High-throughput Screening op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae

Het algemene doel van dit grootschalige fenotypering van gist is om te screenen naar eiwitten die een blijvende fenotypische herinnering veroorzaken van overige expressie, als proxy voor eiwit-gebaseerde overerving. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van gist-Prion, zoals hoeveel eiwitten kunnen ervan deze vorm van overerving veroorzaken. Het grote voordeel van deze techniek is dat je veel eiwitten en paden op een onbevooroordeelde manier kunt screenen.

Begin deze procedure door de juiste gistcellen te laten groeien in een 96-wellsplaat bij 30 graden Celsius, zoals beschreven in het tekstprotocol. Inspecteer de culturen visueel om te bevestigen dat de culturen verzadigd zijn, cellen moeten met het blote oog zichtbaar zijn, op de bodem van elke well. Gebruik een robot voor vloeistofverwerking om 384-wellsplaten voor te bereiden, die 45 microliter van het juiste medium per well bevatten.

Verspreid eerst Scal-URA in de wells van een 384-wellsplaat. Verspreid vervolgens Scal-URA plus de stressor van belang in de wells van een tweede plaat, 20 millimolair mangaanchloride wordt in dit experiment als stressor gebruikt. Ten derde, verspreid SD-URA, dat geen plasmide-expressie zal induceren, plus mangaanchloride in een andere plaat.

Plaats de 96-wellsplaat met de culturen op de robot voor vloeistofverwerking en inoculeer een één op vier array van één microliter van elke well van de 96-wellsplaat, in vier aparte wells van elke 384-wellsplaat gevuld met een ander medium. Plaats de platen met cellen onmiddellijk op een microplatestacker bij kamertemperatuur en atmosferische koolstofdioxide. Stel het protocol in voor een 72-urige continue lus, het meten van de optische dichtheid bij 600 nanometer met de microplatelezer.

Na de groeimeteringen, breng één microliter per well van de SCal-URA geïnduceerde culturen die eiwitoverexpressie hebben ervaren over naar nieuwe 384-wellsplaten, die 45 microliter per well ST-URA-medium bevatten dat geen eiwitexpressie van het plasmide toestaat. Parallel hieraan, voer analoge inoculaties uit van een tweede set 384-wellsplaten met 45 microliter per well ST-URA van de culturen die zijn gekweekt in ST-URA in aanwezigheid van de stressor. Plaats de platen in een bevochtigde kamer en laat de platen 48 uur groeien bij 30 graden Celsius tot verzadiging.

Na 48 uur, gebruik de platen om één microliter per well opnieuw te inoculeren in 384-wellsplaten met 45 microliter per well ST-URA. Voer vervolgens een aparte herinoculatie uit van één microliter per well vanaf dezelfde bronplaat in een afzonderlijke 384-wellsplaat met 45 microliter per well ST-URA met de stressor. Plaats de platen met cellen van de microstacker onmiddellijk bij kamertemperatuur en atmosferische koolstofdioxide en stel het protocol in voor een 48-urige continue lus, het meten van de optische dichtheid bij 600 nanometer met een microplatelezer.

Wanneer de groeimeteringen klaar zijn, gebruik de platenleersoftware om de tijd versus optische dichtheidsmetingen bij 600 nanometer als een XY-tabel te exporteren. Groepeer kolommen van de optische dichtheidsmetingen voor elke biologische replicaat samen en bereken het gemiddelde. Maak een XY-plot van tijd versus optische dichtheid bij 600 nanometer om groeicurven te genereren.

Voor culturen die significante groeverschillen vertonen in reactie op een bepaalde stressor, afhankelijk van voorouderlijke eiwitoverexpressie, neem één microliter van elke biologische replicaat, verdun in 10 milliliter water en plateer vervolgens 50 microliter op platen met 5-FOA. Laat drie dagen groeien bij 30 graden Celsius. Als dit resulteert in te veel of te weinig kolonies per plaat, pas de verdunningsfactor dienovereenkomstig aan.

100 tot 200 kolonies per plaat is ideaal. Kies acht tot 32 enkele kolonies met autoclaaf tandenstokers en prik ze op 96-wellsplaten met 150 microliter SDCSM per well. Plaats de platen in een bevochtigde kamer en laat ze 48 tot 72 uur groeien tot verzadiging bij 30 graden Celsius.

Gebruik deze culturen om twee nieuwe sets 96-wellsplaten te inoculeren met 150 microliter per well SDCSM, zowel met als zonder de stressor. Plaats de platen op een microplatestacker en stel het protocol in om de optische dichtheid bij 600 nanometer te meten op een 48-urige continue lus. Na 48 uur, analyseer de gegevens zoals eerder getoond en bevestig dat de significante groeverschillen die eerder werden gezien, worden gehandhaafd na plasmideverlies.

De cellen die de geïnduceerde fenotypes handhaven, worden vervolgens getest op klassieke kenmerken van eiwit-gebaseerde overerving zoals beschreven in het tekstprotocol. Deze eiwit-gebaseerde overervingsscreening onthulde de tijdelijke overexpressie van het PSP1 open leesraam, die een resistentie tegen mangaanchloride aandrijft die honderden generaties in cellen werd gehandhaafd, lang nadat de overexpressie was gestopt. Prion-voorspellende algoritmen scoreden het eindterminus van PSP1 als matig Prion-achtig.

In tegenstelling hiermee, voorspelden de algoritmen vrijwel geen significante Prion-achtige sequentiekenmerken van de meeste inducerende eiwitten die in de screen werden teruggevonden, zoals getoond door deze representatieve analyse. Groeimeteringen van stammen en SDCSM met mangaanchloride, genormaliseerd naar een overeenkomstige naïeve PSP1 minus controle, gaven aan dat remming van de HSP104 disaggregase de PSP1-afhankelijke mangaanchlorideresistentie niet beïnvloedt, terwijl de verwijdering van de HSP70 chaperone en het PSP1-gen, erfelijk deze fenotype elimineert. Alle sporen van enkele tetrads van kruisingen tussen stammen, die de PSP1-afhankelijke fenotypische toestand en naïeve stammen bevatten, vertonen mangaanchlorideresistentie, wat duidt op niet-mendelische overerving van het fenotype.

Een vergelijking van de infectiviteit voor eiwittransformatie tussen mock-lysaten en PSP1-harbourende lysaten als het overdraagbare materiaal, toonde aan dat meer dan 53%van de naïeve cellen getransformeerd met gezaaide PSP1, het corresponderende mangaanchlorideresistentie