voor het mechanistische onderzoek van kleine tot middelgrote collecties chemicaliën en andere media-omgevingen.

Snelle identificatie van chemische Genetische Interacties in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

We presenteren een gedetailleerd protocol om mutantenbibliotheken te construeren en te screenen voor gerichte evolutiecampagnes in Saccharomyces cerevisiae.

Geregisseerd Evolution Method in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliotheek Creatie en Screening

Dit artikel presenteert een paring gebaseerde methode om overexpressie screening in ontluikende gist met behulp van een gekleed plasmide-bibliotheek.

Paring gebaseerde overexpressie bibliotheek Screening in het gist

Een knelpunt in de 'design-build-test' cyclus van microbiële engineering is de snelheid waarmee we functionele schermen van stammen kunnen uitvoeren. We beschrijven een high-throughput methode voor stam screening toegepast op honderden tot duizenden gistcellen per experiment dat droplet-gebaseerde RNA sequencing gebruikt.

Hoge doorvoer Gist Stam Federtyping met Droplet-Based RNA Sequencing

Dit werk beschrijft een protocol voor een multicopy suppressor genetische screening in Schizosaccharomyces pombe. Dit scherm maakt gebruik van een genoombrede plasmidebibliotheek om suppressorkloon (en) van een functieverliesfenotype geassocieerd met een querymutantenstam te identificeren. Nieuwe genetische onderdrukkers van de ell1 null-mutant werden geïdentificeerd met behulp van dit scherm.

Genetische screening voor identificatie van multicopy suppressors in Schizosaccharomyces pombe

Dit protocol beschrijft de essentiële stappen voor het uitvoeren van selectiecampagnes voor gistoppervlakken om eiwitvarianten te verrijken die binden aan een interessant antigeen.

Eiwittechniek door gist Surface Display

Leer een high-throughput screeningsmethode voor eiwitgebaseerde overerving in S. cerevisiae. Deze techniek identificeert eiwitten die blijvende fenotypische geheugens induceren en biedt inzicht in prionbiologie.

High-throughput Screening op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae

Meer video's verkennen