Episcopische Microscopie met hoge resolutie (HREM) - Eenvoudige en robuuste protocollen voor het verwerken en visualiseren van organische materialen

Het algemene doel van deze procedure is om digitale volumegegevens van organische materialen te genereren. Voorbeelden zijn embryo's en embryoweefsels van biomedische modelorganismen, weefselblokken die zijn geoogst van volwassen dieren en mensen, inclusief huid- of spierbiopsieën en materialen zoals ongecoat papier en huidsubstituten. HREM helpt bij het beantwoorden van fundamentele vragen op het gebied van geneeskunde en biomedisch onderzoek.

Het maakt driedimensionale analyse en visualisatie mogelijk van organen en weefsels van bijvoorbeeld genetisch gemodificeerde muisembryo's of gemanipuleerde kippenembryo's. Het maakt ook analyse mogelijk van kankermodellen evenals biopsieën genomen uit menselijke of dierlijke weefsels. Het belangrijkste voordeel van HREM is dat het een eenvoudige manier biedt om stapels beelden te genereren die van bijna histologische kwaliteit zijn.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar het onderzoeken van wondgenezing door het gebruik van diermodellen, evenals het spinnen en herstellen van weefselpathologieën bij mensen. Het demonstreren van de procedure zullen BMR Marlene Rodler en Johannes Gunther zijn. Beiden komen van de Medical University of Vienna, Divisie van Anatomie.

Begin met vaste embryo's of embryonaal weefsel van niet groter dan 5 x 5 x 5 kubieke milliliters. Verwijder het fixeermiddel. En voeg PBS toe.

Was bij vier graden Celsius met constant schudden gedurende 24 uur. Voeg 70% ethanol toe aan de buisjes met het weefsel en plaats de monsters op een rotator bij vier graden Celsius. Na twee tot drie uur gaat u door met het dehydrateren van de monsters in ethanoloplossingen van toenemende concentratie gedurende twee tot drie uur per keer.

Terwijl de monsters dehydrateren, bereidt u de infiltratieoplossing voor door 0,3125 gram benzoylperoxide en 0,1 gram ESN toe te voegen aan 25 milliliter oplossing A in een beker. Roer op een magnetische roerplaat bij vier graden Celsius gedurende twee tot drie uur totdat de ESN en katalysator volledig zijn opgelost. Plaats de monsters in infiltratieoplossing.

En schud of draai de monsters gedurende 12 tot 24 uur bij vier graden Celsius. Begin met het bereiden van de inbeddingsoplossing. Voeg een milliliter oplossing B toe aan 25 milliliter verse infiltratieoplossing.

Na het bereiden van de gietvormen vult u de diepe holte van de mallen met inbeddingsoplossing. Breng de monsters over naar de mallen met behulp van een lepel. Zorg ervoor dat het monster volledig is bedekt met inbeddingsoplossing om luchtval te voorkomen.

Richt het monster binnen de mal met behulp van naalden of pincetten. Het is van cruciaal belang om de oriëntatie van het monster tijdens het inbedden te optimaliseren en om de precieze positie ervan op het blokoppervlak te markeren. Op deze manier kan het gebied van belang klein worden gehouden en kan het objectief met de hoogst mogelijke vergroting worden gebruikt.

Zodra de inbeddingsoplossing viskeus begint te worden, plaatst u een blokhouder op de mal en voegt u inbeddingsoplossing toe via het centrale gat van de blokhouder totdat de inbeddingsoplossing één tot twee millimeter boven de basis van de blokhouder stijgt. Verzegeld de gietvormen door deze te bedekken met vloeibare paraffinewas en wacht tot deze is uitgehard voordat u verder gaat. Laat de blokken de polymerisatie voltooien door de verzegelde gietvormen één tot twee dagen bij kamertemperatuur te bewaren.

Voor postpolymerisatiebewerking plaatst u de gietvormen met de gepolymeriseerde blokken in een standaard laboratoriumoven en bakt u ze gedurende minimaal één tot twee dagen op 70 tot 80 graden Celsius. Verwijder de blokken uit de mallen. Identificeer vervolgens het gezichtsveld door wit licht schuin op het blokoppervlak te richten.

Traceer de schaduw van het monster met de zwarte marker op het blokoppervlak. Monteer de harsblok met het aangegeven gezichtsveld op de microtoom en breng de blokhouder naar zijn stoppositie. Start de digitale camera en datageneratiesoftware en verwerf een livebeeld.

Kies een objectief met geschikte vergroting om het gebied van belang te bedekken. Beweeg de optica op en neer en de microtoom lateraal totdat het gebied van belang overeenkomt met het gezichtsveld dat op het computerscherm wordt weergegeven. Snijd het blok totdat de eerste structuren van het monster zichtbaar worden.

Verplaats de microtoom om het blokoppervlak in het brandpunt van de optica te rangschikken. Kies een sectiedikte tussen 0,5 tot vijf microns. Nadat u de software volgens de instructies van de fabrikant hebt ingesteld, start u de software en begint u met het vastleggen van gegevens.

Deze HREM-sectieafbeelding toont een sagittale doorsnede door een muisembryo dat werd geoogst op embryonale dag 9,5. Dit volume-rendered 3D-model toont het oppervlak van dit embryo. Deze afbeelding toont een virtuele sagittale doorsnede door een volume-rendered model van de nek van het muisembryo dat werd geoogst op embryonale dag 15,5.

Het oppervlakmodel benadrukt de lumina van het cardiovasculaire systeem in een volume-rendering van alle weefsels van een kippenembryo, een ontwikkelings Hamburger Hamilton Stage 18. Deze afbeelding toont een HREM-sectie door een menselijke zenuw. De inleg vergroot het gedeelte van deze afbeelding.

Deze afbeelding toont een deel van een HREM-sectieafbeelding door varkenslever. Deze afbeelding toont een volume-rendered 3D-model van een biopsie genomen van een menselijke duimpap. Deze afbeelding toont de oppervlakte gerenderde modellen van dermale slagaders, aders en zenuwen voor een virtuele resectie door HREM-gegevens.

Deze animatie toont een volume-rendered model van dikke huid van een menselijke duimpap. Verschillende drempels en dus verschillende dermale structuren, zoals bloedvaten, zenuwvezels, zweetklieren en de kanalen van zweetklieren. HREM maakt een snelle visualisatie van de architectuur van fibreus materiaal mogelijk.

Deze afbeelding toont een volume-rendered model van natuurlijk dermale vervangende materiaal. Deze animatie toont het volume-rendered model van dermale vervan