Membraan Nanotubes trekken van Giant Unilamellar blaasjes

Het algemene doel van deze nanobuis-trekmethodologie is om kwantitatief de interacties tussen specifieke eiwitten van belang en sterk gebogen membranen te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in de biologie van celmembranen, zoals endocytose en intracellulair transport. Deze techniek stelt ons in staat om direct te kwantificeren hoe eiwitten zich binden aan gebogen membranen en elkaar wederzijds vervormen.

Aanvankelijk werd deze methode gebruikt om de fundamentele mechanische eigenschappen van lipidemembranen te meten. Onlangs is het toegepast om belangrijke mechanismen in eiwit-membraaninteracties te verduidelijken, met name eiwitvorming van membranen. Begin met het verzamelen van de reusachtige unilamellaire vesiculen rechtstreeks van de platinadraden van de elektroformatiekamer.

Om de experimentele kamer te construeren, plaats twee rechthoekige glazen deksels op een afstand van één millimeter op een metalen basis, waarbij openingen langs de lange randen worden gemaakt die groot genoeg zijn om een glazen micropipettip tot ten minste het midden van de kamer te laten bereiken. Vul zowel de experimentele kamer als een glazen micropipet met vijf milligram per milliliter van een zeer zuivere beta-caseïne-oplossing, en zorg ervoor dat er geen luchtbelletjes ontstaan. Terwijl de kamer wordt gepassiveerd, monteer deze op een lichtmicroscoop gecentreerd boven het objectief en steek de punt van de aspiratiemicropipet door de opening langs de lange rand tot de punt boven het objectief is.

Pas het watertankniveau aan zodat de aspiratiedruk bijna nul is en vul een injectiemicropipet met het molecuul van belang, opgelost in experimenteel buffer op de juiste experimentele concentratie. Monteer de injectiemicropipet in een micromanipulator en steek de micropipet door de andere kant van de experimentele kamer. Aan het einde van de incubatie verwijdert u de beta-caseïne-oplossing uit de kamer en spoelt u de kamer meerdere keren met experimenteel buffer.

Voeg vervolgens een paar microliters van vesiculoplossing toe aan de kamer, gevolgd door een paar microliters van streptavidine-gecoate kralen, tot een uiteindelijke concentratie van 0,1 keer 10 tot de negatieve 3% kralensnelheid per volume of minder. Nadat de vesiculen en kralen zich aan de bodem van de kamer hebben gezet, laat u de experimentele buffer ongeveer 15 minuten verdampen, waarna de vesiculen zichtbaar moeten golfen onder een lichtmicroscoop. Wanneer de vesiculen voldoende soepel zijn, zuigt u afzonderlijke vesiculen in de micropipet totdat de lengte van de membranen binnenin de pipet gelijk is aan of groter is dan de pipetradius.

Wanneer een aspiratielappend van de juiste grootte is geïdentificeerd, verzegelt u de open randen van de kamer met minerale olie. Om de nulpositie van de aspiratiedruk in te stellen, plaatst u het uiteinde van de aspiratiepipet dicht bij een kraal en pas de hoogte van de watertank aan zodat de kraal niet wordt aangezogen of weggeblazen door de pipet. Het aanpassen van de waterhoogte is cruciaal om de membraanspanning van de vesikel die door de micropipet wordt aangezogen te beheersen.

Zuig een vesikel aan en beweeg de micropipet omhoog en uit focus zonder de micropipet te breken. Gebruik optische pincetten om een kraal ongeveer 20 micrometer van de bodem van de kamer te vangen. Breng de vesikel terug in focus weg van de kraal en uitgelijnd met de optische val en registreer de beweging van de kraal gedurende één tot twee minuten om de evenwichtspositie te meten.

Verlaag de druk in de micropipet zoveel mogelijk zonder de vesikel te verliezen om de membraanspanning te verminderen en breng de vesikel gedurende ongeveer een seconde in contact met de kraal om de streptavidine-biotinebindingen tot stand te brengen. Gebruik vervolgens een piëzoactuator om de vesikel voorzichtig terug te trekken om een nanobuis te creëren. Verhoog de aspiratiedruk om de aspiratietong opnieuw te creëren en lijn de buis uit binnen de as van de aspiratiepipet.

Breng de buis en de vesikel volledig in focus en registreer de beweging van de kraal met een verwervingssnelheid van 30 hertz en de hoogte van de watertank ten opzichte van de nulpositie gedurende enkele minuten onder helderveldmicroscopie. Wanneer alle beelden zijn verkregen, registreert u de beweging van de kraal opnieuw bij verschillende aspiratiedrukken en membraanspanningen. Om eiwitten of moleculen van belang te injecteren, brengt u de injectiemicropipet in de buurt van de nanobuis, zorg ervoor dat de kraal in de optische val niet wordt verstoord en injecteer de eiwitten voorzichtig bij een druk van één tot twee pascal.

Nadat de eiwitbinding is geëquilibreerd, herhaalt u de stappenmetingen in aanwezigheid van de toegevoegde eiwitten, zoals gedemonstreerd voor de blote membraan. Kracht- en radiusmetingen op nanobuizen getrokken uit 100% DOPC-vesiculen zijn onafhankelijk, omdat de kracht wordt gemeten aan de hand van de verplaatsing van de kraal in de optische val en de straal uit de fluorescentie-intensiteit, waardoor twee manieren worden geboden om de membraanbuigstijfheid te berekenen. De relatieve verrijking van BAR- of kaliumkanaaleiwitten op membraanbuizen boven de onderliggende vesiculen geeft aan dat de eiwitten eerder geneigd zijn om zich te binden aan gebogen membranen.

Inderdaad reduceert de binding van het N-BAR-eiwit endofiline A2 aan het membraan geleidelijk de buiskracht tot nul, wat wijst op de vorming van een driedimensionale scaffold die de buis stabiel houdt. Na deze procedure kunnen andere technieken worden gecombineerd om aanvullende vragen te beantwoorden, bijvoorbeeld hoge-resolutiemicroscopie om eiwitorganisatie op membraanbuizen te detecteren of enkele deeltjestracking om eiwitmobiliteit te meten.