Name: De aorta Ring mede cultuur Assay: Een handig hulpmiddel om te beoordelen van het potentieel van de Angiogenic van mesenchymale stromale cellen In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Leer de aorta ring co-cultuur assay om het angiogene potentieel van mesenchymale stromale cellen te evalueren. Deze methode biedt betrouwbare inzichten voor regeneratieve geneeskunde en ischemische ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs danken de volgende personeelsleden en onderzoek personeel: Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai en Sarah Laronde.

alle studies waarbij dieren werden uitgevoerd en gerapporteerd overeenkomstig ARRIVE richtsnoeren 29. Alle studies werden uitgevoerd met institutioneel onderzoek ethiek bestuur goedkeuring (REB nummer 4276). Alle dier procedures werden goedgekeurd door het Comité zorg dier van het University Health Network (Toronto, Canada), en alle dieren ontvangen humane zorg met inachtneming van de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, 8 th edition) Nationale instituten van gezondheid 2011).
 1. aorta Ring Assay Setup <ol><li>isolaat de rat aorta.
	<ol><li>Euthanaseren 8 - 10 weken oude Sprague-Dawley ratten met behulp van CO 2 stikken: Set CO 2 kamers tot 20% gas vervanging (debiet = 0,2 x kamer volume/min). Bevestigen door de afwezigheid van snuifje reflex en hart beats door de Palperende borst.</li>
		<li>Natte vacht op de borst gebied met gesteriliseerd gaas met 70% ethanol. Gesteriliseerde pincet en schaar gebruik te maken van een sneetje in de borst middellijn en dwars door lagen van de huid en spier.</li>
		<li>Zodra de ribbenkast is blootgesteld, knip de ribbenkast aan weerskanten en vouw naar boven ongeveer 5 mm van het borstbeen aan elke kant. Sommige bloeden wordt verwacht van intercostale slagaders in verse kadavers.</li>
		<li>Duwen het longweefsel en het hart naar de anatomische rechterzijde naar de aorta bloot. De aorta is de witte gekleurde vaartuig gelegen grenzend aan de wervelkolom.</li>
		<li>Gebruik pincet te knijpen van de aorta (na de aortaboog) en chirurgische schaar gebruik te maken van de eerste snede terwijl de aorta met een tang. Bij het snijden van de aorta, de borstholte zal snel vullen met bloed, daarom is het essentieel om snel om te verkrijgen van de aorta vóór de bloedstolling.</li>
		<li>Gebruik pincet te houden van de aorta en schil voorzichtig de aorta naar beneden, weg van de wervelkolom. De trek zal de intercostale slagaders zonder verdere insnijdingen verbreken. Ongeveer 10 cm van weefsel en/of verkrijgen voordat de aorta verdeeld in twee takken in de buikholte en snijd de aorta uit het karkas. Druk op het middenrif als nodig om de caudal richting te krijgen toegang tot de lagere delen van de aorta. 
		Opmerking: Schil de aorta voorzichtig omdat intens kracht kan daardoor te scheuren. Als de tranen van de aorta, toestaan bloedstolling voor een paar seconden en gebruik van een papieren handdoek te verwijderen van het gestold bloed, waardoor de zichtbaarheid van de resterende aorta.</li>
		<li>Plaatst de aorta in een tube van 15 mL met 10 mL ijskoud Hank &#39; s evenwichtig zout oplossing (HBSS) aangevuld met 1% penicilline/streptomycine (P/S). Houd de buizen op ice. 
		Opmerking: De aorta weefsel kan duren 1-2 h op ijs maar het is best om het zo snel mogelijk verwerken.</li>
	</ol></li> <li>Bereiden de aorta ring assay voedingsbodems in een steriele bioveiligheid kabinet (BSC).
	<ol><li>Voorbereiden het endotheel groeimedium (BAVA) met behulp van een filtratie-eenheid voor het filteren van 500 mL Endothelial basaal Medium (EBM) aangevuld met 2% foetale boviene Serum (FBS), 1% gentamicine en groeifactoren (Zie Tabel van materialen). Breng 50 mL van de gefilterde media in een kraal of water bad op 37 ° C.</li>
		<li>Gebruiken een andere filtratie eenheid voor het filteren van 100 mL van EBM aangevuld met 2% FBS en 1% P/S tot bereid de EBM 2% FBS (EBM-FBS) en bewaren bij 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>12-well weefselkweek platen met basale membraan Extract (BMT) jas tijdens het werken op het ijs.
	<ol><li>Plaats een 12-well-plaat op een koud oppervlak (grote zak ijs of lade). Voeg 200 µL per putje van het gebruik van vers ontdooid BME gekoeld Pipetteer tips en swirl de BMT om ervoor te zorgen zelfs coating. Werk snel om te voorkomen dat ongelijke polymerisatie van de BMT. 
		Opmerking: Een typische aorta excisie levert 20 aorta ringen. Ter verantwoording voor de variabiliteit tussen de aorta ring testen, ten minste drie aorta ring testen per behandeling groep instellen en een besturingselement bevatten. Als de bron toelaat, 6 ringen per groep van de behandeling is het raadzaam.</li>
		<li>Plaatst de gecoate platen in bevochtigde incubators (37 ° C, relatieve vochtigheid van 95%, 5% CO 2; deze voorwaarden van toepassing op alle bevochtigde incubator stappen hierna) voor 30 min. plaats 1.000 µL Pipetteer tips terug in-20 ° C voor stap 1.5.3. 
		Opmerking: Terwijl het basale membraan extract in voorraad concentratie wordt gebruikt, de samenhang en de stijfheid wordt strikt gecontroleerd door de polymerisatie-tijd. Zorg ervoor om te houden van de exacte dezelfde polymerisatie tijden voor alle parallellen en onafhankelijke experimenten.</li>
	</ol></li> <li>Sectie van de aorta in uniforme ringen.
	<ol><li>Neem de aorta uit de buis 15 mL en plaats het in een 10 cm schotel met 10 mL verse HBSS aangevuld met 1% P/S.</li>
		<li>Gebruiken twee sets van de verlostang om te scheiden zorgvuldig de overtollige bindweefsel, vetweefsel en gebruik een scalpel voor de resterende takken van de intercostale slagaders op de aorta aangesloten. Dit vermindert de variabiliteit tussen de ring projectoren op basis van verschillende niveaus van het resterende weefsel. Verwijder eventuele resterende gecoaguleerd bloed van binnenkant van de aorta.</li>
		<li>Plaats een liniaal of een raster onder de 10 cm schotel precies snijden 1-2 mm brede lagen van de aorta met steriel scalpel en pincet. Snijd de secties zo nauwkeurig mogelijk reduceren van variabiliteit tussen eenheden.</li>
	</ol></li> <li>De aorta ringen insluiten in BME. 
	Opmerking: Als het segmenteren van aorta ringen is niet voltooid vóór BME polymerisatie incubatie, verwijder de gecoate platen uit bevochtigde starterscentra en voeg 100 µL van EBM aan elk putje te beëindigen van de polymerisatie. Exacte timing is van cruciaal belang als overmatige polymerisatie van BME met de endothelial netwerk ontwikkeling en cel migratie interfereren kan. Zodra de aorta ringen zijn voorbereid, verwijdert u de EBM de putjes en verder vanaf stap 1.5.2.
	<ol><li>De BME gecoat putten uit de bevochtigde incubators verwijderen en terugkeren naar het Comité voor Bankentoezicht.</li>
		<li>Zorgvuldig halen individuele aorta ringen met een tang en plaats een in het midden van elk putje BME-gecoat. Herhaal dit voor de resterende aorta ringen. 
		Opmerking: Media overgedragen samen met de aorta ring moet worden bewaard teneinde polymerisatie onregelmatigheden minimale.</li>
		<li>Gebruik gekoeld (-20 ° C) 1.000 µL Pipetteer tips om Voeg 300 µL van BMT bovenop elke aorta ring en verdeel de BMT naast de waterput.</li>
		<li>De ingesloten aorta ringen tot de bevochtigde incubators voor 30 min. terug</li>
		<li>Verwijderen van de platen met de ingesloten aorta ring uit de bevochtigde incubators en voeg langzaam 1.000 µL van BAVA (bereid en verwarmde op stap 1.2.1) door het plaatsen van de pipet tip tegen de muur van de cultuur goed. 
		Opmerking: Direct pipetteren de media op de BMT kan verstoren de gepolymeriseerde BMT en continu endothelial netwerk ontwikkeling belemmeren. Gebruik een passende meerkanaalspipet indien beschikbaar.</li>
		<li>Na 24 h, 1.000 µL van BAVA verwijderen en te vervangen met 1.000 µL van EBM-FBS bereid in stap 1.2.2, opnieuw door langzaam pipetteren tegen de zijkant van de cultuur goed.</li>
	</ol></li> <li>De aorta ring bepaling handhaven door te vervangen door 500 µL van EBM-FBS 500 µL van verse EBM-FBS (37 ° C) elke 48 h. 
	Opmerking: Zie section 2 om te beginnen met de uitbreiding van de cultuur MSC op dezelfde dag als de aorta ring assay vestiging. Dit zal ervoor zorgen dat MSCs klaar voor co cultuur wanneer het endotheel netwerken klaar zijn.</li>
	<li>Gebruiken de heldere veld microscopie te volgen van de ontwikkeling van het endotheel netwerk van de assay van aorta ring (Zie Figuur 1 als referentie voor de ontwikkeling van optimale netwerk). Zodra het endotheel netwerken aspect zoals afgebeeld in Figuur 2 is, gaat u verder met het opzetten van de aorta ring assay-MSC co culturen (sectie 3). Verwijzen naar stap 4.1 voor meer informatie van het endotheel netwerken imaging.</li>
</ol> 2. Weefselkweek <ol><li>voorraadoplossingen van het voorbereiden van weefselkweek media.
	<ol><li>Cultuur FTM HUCPVCs (eerder gevestigde, n &#8805; 3 onafhankelijke lijnen voor elk) 30 en verkrijgbare BMSCs in alpha-MEM aangevuld met 10% FBS en 1% P/S.</li>
		<li>De media met behulp van 0,2 µm porie-grootte filter flessen steriliseren.</li>
		<li>Slaan de bereid mediaoplossingen bij 4 ° C voor maximaal 3 weken.</li>
	</ol></li> <li>Handhaven FTM HUCPVC en BMSC culturen in bevochtigde voorbroeders en doorsnede(n) ter 70-80% confluentie bepaald door de fase contrast microscopie. Gebruik geschikte volumes van media voor de grootte van weefselkweek schotel gebruikt (dat wil zeggen 10 mL in een 10 cm schotel). Gebruiksvoorwaarden van deze cultuur voor het behoud en de MSCs passaging.</li>
	<li>Distantiëren de MSC monolayers voor passaging of aorta ring assay-MSC mede culturen met behulp van een dissociatie enzym oplossing (4 mL/10 cm schotel) en broeden in de bevochtigde incubators voor 3 min. Zorg ervoor detachement van de cellen met behulp van lichte veld microscopie; broeden voor een extra 1-2 min desgewenst.</li>
	<li>Transfer van de gedissocieerde cellen in een tube van 15 mL en centrifuge bij 400 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Gecombineerd de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de cel pellet en resuspendeer de cellen in 1 mL van een geschikte kweekmedia (alpha-MEM volledige media voor passaging van cellen of EBM-FBS voor aorta ring assay/MSC co culturen) voor het tellen van de met behulp van een cel counter.</li>
</ol> 3. Voorbereiding van de aorta Ring Assay/MSC co culturen <ol><li>zaad 10 4 MSCs op elk ingesloten aorta ring (9.000 cellen/cm 2 / 12-well-plate). Op basis van het aantal aorta ring testen, vlek vooraf de MSCs met levensvatbare, niet-overdraagbaar fluorescente kleurstof. Ten minste drie putten van aorta ringen zonder MSCs voor een groep besturingselementen handhaven.
	<ol><li>10 5 MSCs/mL EBM-FBS media vlek, voeg 2.5 µL van levensvatbare, niet-overdraagbaar fluorescerende kleurstof/mL media (5 µM) in een tube van 15 mL en de plaats in de bevochtigde incubator voor 30 min. zachtjes Meng de buis halverwege de incubatie.</li>
		<li>Volgende de 30 min incubatie, 1 deel vers EBM-FBS aan de gekleurde cellen toevoegen en bij 400 x g gedurende 5 min. draaien</li>
		<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 1 mL van EBM-FBS media. Bevestig succesvolle kleuring van de MSCs met behulp van fluorescentie microscopie.</li>
	</ol></li> <li>Verwijderen van de aorta ring-bevattende platen uit de bevochtigde incubator en 500 µL van EBM-FBS verwijderen uit elk putje.</li>
	<li>Zaad 10 4 MSCs in 500 µL van EBM-FBS op elk ingesloten aorta ring zorgvuldig door gelijkmatig pipetteren rond het endotheel netwerken. Zorgen voor gelijkmatige verdeling door zachtjes schudden de cultuur-plaat.
	<ol><li>Toevoegen extra EBM-FBS om ervoor te zorgen dat het totale volume van de media op de aorta ring assay/MSC co culturen 1.000 µL.</li>
	</ol></li> <li>Fluorescentie microscopie gebruiken om te visualiseren de fluorescently geëtiketteerde MSCs in de aorta ring assay.</li></ol>
 4. microscopie <ol><li>gebruik helder-veld microscopie om het imago van de rat endothelial netwerken voorafgaand aan de aorta ring assay/MSC mede culturen voor basislijnmetingen (dag 0) van endothelial netwerkeigenschappen (b.v., netwerk lengte, netwerk loops). Afbeelding 4 kwadranten per putje van de aorta ring aan de verst sectie van het endotheel netwerk binnen het desbetreffende kwadrant.
	<ol><li>Afbeelding de aorta ring-netwerken na de aorta ring culturen assay/MSC samen op dag 3, 5 en 7. Gebruik van deze beelden te kwantificeren van het MSC-effect op de ontwikkeling van het endotheel netwerk.</li>
	</ol></li> <li>Fluorescentie microscopie gebruiken om het imago van vooraf gelabelde MSCs in de aorta ring test.
	<ol><li>Volgende 24 h van aorta ring assay/MSC co culturen, gebruiken fluorescentie microscopie te visualiseren MSC homing, rek en integratie met de endothelial netwerken. De fluorescerende beelden van MSCs met de beelden van de heldere veld van endotheliale cellen te observeren de colocalization van beide soorten cellen overlappen.</li>
		<li>Beeld van de MSCs gelokaliseerd in het proximale aan de aorta ring weefsel ontwikkelde endothelial vervoersnet en de MSCs gelokaliseerd binnen de nieuwe ontwikkeling van netwerken distale aan de aorta ring weefsel ( Figuur 2).</li>
	</ol></li></ol> 5. Stroom Cytometry en qPCR <ol><li>een dag voorafgaand aan distantiëren van de aorta ring endothelial netwerken, ontdooien bevroren dispase bij 4 ° C O/N. punt 5.3 is identiek voor zowel qPCR als stroom cytometry.</li>
	<li>50 mL dispase en 50 mL 0,5% trypsine in de kraal of water bad 37 ° C warm.</li>
	<li>Halen de cellen voor de analyse van de aorta ring assay/MSC co culturen.
	<ol><li>Na 1 week van aorta ring assay/MSC co cultuur, verwijder het medium van de cultuur en voeg vervolgens 1 mL van Phosphate-Buffered zoutoplossing (PBS) langzaam aan elk goed voor 3 min en verwijderen. Herhaal dit twee keer meer wassen.</li>
		<li>Voeg 800 µL van vooraf opgewarmd dispase aan elk putje en broeden in de bevochtigde incubators gedurende 15 minuten</li>
		<li>Verwijderen van de platen uit de bevochtigde incubators en schorten dispase door (5-10 x) om te breken met de BMT pipetteren en breng de inhoud van elk putje in aparte 15 mL tubes.</li>
		<li>Herhaal stap 5.3.3 weer met frisse voorverwarmde dispase tot geen resterende BME wordt waargenomen in de cultuur goed. Voeg 1 deel van PBS aangevuld met 3% FBS tot de schorsing van de dispase-cel aan de inactivering van het dispase. Verwijderen van de aorta ringen drijvend in de celsuspensie met behulp van tips van de pipet.</li>
		<li>Draaien de cel schorsingen op 400 x g voor 5 min. verwijderen het supernatant zorgvuldig, 3 mL celsuspensie verlaten in de tube van 15 mL. 
		Opmerking: Een duidelijke, solide pellet wellicht niet zichtbaar maar cellen en BMT aanwezig zijn.</li>
		3 mL trypsine van 0,5% voorverwarmde toevoegen <li>aan de celsuspensie en krachtig resuspendeer (5-10 x door pipetteren) cellen. Incubeer de trypsinized cel-oplossingen in de bevochtigde incubators voor 10 min.</li>
		<li>Verwijderen van de trypsinized cel schorsingen van bevochtigde starterscentra en voeg 6 mL PBS aangevuld met 3% FBS en resuspendeer een paar times. De cel schorsingen bij 400 x g gedurende 5 min. draaien</li>
		<li>Zorgvuldig verwijderen van alle de bovendrijvende vloeistof, waardoor de cel pellet in de buis en resuspendeer de cellen in 1 mL PBS aangevuld met 3% FBS in elke buis.</li>
		<li>Filteren de 1 mL celsuspensie, met behulp van een 70 µm cel zeef samengevoegde cellen en resterende BME verwijderd met de celsuspensie. De cellen in 1 mL celsuspensie, met behulp van een cel counter tellen.</li>
	</ol></li> <li>De cellen voorbereiden stroom cytometry.
	<ol><li>Incubate de cel schorsingen (10 5 cellen in 200 µL PBS aangevuld met 3% FBS) met fluorophore-geconjugeerde (FITC of APC) primaire antilichamen (TRA-1 - 85-, CD146, CD31) concentratie = 1:40) bij 4 ° C gedurende 30 minuten, beschermd tegen licht. 
		Opmerking: Stroom cytometry voor MSCs is geoptimaliseerd door Hong et al., 2013 28. Minimaal 10.000 cellen is vereist voor nauwkeurige lezingen.</li>
		<li>Na de 30 min incubatie, resuspendeer de cellen in 2 mL PBS aangevuld met 3% FBS en centrifuge (400 x g, 5 min).</li>
		<li>Houden cellen bij 4 ° C beschermd tegen licht tot analyseren door stroom cytometry (minstens 1 x 10 4 gebeurtenissen) binnen 1 uur. Zie voor de gating strategie, aanvullende figuur 1. Sorteren van menselijke MSCs met behulp van anti-TRA-1-85 (APC) (concentratie: 1:40 en 0,5% FBS/PBS) en sorteren van cellen in 350 µL van lysis van de cel buffer p.a. qPCR. 
		Opmerking: Lysed cellen kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C voor maximaal 3 maanden voor de analyse van de toekomstige qPCR.</li>
	</ol></li> <li>QPCR analyse voorbereiden op de cellen.
	<ol><li>Isoleren van RNA van lysed cellen met behulp van kolom gebaseerde RNA isolatie kits en de concentratie van RNA en de kwaliteit bepalen.</li>
		<li>Voorbereiden cDNA van maximaal 5 µg RNA per 100 µL reverse-transcriptase reactie. Een versterking van de pre-stap uitvoeren wanneer het rendement van RNA laag is (&#60; 10 ng/µL). Gebruik van minder dan 100 ng van RNA zal resulteren in een hoge mate van valse negatieven. 
		Opmerking: De cDNA-sjablonen kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C voor verdere analyse voor maximaal 4 maanden.</li>
		<li>De qPCR met behulp van angiogenese expressie profiler arrays om de opsporing van wijzigingen in genexpressie uitvoeren Gebruik 5 ng van cDNA per reactie (40 cycli, 60 ° C gloeien/uitbreiding van de temperatuur). Uitdrukkelijke vouw verandering van meningsuiting t.o.v. ongedifferentieerde MSC afgeleid cDNA monsters. Voer de juiste negatieve controles (aorta ring zonder menselijke MSCs).</li>
	</ol></li></ol> 6. Netwerk van kwantificering volgende aorta Ring Assay/MSC co culturen <ol><li>imaging software downloaden zoals ImageJ samen met angiogenese Analyzer plugin 31.</li>
	<li>De opnamen van de endothelial netwerk importeren en het openen met behulp van de software.</li>
	<li>Converteren van de afbeelding schalen op basis van de specificaties van de Microscoop gebruikt.</li>
	<li>Gebruiken een lineaire instrument voor het meten van de groei van de radiale netwerk.</li>
	<li>Rekenen de lussen van de endothelial netwerk met behulp van de mobiele teller tool (lussen met ten minste 4 zijden moeten worden gekwantificeerd).</li>
	<li>Voor extra kwantificering van netwerkeigenschappen, gebruik de angiogenese Analyzer plugin of andere soortgelijke plugins voor het analyseren van meester segmenten, totale segment lengte, totale netwerkgebieden en aantal kruispunten. Gebruik het gereedschap wazig masker te vervagen aorta ring weefsel en lege ruimtes om te voorkomen dat valse positieve berekeningen.</li>
	<li>De waarden overbrengen in een statistieken programma en grafiek endothelial netwerkeigenschappen na de aorta ring assay/MSC co culturen.</li>
</ol>

<ol><li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146 (6), 873-887 (2011).</li>
<li>Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15602010">Vascular endothelial growth factor and angiogenesis.</a> Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).</li>
<li>Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+progress+and+prospects%3A+therapeutic+angiogenesis+for+limb+and+myocardial+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia.</a> Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).</li>
<li>Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+studies+of+angiogenic+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Human studies of angiogenic gene therapy.</a> Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).</li>
<li>Chu, H., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+angiogenesis%3A+controlled+delivery+of+angiogenic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Deliv%22%5BJournal%5D)">Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors.</a> Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).</li>
<li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+angiogenesis+for+ischemic+disorders%3A+what+is+missing+for+clinical+benefits%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Discov+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits?</a> Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).</li>
<li>Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+growth+factor+delivery+for+therapeutic+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis.</a> J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).</li>
<li>Bergers, G., Song, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+pericytes+in+blood-vessel+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance.</a> Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).</li>
<li>Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapy+for+vascular+regeneration%3A+adult%2C+embryonic%2C+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells.</a> Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).</li>
<li>Sieveking, D. P., Ng, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapies+for+therapeutic+angiogenesis%3A+back+to+the+bench%5BTitle%5D)+AND+%22Vasc+Med%22%5BJournal%5D)">Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench.</a> Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).</li>
<li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).</li>
<li>Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+assays%3A+a+critical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis assays: a critical overview.</a> Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).</li>
<li>Tahergorabi, Z., Khazaei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+angiogenesis+and+its+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Iran+J+Basic+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">A review on angiogenesis and its assays.</a> Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).</li>
<li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+cell+tube+formation+assay+on+basement+membrane+turns+20%3A+state+of+the+science+and+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art.</a> Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).</li>
<li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+angiogenesis%3A+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16989723">In vivo models of angiogenesis.</a> J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).</li>
<li>Nicosia, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aortic+ring+model+of+angiogenesis%3A+a+quarter+century+of+search+and+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery.</a> J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).</li>
<li>Baker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+mouse+aortic+ring+assay+to+study+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis.</a> Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+protein+%28Canopy+2%2C+CNPY2%29+enhances+angiogenesis+and+promotes+smooth+muscle+cell+migration+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation.</a> Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).</li>
<li>Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geraniol+Suppresses+Angiogenesis+by+Downregulating+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+%28VEGF%29%2FVEGFR-2+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling.</a> PLoS One. 10 (7), e0131946(2015).</li>
<li>Masson, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Aortic+Ring+Assay%3A+A+New+Approach+of+the+Molecular+Genetics+of+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis.</a> Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).</li>
<li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mesenchymal+stem+cells+for+tissue+engineering+versus+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine.</a> J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).</li>
<li>Caplan, A. I., Dennis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+as+trophic+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells as trophic mediators.</a> J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).</li>
<li>Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells%3A+new+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells: new directions.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).</li>
<li>Kilroy, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+profile+of+human+adipose-derived+stem+cells%3A+expression+of+angiogenic%2C+hematopoietic%2C+and+pro-inflammatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors.</a> J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).</li>
<li>Tang, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+action+enhances+the+effects+of+autologous+mesenchymal+stem+cell+transplantation+on+vascular+regeneration+in+rat+model+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Thorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction.</a> Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).</li>
<li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+MSCs+are+pericytes%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">All MSCs are pericytes?</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).</li>
<li>Hong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+human+umbilical+cord+perivascular+cells%3A+molecular+and+fate+potential+changes+during+gestation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation.</a> Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+The+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).</li>
<li>Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+propagation%2C+and+characterization+of+human+umbilical+cord+perivascular+cells+%28HUCPVCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs).</a> Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+angiogenic+response+of+the+aorta+to+injury+and+inflammatory+cytokines+requires+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages.</a> J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).</li>
</ol>

Dr. Clifford L. Librach is medehouder van het octrooi: methoden van isolatie en het gebruik van cellen die zijn afgeleid van de eerste trimester navelstreng weefsel. Verleend in Canada en Australië.

Er zijn verschillende kritieke fasen in het opzetten van een succesvolle aorta ring assay MSC co cultuur experiment. Ten eerste, de belangrijkste stappen bij het isoleren en segmenteren van de aorta zijn: 1) verkrijgen van uitsluitend het thoracale segment van aorta; 2) zorgvuldig verwijderen vertakkende bloedvaten, bindweefsel en vetweefsel en; 3) snijden zelfs secties van de aorta (~ 1 mm) te beperken van variabiliteit tussen elke bepaling. Ten tweede, de succesvolle inbedding van aorta ringen in BMT is essentieel voor...

Het complexe proces van angiogenese verbetert en onderhoudt perfusie van het weefsel door het stimuleren van nieuw bloed vaartuig ontwikkeling van reeds bestaande therapieën1. Het is een stevig gereglementeerde, evenwichtige proces door pro-angiogenic en anti-angiogenic factoren. Elke tekortkoming in dit systeem kan leiden tot onvoldoende schip onderhoud of groei, waardoor ernstige ischemische ziekten met inbegrip van het myocard en vaatziekten, beroerte en neurodegeneratieve aandoeningen. Echter is overdreven vasculaire ontwikkeling kenmerkend voor aandoeningen zoals kanker en inflammatoire aandoeningen,2.
Het ontwikkelen van therapieën die gericht zijn op het bepalen van de angiogenese om gunstige weefselregeneratie is van cruciaal belang. Ondanks uitgebreide preklinische en klinische onderzoeken, zijn pogingen ter stimulering van de angiogenese met behulp van pro-angiogenic factoren en microRNAs mislukt om de gewenste resultaten3,4,5. Mogelijke redenen voor de tijdelijke effecten omvatten: beperkte levensduur van angiogenic proteïnen en nucleïnezuren, en het eindige aantal gerichte groeifactoren6,7. Hoewel oplosbaar angiogenic factoren essentieel zijn voor het initiëren van angiogenese, afhankelijk het onderhoud en de functionaliteit van therapieën van ondersteuning van celtypen, met inbegrip van pericytes en gladde spier cellen8. Het gebied van pro-angiogenic therapieën onderzoekt nu potentiële stamcellen en progenitor cel bronnen waarmee angiogenic factoren lokaal, terwijl het fysiek ondersteunen van nieuw ontwikkelde therapieën, zelf vernieuwen of zelfs differentiëren in Endotheel-achtige cellen9,10. Het vinden van de optimale angiogenic celtypes met het vermogen om te voldoen aan deze functionele eisen houdt een grote belofte voor ischemische weefselregeneratie.
Om met succes vertalen potentiële cel-gebaseerde therapieën in de klinische proeven, moeten pre-klinische studies hun doelmatigheid aan te tonen en markeer de onderliggende mechanismen van de angiogenic. Ondanks het grote aantal gevestigde angiogenese testen, ontbreekt het veld een "gouden standaard" in vitro -assay die betrouwbaar kunt het evalueren van de werkzaamheid van potentiële kandidaat-cel typen11,12, 13. meeste in vitro angiogenese testen (met inbegrip van het endotheel proliferatie, migratie en buis vorming testen) meestal beoordelen de effecten van cellen of verbindingen op de endotheliale cellen phenotypical wijzigingen of differentiatie in buisvormige en netwerk structuren14,15. Terwijl deze functies essentieel voor angiogenese zijn, een 'vertaalbare ' redactionele assay ook moet evalueren: 1) de vergroting of de vervanging van de ondersteunende celtypen, met inbegrip van pericytes of zachte spiercellen, 2) de verwerking van ECM en/of kelder membraan, en 3). de efficiëntie ter bevordering van de vorming van functionele microvasculature. In vivo angiogenese-modellen, met inbegrip van de cornea assay en Matrigel plug assay, de unieke in-vivo -communicatie recapituleren maar worden uitgedaagd door de moeilijkheid van tracking toegediend cellen te observeren van de fysieke interacties. Bovendien, in in-vivo modellen, xeno-immuun afwijzing kan optreden tijdens het testen van potentiële allogene cel therapie kandidaten16. Ex vivo angiogenese-modellen, met name de bepaling van de aorta ring kan bieden: 1) gemakkelijk observatie en kwantificering van buisvormige structuren, 2) accessoire ondersteunende cellen, 3) ECM van host en kunstmatige leveringen, 4) uitsluiting van inflammatoire onderdelen en 5) snelle en goedkope setup17,18. Typisch, de aorta ring test kunt testen het angiogenic potentieel van kleine secretoire eiwitten, farmacologische agenten en transgene knaagdieren modellen19,20,21.
MSCs zijn veelbelovende kandidaten voor vasculaire regeneratie voornamelijk via hun paracrine-gemedieerde effecten22,23,24. MSCs is aangetoond dat ze afscheiden van belangrijke angiogenic factoren, met inbegrip van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), Hepatocyte Growth Factor (HGF), insuline-like Growth Factor-1 (IGF-1), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) en angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26. MSCs kunnen ook detecteren en thuisbasis van ischemische of ontstoken weefsels, echter, de precieze mechanismen zijn nog onderzocht. In toenemende mate ondersteunt de literatuur de hypothese dat de meeste MSCs uit gerelateerde cellen voortvloeien, mede express pericyte markeringen en zich zoals pericytes27 gedragen kunnen. HUCPVCs zijn een jonge bron van MSCs afgeleid van de gerelateerde regio van de menselijke navelstreng. Zij vertegenwoordigen een bevolking van MSCs met pericyte-achtige eigenschappen en van FTM zowel term umbilical koorden gekenmerkt. FTM HUCPVCs tonen een hoge expressie van pericyte markers, met inbegrip van CD146 en NG2, hoge proliferatieve en multilineage potentieel, immuun-bevoorrechte eigenschappen, en een robuuste paracrine profiel28weer te geven. FTM HUCPVCs zijn een ideale kandidaat celtype ter bevordering van de regeneratie van de gewonde weefsel door het bevorderen van nieuwe therapieën via hun pericyte-achtige eigenschappen.
Om te testen het angiogenic potentieel en de pericyte-achtige eigenschappen van menselijke MSCs, zijn een zeer beperkt aantal angiogenese testen beschikbaar wanneer positieve angiotropic migratie (hierna te noemen "homing"), ECM, verwerking en ontwikkeling van fysieke interacties tussen celtypes kunnen worden onderzocht, terwijl het verkrijgen van kwantitatieve gegevens over de ontwikkeling van de microvasculature.
Hierbij presenteren wij een protocol dat wordt een nieuwe toepassing van de aorta ring test beschreven. Menselijke MSCs waren mede gekweekte met ontwikkelingslanden rat afkomstige aorta endothelial netwerken te beoordelen op hun bijdrage aan de vorming, rijping en homeostase buis. Deze versie van de aorta ring assay beoordeelt het vermogen en de potentie van cel therapie kandidaten home naar sites van angiogenese, voeren en bemiddelen van ECM verwerking, en bijdragen aan endothelial buisvormige ontwikkeling door middel van vaststelling van pericyte-achtige lichamelijke interacties. Naast het kwantificeren van het netto-effect van MSCs op in vitro endothelial netwerk vorming en observeren intercellulaire interacties, wij ook geoptimaliseerd een protocol om te isoleren MSCs uit co culturen. Door het uitvoeren van cytometry van de stroom- en qPCR, is het mogelijk om te karakteriseren wijzigingen in MSC fenotype en gen-expressie na co cultuur. Als model celtypes, vergeleken we ontogenetisch vroeg (prenatale) en eind (volwassen) bronnen van menselijke MSCs: FTM HUCPVCs en menselijke beenmerg-afgeleide MSCs (BMSC), respectievelijk in de aorta ring test. Wij stellen voor dat de bepaling van de aorta ring kan worden gebruikt om te studeren het angiogenic potentieel van elk fysiek ondersteunende celtype wanneer onderzochte voor regeneratieve toepassingen van de angiogenic.

<table><tbody><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Gibco</td><td>12571071</td><td>Voor FTM HUCPVC en BMSC kweekmedia.</td></tr><tr><td>APC-geconjugeerd anti humaan TRA-1-85</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB3195A</td><td>Humaan-specifieke celmarkering voor flowcytometrie en celsortering</td></tr><tr><td>Basmaal membraan extract (BME) (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Voor aorta inbedding</td></tr><tr><td>Bullet-kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Bevat: Gentamicin/Amphotericin-B (GA)humaan Epidermaal Groeifactor (hEGF); Vasculair Endotheel Groeifactor (VEGF); R3- Insuline-achtige Groeifactor-1 (R3-IGF-1); Ascorbinezuur; Hydrocortison; humaan Fibroblast Groeifactor-Beta (hFGF-&beta;); Heparine; Foetale Rundeserum (FBS). Vereist voor het bereiden van EGM</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Kleur</td><td>Thermo-fisher</td><td>C2925</td><td>Voor het kleuren van MSCs, groen wordt optimaal opgenomen door MSCs</td></tr><tr><td>CKX53 Cultuur Microscoop</td><td>Olympus</td><td></td><td>Voor heldere beeldvorming van ontwikkeling van endotheelnetwerk</td></tr><tr><td>Countess geautomatiseerde celteller</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td>Celtelling voor MSC kweek, flowcytometrie en qPCR</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCell technologieën</td><td>7923</td><td>Voor het dissociëren van aorta ring-MSC co-culturen (opwarmen op 37 &deg;C)</td></tr><tr><td>Disposabele steriele scalpels</td><td>VWR</td><td>21909-654</td><td>Voor het snijden van aorta</td></tr><tr><td>Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>PBS. 1X, Zonder calciumchloride en magnesiumchloride</td></tr><tr><td>Endotheel basaal media (EBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td>Basaal media vereist voor het kweken van aorta ring assay-MSC co-culturen (opwarmen op 37 &deg;C voor gebruik). Vereist voor EGM en EBM-FBS</td></tr><tr><td>Ethanol, 70%, Biotechnologie Kwaliteit</td><td>VWR</td><td>97064-768</td><td>Om oppervlakken te steriliseren</td></tr><tr><td>EVOS</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Fluorescentie microscoop in-house om MSC migratie en integratie te volgen</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS) (Hyclone)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH3039603</td><td>Serumcomponent van celkweekmedium</td></tr><tr><td>FITC-geconjugeerd anti-CD31 antilichaam</td><td>BD</td><td>558068</td><td>Humaan endotheel marker voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>FITC-geconjugeerd anti-CD146antilichaam</td><td>BD</td><td>560846</td><td>Humaan pericyten marker voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>Pincetten</td><td>Almedic</td><td>7727-A10-704</td><td>Voor het hanteren van rattenweefsel. Kan elke vergelijkbare pincet gebruiken</td></tr><tr><td>Hank's Gebalanceerde Zout Oplossing (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-094</td><td>1X Zonder calciumchloride en magnesiumchloride</td></tr><tr><td>HERAcell 150i CO2 Incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026410</td><td>Voor het incuberen van cellen</td></tr><tr><td>Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array</td><td>Qiagen</td><td>PAHS-024Z</td><td>Specifiek voor mensen en bevat primers voor 84 genen betrokken bij angiogenesis. Elke put is 1 primerreactie</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Open source beeldverwerkingssoftware. Vereist Angiogenesis analyzer plugin</td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD</td><td></td><td>UHN SickKids FC Facility. Voor flowcytometrie.</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>UHN SickKids FC Facility. Voor celsortering.</td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Antibioticumcomponent voor buffers en celkweekmedium</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Voor RNA zuivering. Omvat cel lysis buffer</td></tr><tr><td>RT2Easy First Strand Kit</td><td>Qiagen</td><td>330421</td><td>Voor bereiding van cDNA voor qPCR</td></tr><tr><td>RT2PreAMP cDNA Synthese Kit</td><td>Qiagen</td><td>330451</td><td>Pre-amplificatie van cDNA indien laag opbrengst RNA</td></tr><tr><td>Chirurgische schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td>Voor het snijden van huid, spier en aorta</td></tr><tr><td>Steriele gaasjes</td><td>VWR</td><td>3084</td><td>Om borstharen te dempen en te steriliseren</td></tr><tr><td>TrypleE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605036</td><td>MSC dissociatie enzym opwarmen op 37 &deg;C</td></tr><tr><td>0.2 &mu;m porie filtereenheid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>566-0020</td><td>Om weefselkweek media te steriliseren</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Voor celdissociatie, opwarmen op 37 &deg;C</td></tr><tr><td>10 cm weefselkweek schotels</td><td>Corning</td><td>25382-428</td><td>Voor het schoonmaken en snijden van aorta en MSC celkweek</td></tr><tr><td>12 wel-cel kweek platen</td><td>Corning-Sigma Aldrich</td><td>CLS3513</td><td>Voor het opzetten van aorta ring assay-MSC co-culturen</td></tr><tr><td>15 mL buis</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Voor algemene weefselkweek procedures</td></tr><tr><td>70 &mu;m cel zeef</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td>Om een enkele cel suspensie te garanderen vóór flowcytometrie of sorteer</td></tr></tbody></table>

de aorta ring mede cultuur assay: een handig hulpmiddel om te beoordelen van het potentieel van de angiogenic van mesenchymale stromale cellen in vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Angiogenese is een complexe, sterk gereguleerde proces dat verantwoordelijk is voor de verlening en de handhaving van adequate weefsel perfusie. Onvoldoende therapieën onderhoud en pathologische misvormingen kunnen leiden tot ernstige ischemische ziekten, terwijl al te overvloedige vasculaire ontwikkeling geassocieerd met kanker en inflammatoire aandoeningen wordt. Een veelbelovende vorm van pro-angiogenic therapie is het gebruik van angiogenic cel broncodes, welke regelgevende factoren evenals fysieke ondersteuning bieden kan voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën.
Mesenchymale stromale cellen (MSCs) zijn uitgebreid onderzochte kandidaten voor vasculaire regeneratie als gevolg van de effecten van hun paracrine en hun vermogen op te sporen en de thuisbasis van ischemische of ontstoken weefsels. In het bijzonder, eerste trimester menselijke navelstreng gerelateerde cellen (FTM HUCPVCs) zijn een zeer veelbelovende kandidaat als gevolg van hun pericyte-achtige eigenschappen, hoge proliferatieve en multilineage potentieel immuun-bevoorrechte eigenschappen en robuuste paracrine Profiel. Om te kunnen beoordelen effectief angiogenic regeneratieve cellen, is het een vereiste om hen in betrouwbare en 'vertaalbare ' redactionele preklinische testen te testen. De bepaling van de aorta ring is een ex vivo angiogenese model dat zorgt voor gemakkelijk kwantificeren van de tubulaire endothelial structuren, biedt accessoire ondersteunende cellen en extracellulaire matrix (ECM) van de host, uitsluit van inflammatoire componenten en is snel en goedkoop op te zetten. Dit is voordelig in vergelijking met in vivo modellen (bijvoorbeeld, hoornvlies assay, Matrigel plug assay); de aorta ring test kan volgen van de door de overheid gereguleerde cellen en intercellulaire interacties observeren terwijl het vermijden van xeno-immuun afwijzing.
Presenteren we een protocol voor een nieuwe toepassing van de bepaling van de aorta ring, waarin menselijke MSCs in co culturen met ontwikkelingslanden rat aorta endothelial netwerken. Deze bepaling voorziet in de analyse van de bijdrage van de MSC aan tube vorming en ontwikkeling door middel van fysieke pericyte-achtige interacties en van hun potentie voor het actief migreren naar sites van angiogenese, en voor de evaluatie van hun vermogen uit te voeren en bemiddelen ECM verwerking. Dit protocol bevat verdere informatie over wijzigingen in MSC fenotype en gen-expressie na co cultuur.

De schematische-workflow voor de vaststelling van de aorta ring/MSC co cultuur bepaling wordt geïllustreerd in Figuur 1. De belangrijkste stappen omvatten: rat aorta isolatie, afdelen en inbedding van de aorta ringen, toezicht op het endotheel kiemen en de ontwikkeling van het netwerk, en ten slotte etikettering en beheren van de MSCs. De tijdlijn van het endotheel netwerkanalyse schetst het venster voor de analyses die haalbaar is voor elke periode van co kw...

Hier presenteren we een nieuwe toepassing van de bepaling van de aorta ring waar prelabelled mesenchymale cellen zijn mede gekweekte met rat aorta afkomstige endothelial netwerken. Deze nieuwe methode kunt visualisatie van mesenchymale stromale cellen (MSCs) homing en integratie met endothelial netwerken, kwantificering van netwerkeigenschappen en evaluatie van MSC immunophenotypes en gen-expressie.

De aorta Ring mede cultuur Assay: Een handig hulpmiddel om te beoordelen van het potentieel van de Angiogenic van mesenchymale stromale cellen In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Het algemene doel van deze preklinische functionele assay is om het angiogene potentieel van mesenchymale stamcellen die bedoeld zijn voor regeneratieve therapie te observeren en kwantitatief te evalueren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van vasculair gerichte regeneratieve geneeskunde, zoals het werkingsmechanisme en de efficiëntie van celtherapie-kandidaten. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat ze essentiële elementen van de in vivo-omgeving bieden, terwijl ze de controle en eenvoudige beoordelingskenmerken van in vitro-assays behouden.De implicaties van deze nieuwe techniek strekken zich uit tot de cellulaire therapie van ischemische ziekten, aangezien het vakgebied echt behoefte heeft aan betrouwbare en gebruiksvriendelijke functionele assays. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Farwah Iqbal, een promovendus in mijn laboratorium, en door Peter Szaraz, een onderzoeker in mijn laboratorium. Nadat de aorta van een rat is geïsoleerd en het medium volgens het tekstprotocol is bereid, moeten 12-well weefselkweekplaten worden gecoat door de platen eerst op een koud oppervlak te plaatsen, zoals een ice pack.Voeg met b

the-aortic-ring-co-culture-assay-convenient-tool-to-assess-angiogenic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Deze video toont het protocol van een in vitro angiogenese test die recapituleert verschillende stadia van angiogenese. Time-lapse beelden van kiemen, lumen vorming, vertakking en anastomose - belangrijkste kenmerken van angiogenese - worden weergegeven.

Geoptimaliseerde fibrinegel Bead Assay voor de Studie van Angiogenese

Angiogenese, is het kiemen van de bloedvaten van de reeds bestaande vaatstelsel, verbonden aan zowel natuurlijke en pathologische processen. Hier laten we zien een aorta-ring-test die het mogelijk maakt angiogene potentiators en remmers direct worden toegevoegd aan aorta-ringen in cultuur. Kieming en uitgroei neovessel kan worden bepaald door het inspecteren van de aorta-ringen over een periode van 6-12 dagen.

Aorta Ring Assay

Normale volwassen gevasculariseerde weefsel van zoogdieren die fysiologische angiogenese en die mist nog niet is blootgesteld aan chirurgische ingreep wordt gebruikt om te bestuderen: (i) de instelling en ontwikkeling van angiogenese na intraperitoneale toediening van test-agenten, en (ii) wijziging van angiogenese na systemische toediening van geselecteerde test agenten.

Rat mesenterium Angiogenese Assay

Dit artikel schetst een veelzijdige methode om uit de cel afkomstige weefsel ringen te creëren door cellulaire zelf-assemblage. Gladde spiercellen gezaaid in de ring-vormige agarose putten aggregaat en contract tot robuuste driedimensionale (3D) weefsels maken binnen de 7 dagen. Millimeter schaal weefsel ringen bevorderlijk zijn voor mechanische testen en dienen als bouwstenen voor weefsel montage.

Gericht Cellular Self-Assembly to Cell-Derived weefsel Rings fabriceren voor Biomechanische Analyse en Tissue Engineering

Hier beschrijven we methoden voor het isoleren van primaire muis epicardiale cellen door middel van een uitgroei-kweektest en het beoordelen van de functionele migratie van epicardiale-afgeleide cellen (EPDC) met behulp van een ex vivo hartkweeksysteem. Deze protocollen zijn geschikt voor het identificeren van genetische en chemische modulatoren van epicardiale epitheel-naar-mesenchymale overgang (EMT) en mobiliteit.

Epicardiale uitgroei Cultuur en Assay<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Evaluatie van Epicardial-afgeleide Cell Migratie

Dit manuscript beschrijft een buisvormingstest om de effecten van een bepaalde verbinding of omstandigheid op angiogenesis te kwantificeren door gebruik te maken van de vorming van endotheelcellen in een gecontroleerde omgeving.

Strategische endotheelcellen Tube Formation Assay: Het vergelijken van extracellulaire matrix en Growth Factor Verlaagde extracellulaire matrix

Een cel cultuur model van weerstand slagaders wordt beschreven, waardoor de dissectie van signalering van trajecten in endotheel, gladde spieren, of tussen endotheel en gladde spieren (de kruising van de myoendothelial). De selectieve toepassing van agonisten of eiwit isolatie, elektronenmicroscopie of immunofluorescentie kan worden gebruikt met behulp van deze cel cultuur model.

Een cel cultuur Model van weerstand slagaders

Driedimensionaal co-Culture spheroid-systeem voor angiogenese is ontworpen om de fysiologische angiogenese na te bootsen. Co-Culture sferoïden worden gevormd door twee humane vasculaire celprecursoren, ecfcs en MSCS, en ingebed in collageen gel. Het nieuwe systeem is effectief voor het evalueren van angiogene modulatoren en verschaft relevantere informatie aan de in vivo studie.

Driedimensionaal angiogenese-assay systeem met co-Culture Spheroids gevormd door endotheliale kolonie vormende cellen en mesenchymale stamcellen

Dit protocol presenteert choroïde kiemen test, een ex vivo model van microvasculaire proliferatie. Deze test kan worden gebruikt om trajecten die betrokken zijn bij het verspreiden van choroidale microvaten te beoordelen en te beoordelen drug behandelingen met behulp van wilde type en genetisch gemodificeerd muisweefsel.

Een Ex Vivo Choroid Sprouting Assay van Oculaire Microvasculaire Angiogenese

Deze studie presenteert de tweedimensionale (2D) kraswondmigratietest en de driedimensionale (3D) sferoïde kiemtest, samen met hun respectievelijke stroomafwaartse analysemethoden, waaronder RNA-extractie en immunocytochemie, als geschikte tests om angiogenese in vitro te bestuderen.

Onderzoek naar angiogenese op functioneel en moleculair niveau door gebruik te maken van de Scratch Wound Migration Assay en de Spheroid Sprouting Assay

Leer de aorta ring co-cultuur assay om het angiogene potentieel van mesenchymale stromale cellen te evalueren. Deze methode biedt betrouwbare inzichten voor regeneratieve geneeskunde en ischemische ziekten.

De aorta Ring mede cultuur Assay: Een handig hulpmiddel om te beoordelen van het potentieel van de Angiogenic van mesenchymale stromale cellen In Vitro (Video) | JoVE Journal

De aorta Ring mede cultuur Assay: Een handig hulpmiddel om te beoordelen van het potentieel van de Angiogenic van mesenchymale stromale cellen In Vitro

Meer video's verkennen