Beoordeling van menselijk vetweefsel microvasculaire functie met behulp van Videomicroscopy

Het algemene doel van deze videomicroscopietechniek is om de functionele eigenschappen van geïsoleerde microvaten te onderzoeken in reactie op farmacologische en fysiologische stimuli, om zo inzicht te krijgen in de pathofysiologie en moleculaire mechanismen die bijdragen aan vasculaire dysfunctie bij mensen. Deze methode is nuttig voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen die bijdragen aan dysfunctie van de lokale microvasculatuur binnen vetweefsel, wat in verband is gebracht met systemische ziekten. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat bloedvaten na verwijdering uit het menselijk lichaam gedurende een bepaalde periode functioneel blijven en eenvoudig kunnen worden onderzocht op hun fysiologische eigenschappen.

De klinische relevantie van deze experimentele aanpak is dat het ons in staat stelt om signaalpaden te identificeren die differentieel veranderd zijn bij ziektecondities en om potentieel nieuwe therapeutische doelwitten te ontdekken. Verwijder onder een dissectiemicroscoop met microschaartjes en micropincetten voorzichtig het omringende vet en bindweefsel van de kleine arteriolen binnen het vetweefselmonster. Het is essentieel om de arteriolen te onderscheiden van de venulen.

Arteriën hebben doorgaans een kleinere diameter, vertonen een hogere tonus en reageren robuuster dan venulen. Wanneer de arterie is geïsoleerd, gebruik nylon- of zijden hechtingen om eventuele zijtakken af te binden. Vul vervolgens de buisjes langzaam met verse Krebs-oplossing met behulp van een spuit van 10 milliliter.

Bevestig vervolgens rubberen slangetjes aan de drukreservoirs en de glazen capillaire pipetten in de kamer. Verplaats daarna de gedissecteerde arterie naar de orgaankamer en canuleer het vat op de glazen capillaire pipetten. Zet beide uiteinden van de arterie zorgvuldig vast op de pipetten met nylon hechtingen.

Zodra het vat is vastgezet, wordt de Krebs-buffer langzaam uit de kamer verwijderd en worden twee milliliters verse Krebs-oplossing aan de kamer toegevoegd. Bevestig vervolgens de organkamer aan de tafel van een omgekeerde microscoop die is uitgerust met een videocamera. Schakel de software voor randdetectie in met een bemonsteringsfrequentie van één kilohertz.

Sluit de resterende onder druk staande slang aan op het tweede met Krebs-oplossing gevulde drukreservoir en verbind vervolgens de drukreservoirs met de druktransducer. Wanneer alle slangen zijn aangesloten, wordt het verwarmingsblok ingesteld op 37 °C. Gebruik vervolgens de drukregeling om de intraluminale druk geleidelijk met 5 mmHg per vijf minuten te verhogen, om zo de juiste experimentele druk in het lumen van het geïsoleerde bloedvat te bereiken.

Laat het vat 20 tot 30 minuten equilibreren zodra de druk 60 millimeter kwik bereikt en noteer de diameter van de adipose arteriële vaat in rust. Aan het einde van de equilibratieperiode wordt het bloedvat vooraf geconstringeerd tot ongeveer 55% van de rustdiameter door elke vijf minuten één microliter endotheline 1 direct aan het bad toe te voegen, totdat de vatdiameter adequaat is geconstringeerd. Voor flow-geïnduceerde endotheelafhankelijke vasodilatatie wordt een continue flow in de intraluminale ruimte van de arterie geïnduceerd in gelijke en tegengestelde richtingen, zodat er een drukverschil over het vat kan ontstaan zonder de gemiddelde intraluminale druk van 60 millimeter kwik te wijzigen.

Meet na drie tot vijf minuten de stroomgestuurde dilatatie. Verhoog elke stap van de drukgradiënt met 10 centimeter water om de vijf tot zes minuten, tot een maximum van 100 centimeter water. Keer na het beoordelen van de stroomgestuurde vaatdilatatie de drukreservoirs terug naar dezelfde hoogte om de inductie van de stroom te stoppen.

Vervang vervolgens onmiddellijk, maar voorzichtig, de kameroplossing door verse Krebs-oplossing zonder de opgehangen arterie te verstoren, en laat het vat gedurende 20 tot 30 minuten terugkeren naar de basisdiameter. Zodra de arterie is teruggekeerd naar de rustdiameter, kan een subtiele, choline-gemedieerde endotheelafhankelijke vasodilatatie worden beoordeeld. Dit begint met het vooraf vernauwen van het vat tot ongeveer 55% van de rustdiameter met endotheline 1, zoals eerder aangetoond.

Zodra de preconstrictie is bereikt, worden twee microliter van toenemende doses acetylcholine direct aan het bad toegevoegd. Registreer de verandering in arteriële diameter vijf minuten na toediening van elke dosis. Na voltooiing van de dosis-respons van acetylcholine wordt de endothelium-onafhankelijke vasodilatatie en de levensvatbaarheid van het vat beoordeeld door de sequentiële toediening van papaverine en een endothelium-onafhankelijke vasodilator direct aan het bad.

Endotheelafhankelijke vasodilatatie-responsen op verhoogde flow en schuifspanning of acetylcholine zijn significant gedempt in viscerale ten opzichte van subcutane adipose arteriën bij menselijke obesitas. Endotheelonafhankelijke vasodilatatie als reactie op papaverine is echter niet differentieel gewijzigd tussen de twee vetweefsels, wat suggereert dat vasculaire dysfunctie in viscerale domeinen grotendeels het resultaat is van dysfunctie op het niveau van het endotheel, ten minste in de vroege stadia van de ziekte. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in drie tot vijf uur worden voltooid, mits correct uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de tijd te nemen en nauwkeurig te werken, aangezien zelfs kleine beschadigingen aan de bloedvaten de resultaten kunnen beïnvloeden. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals siRNA-transfectie van de bloedvaten, worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden over de impact van specifieke genen op de vasomotorische functie bij menselijke ziekten. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van vetweefselbiologie en microcirculatie om de impact van de micro-omgeving van het vetweefsel op de lokale vasculaire gezondheid bij menselijke obesitas te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u direct de pathofysiologie van volledige, intacte segmenten van menselijke bloedvaten kunt onderzoeken die zijn verwijderd bij levende proefpersonen, een proces dat niet kan worden gereproduceerd met niet-invasieve beeldvorming.