Beoordeling van menselijk vetweefsel microvasculaire functie met behulp van Videomicroscopy

Het algemene doel van deze videomicroscopietechniek is om de functionele eigenschappen van geïsoleerde microvaten te onderzoeken in reactie op farmacologische en fysiologische stimuli, waardoor inzicht wordt verkregen in de pathofysiologie en moleculaire mechanismen die bijdragen aan vasculaire disfunctie bij mensen. Deze methode is nuttig voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen die bijdragen aan disfunctie van de lokale microvaten binnen vetweefsel, wat in verband is gebracht met systemische ziekten. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat bloedvaten functioneel blijven na verwijdering uit het menselijk lichaam gedurende een bepaalde periode en gemakkelijk kunnen worden onderzocht op hun fysiologische eigenschappen.

De klinische relevantie van deze experimentele aanpak is dat het ons in staat stelt om paden te identificeren die differentieel zijn veranderd in ziekteomstandigheden en mogelijk nieuwe therapeutische doelen te ontdekken. Gebruik onder een weefseldissectiemicroscoop microschaar en microforceps om voorzichtig het omringende vet en bindweefsel van de kleine arteriën binnen het vetmonster te verwijderen. Het is essentieel om de arteriën te onderscheiden van de venulen.

Arteriën zijn doorgaans kleiner in diameter, vertonen een grotere toon en reageren robuuster dan venulen. Wanneer de ader is geïsoleerd, gebruik nylon of zijden naden om eventuele takken af te binden. Gebruik vervolgens een spuit van 10 milliliter om de buis langzaam te vullen met verse Krebs-oplossing.

Verbind vervolgens rubberen buizen naar de drukreservoirs en glazen capillaire pipetten in de kamer. Verplaats vervolgens de gedissecteerde ader naar de orgaankamer en canuleer het vat op de glazen capillaire pipetten. Bevestig voorzichtig beide uiteinden van de ader op de pipetten met nylon naden.

Zodra het vat vastzit, verwijder langzaam het Krebs-buffer uit de kamer en voeg twee milliliter verse Krebs-oplossing toe aan de kamer. Verbind vervolgens de orgaankamer aan de trap van een omgekeerde microscoop uitgerust met een videocamera. Schakel de randdetectiesoftware in op een bemonsteringssnelheid van één kilohertz.

Verbind de resterende onder druk staande buis naar het tweede met Krebs-oplossing gevulde drukreservoir en verbind vervolgens de drukreservoirs naar de druktransducer. Wanneer alle buizen zijn aangesloten, stel de verwarmingsblok in op 37 graden Celsius. Gebruik vervolgens de drukontroleenheid om de intraluminale druk geleidelijk te verhogen tot vijf milliliter kwik elke vijf minuten om de juiste experimentele druk in het lumen van het geïsoleerde bloedvat te bereiken.

Laat het vat 20 tot 30 minuten gelijkwaardig worden nadat de druk 60 milliliter kwik bereikt en noteer de diameter van de vetader in rust. Aan het einde van de gelijkwaardigmakingsperiode, pre-constricteer het bloedvat tot ongeveer 55%van de rustende basislijndiameter door elke vijf minuten een microliter endotheline 1 rechtstreeks toe te voegen aan het bad totdat de vatdiameter adequaat is vernauwd. Voor stroming-geïnduceerde endotheelafhankelijke vasodilatatie, induceer continue stroming in de intraluminale ruimte van de arterie in gelijke en tegengestelde richtingen zodat een drukverschil kan worden ontwikkeld over het vat zonder de gemiddelde intraluminale druk van 60 millimeter kwik te veranderen.

Na drie tot vijf minuten meet u de stroming-gemedieerde dilatatie. Verhoog elk increment van drukgradiënt met een verandering van 10 centimeter water elke vijf tot zes minuten tot een maximum van 100 centimeter water. Na het beoordelen van de stroming-gemedieerde vatdilatatie, brengt u de drukreservoirs weer naar dezelfde hoogte om de inductie van stroming te stoppen.

Vervolgens, maar voorzichtig, vervangt u de kameroplossing onmiddellijk door verse Krebs-oplossing zonder het gesuspendeerde vat te verstoren en laat u het vat beginnen met terugkeren naar de basislijndiameter gedurende 20 tot 30 minuten. Zodra het vat is teruggekeerd naar de rustende basislijndiameter, kan een subtiele choline-gemedieerde endotheelafhankelijke vasodilatatie worden beoordeeld. Dit begint met het pre-constricteren van het vat tot ongeveer 55%van zijn rustende diameter met endotheline 1, zoals eerder aangetoond.

Eenmaal pre-constrictie is bereikt, voegt u twee microliters van toenemende doses acetylcholine rechtstreeks toe aan het bad. Noteer de verandering in arteriële diameter vijf minuten na toediening van elke dosis. Na voltooiing van de acetylcholine dosisrespons, beoordeelt u de endotheelonafhankelijke vasodilatatie en vatlevensvatbaarheid door de sequentiële toediening van papaverine en endotheelonafhankelijke vasodilatator rechtstreeks aan het bad.

Endotheelafhankelijke vasodilatatiereacties op verhoogde stroming en schijnbare stress of acetylcholine zijn significant verminderd in viscerale versus subcutane vetvaten bij menselijke obesitas. Endotheelonafhankelijke vasodilatatie in reactie op papaverine is echter niet differentieel veranderd tussen de twee vetweefsel, wat suggereert dat vasculaire disfunctie in viscerale domeinen grotendeels het resultaat is van disfunctie op het niveau van het endotheel, althans in de vroege stadia van de ziekte. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in drie tot vijf uur worden voltooid, indien correct uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de tijd te nemen en nauwkeurig te zijn, omdat zelfs kleine schade aan de bloedvaten de resultaten kan vervormen. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals siRNA-transfectie van de bloedvaten worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de invloed van specifieke genen op vasomotorische functie bij menselijke ziekte. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van vetweefselbiologie en microcirculatie om de invloed van de vetweefselmicro-omgeving op de lokale vasculaire gezondheid bij menselijke obesitas te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de pathofysiologie van hele intacte segmenten van menselijke bloedvaten, die zijn verwijderd uit levende subjecten, rechtstreeks kunt onderzoeken, een proces dat niet kan worden gerepliceerd door niet-invasieve beeldvorming.