Name: Membraan Nanotubes trekken van Giant Unilamellar blaasjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Ontdek hoe membraan nanotubes uit reuze unilamellaire blaasjes worden getrokken om eiwit-membraan interacties te kwantificeren. Deze methode onthult mechanismen van endocytose en intracellulaire transportprocessen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Benoit Sorre, Damien Cuvelier, Pierre Nassoy, François Quemeneur en Gil Toombes voor hun essentiële bijdragen methode vast te stellen de nanobuis in de groep. De P.B. groep behoort aan het CNRS consortium CellTiss, de Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038), en Parijs Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). F.-C. Tsai werd gefinancierd door de EMBO op lange termijn fellowship (ALTF 1527-2014) en de Marie Curie-acties (H2020-MSCA-IF-2014, project membraan-ezrin-actine). M.S. is een Junior Fellow van de samenleving van Fellows van Simons.

De auteurs hebben niets te onthullen.

De methode van het trekken van buizen van GUVs geeft rijke informatie op het membraan-eiwit-systeem, maar het is niet alleen de middelen voor het meten van de fundamentele mechanische eigenschappen van het membraan, helpt het om licht werpen op de koppeling tussen eiwitten en membraan kromming. Zoals besproken in de inleiding, andere technieken bestaan voor het meten van de effecten van membraan-gebogen eiwitten, door de eiwitten aan het broeden met sub micron liposomen vastgebonden aan een speciaal oppervlak<sup class="...

Veel cellulaire processen, zoals endocytose, mensenhandel, de vorming van filopodia, infectie, enz., worden begeleid door een dramatische verandering in de vorm van celmembranen1,2. In de cel deelnemen een aantal eiwitten aan deze processen door te binden aan het membraan en veranderen hun vorm. De opmerkelijkste voorbeelden behoren tot de familie van de Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR) eiwit, met een karakteristiek intrinsiek gebogen BAR domein3,4,5,6,7. Typisch, ze interageren met het membraan door het domein van de BAR aan de oppervlakte en, in veel gevallen ook ondiep invoegen amphipathic helices in de dubbelgelaagde vast te houden. De vorm, grootte en kosten van het domein van de BAR samen met het aantal amphipathic helices bepaalt: (1) de richting van membraan kromming (d.w.z., of zij zal induceren invaginations of uitsteeksels), en (2) de omvang van het membraan kromming5,8. Van de nota, is hier positieve kromming gedefinieerd als de convexe kant van het gebogen membraan, dat wil zeggen, de Ardennen richting de interagerende deeltjes, en negatieve anders. Bovendien, kwantitatieve studies van BAR eiwitten bleek dat hun effect op het membraan hangt af van een aantal fysieke parameters: dichtheid van eiwitten, membraan spanning en membraan vorm (platte versus buisvormige versus sferisch oppervlak vorm)7. Afhankelijk van deze parameters BAR eiwitten kan: (1) fungeren als sensoren van membraan kromming, (2) buigen membranen of (3) induceren membraan splitsing7.
Vanwege het enorme aantal onderdelen die betrokken zijn bij het membraan omvormen in de cel, het bestuderen van de kwantitatieve aspecten van de verschijnselen, zoals endocytose, is in vivo zeer uitdagend. In vitro reconstitutie van minimale onderdelen nabootsen van gebogen membranen in de cel de mogelijkheid biedt een mechanistische begrip van hoe membraan-gebogen eiwitten werken te krijgen. Dit artikel beschrijft een protocol om te reconstrueren een membraan nanobuis in vitro met micromanipulation, confocal microscopie en optisch pincet. De aanpak kan worden gebruikt om te studeren, op een kwantitatieve manier, eiwitten, lipiden, of kleine moleculen interactie met een gebogen membraan. Lipide-GUVs worden gebruikt als model van een celmembraan, waarvan de kromming te verwaarlozen in vergelijking met de grootte van interagerende membraan-gebogen moleculen is. Ze zijn bereid met behulp van de electroformation methode9 waarin de blaasjes worden gevormd door een lipide-film hydraterende en zwelling het in GUVs onder een wisselstroom (AC)10. Meest voorkomende ondergronden waarop GUVs worden geteeld zijn beide semi-geleidend platen bedekt met indium tin oxide (ITO) of platina draden (Pt-draden)11. In dit werk worden GUVs gekweekt op Pt-draden zoals deze methode gebleken te werken veel beter dan het alternatief bij het maken van GUVs in aanwezigheid van zouten in de buffer12. Hoewel het electroformation-protocol hier in voldoende detail beschreven wordt te reproduceren, verwijzen we de lezer naar eerdere artikelen waarin vergelijkbare en andere methoden van het maken van GUVs zijn beschreven in detail13,14. In onze handen, heeft electroformation op Pt-draden met succes opgeleverd GUVs uit een mix van synthetische lipiden of uit natuurlijke lipide extracten in een buffer met ~ 100 mM NaCl. Bovendien was het ook mogelijk om in te kapselen eiwitten binnen GUVs tijdens groei. Een kamer van de electroformation in het volgende voorbeeld wordt getoond in figuur 1A; het bestaat uit twee ~ 10-cm lange Pt-draden ingevoegd in een houder gemaakt van polytetrafluorethyleen (PTFE) dat kan worden verzegeld aan beide zijden met glas coverslips ~ 1-2 cm uit elkaar (figuur 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56086/56086fig1.jpg"> Figuur 1: experimentele opzet. (A) de GUV-electroformation kamer met elektrische aansluitingen op Pt-draden aangesloten. (B)-links: de experimenteel systeem tonen de Microscoop, de experimentele kamer boven de doelstelling en twee micropipetten (links en rechts) aan de micromanipulators en ingevoegd in de experimentele zaal voor buis trekken en eiwit injectie. Rechts: een vergrote weergave van de experimentele kamer gemonteerd boven de doelstelling met de toppen van de ambitie en de injectie micropipetten ingevoegd. (C) A injectiespuit voorzien van een dunne dispenser ingevoegd in een micropipet op de back-end. De onderkant is een vergrote weergave van de dispenser binnen de micropipet met de blauwe stippellijn overzichten van de micropipet. Dit systeem wordt gebruikt voor het vullen van de micropipet met caseïne om te passivate het glasoppervlak en ook om opvulling met minerale olie wanneer nodig. (D) een systeem gebruikt om µL hoeveelheden van de eiwit-oplossing gecombineerd. De naald is verbonden aan een injectiespuit en slang die is aangesloten op de micropipet van de injectie. De micropipet tip is zorgvuldig ondergedompeld in de eiwit-oplossing en aanzuiging dus om te vullen de micropipet tip. De micropipet is vervolgens weer gevuld met minerale olie met behulp van het systeem dat is afgebeeld in deelvenster C. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56086/56086fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Een membraan nanobuis, variërend in straal van 7 nm tot enkele honderden nm, bij een GUV kan worden opgevraagd door een externe kracht. Deze methode was in eerste instantie bedoeld voor het meten van de elastische eigenschappen van celmembranen en blaasjes, zoals de buigende stijfheid15,16. In de meest recente producties, werd de methode uitgebreid bestuderen de interactie van eiwitten met een gebogen membraan door de eiwitten in de buurt van de getrokken nanobuis7,17microinjecting. Andere methoden zijn ontwikkeld voor het bestuderen van de membraan-gebogen eiwitten. In één methode, worden eiwitten geïncubeerd met verschillend formaat liposomen vastgebonden aan een speciaal oppervlak. Confocale microscopie wordt gebruikt voor het meten van de binding aan eiwitten als een functie van liposoom diameter, die kromming-geïnduceerde sorteren18,19kunt aangeven. Een andere methode, worden eiwitten geïnjecteerd in de buurt van een micro-aanzuiging GUV voor het meten van hun vermogen om spontaan induceren tubuli20,21. De in dit protocol beschreven methode is uniek geschikt om te studeren membraan-gebogen eiwitten die betrokken zijn in endocytose, waar de meeste eiwitten meestal tegenkomen voorgevormde membraan nanotubes aansluiten van de lading-bevattende membraan-invagination met de onderliggende platte plasma membraan. Bovendien, in deze methode, in tegenstelling tot in de test met vastgebonden kleine liposomen, het membraan nanobuis is voortdurend in verbinding staan op het membraan; Daarom is het in mechanisch evenwicht met de GUV, een situatie verwacht in vivo. Vandaar, fundamentele membraan Natuurkunde geldt en we kunnen een overvloed aan mechanische eigenschappen afleiden uit onze metingen22,23,24.
Voor een volledige implementatie van deze methode omvat de benodigde apparatuur een confocal microscoop, optisch pincet en één of twee micropipetten, aangesloten op een waterreservoir (figuur 1B). Door de combinatie van alle drie, kan men meten membraan spanning, membraan kromming, oppervlakte dichtheid van eiwitten en tegelijkertijd tube kracht25. Micropipet aspiratie is essentieel en het gemakkelijk is gebouwd door het invoegen van een glazen micropipet in een houder die is aangesloten op een waterreservoir, dat via de hydrostatische druk, de aspiratie druk26 controleert. De micropipet en de houder worden gecontroleerd door een micromanipulator en, idealiter in één richting door een piezo-actuator voor precisie beweging. Te trekken een nanobuis, de GUV is kort vast aan een micron-en kleinbedrijf kraal vervolgens trok weg het creëren van een nanobuis microaspirated. In deze uitvoering, wordt de parel gehouden door optisch pincet, die kan worden geconstrueerd door het volgen van een gepubliceerde protocol27. Het is mogelijk af te zien van de optisch pincet en pull nanotubes op verschillende manieren, hoewel ten koste van nauwkeurige kracht metingen. Als het is ook uitdagend om te bouwen van een optische trap of als kracht metingen zijn niet onontbeerlijk, zoals men wil gewoon om te controleren de voorkeur van eiwitten voor gebogen membranen, een buis kan worden getrokken met behulp van een kraal aanzuiging op het puntje van een tweede micropipet28. Het is ook mogelijk voor het trekken van buizen met behulp van de zwaartekracht29 of30,31te stromen. Bovendien is confocale microscopie niet noodzakelijk echter bij voorkeur wordt dus voor het meten van de oppervlakte dichtheid van eiwitten. Het maakt het ook mogelijk de nanobuis straal van intensiteit van de fluorescentie van lipiden in de buis, dus onafhankelijk van de membraan kracht en spanning te meten. Afgeleid van buis straal van fluorescentie is vooral belangrijk als de relatie tussen deze hoeveelheden van de gevestigde vergelijkingen als gevolg van de aanwezigheid van eiwitten membraan-nageleefd25 afwijkt. Nog belangrijker is, kan niet een afzien van zowel de optische val en confocale microscopie, zoals het zal niet mogelijk zijn om te meten de kromming van de buis.
De methode zoals beschreven in dit protocol is gebruikt voor het bestuderen van de kromming-geïnduceerde sorteren van verschillende perifere membraaneiwitten op nanobuisjes, vooral degenen uit de BAR familie25,32,33,34 . Het was ook te zien dat het kanaal van de conically gevormde transmembraan kalium dat kvap wordt verrijkt op gebogen nanotubes op dezelfde manier als BAR eiwitten35. Door het optimaliseren van de methode voor het inkapselen van eiwitten binnen GUVs, is de interactie van eiwitten met negatieve kromming onlangs onderzocht als goed36. Bovendien, deze methode is gebruikt te verhelderen van de vorming van eiwitten steigers25,37 en te bestuderen van het mechanisme van membraan splitsing door ofwel lijn spanning38, eiwit dynamin39, of door BAR eiwitten40,41. Naast eiwitten, kunnen kleine moleculen of ionen ook veroorzaken kromming. Met deze methode werden calciumionen getoond voor het opwekken van positieve kromming onder voorwaarden zoutloos42. Interessant, is het ook aangetoond dat lipiden kromming sorteren, hoewel alleen voor composities die in de buurt van een demixing punt43,44 zijnkunnen ondergaan. Kortom, de methode kan worden gebruikt door onderzoekers kochten onderzoeken hoe beide integraal membraan componenten (bv, lipiden of transmembraan eiwitten) of ook bindende moleculen (hetzij binnen of buiten GUVs) ermee cilindrische gebogen membranen, uit oogpunt van mechanische en kwantitatieve. Het is ook bedoeld voor diegenen die geïnteresseerd zijn in het meten van de mechanische eigenschappen van het membraan zich22,23,45.

<table><tbody><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td>Voorbeeldelid gebruikt in gegevens voor Figuur 3</td></tr><tr><td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleenglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotine]</td><td>Avanti</td><td>880129</td><td>gebiotinileerd lipide</td></tr><tr><td>BODIPY-TR-C5-ceramida</td><td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td><td>D7540</td><td>fluorescerend lipide</td></tr><tr><td>BODIPY- FLC5-hexadecanoyl fosfatidyelcholine (HPC*)</td><td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td><td></td><td>fluorescerend lipide voor eiwitdichtheidskalibratie</td></tr><tr><td>eier L-&alpha;-fosfatidylcholine (eierPC)</td><td>Avanti</td><td>840051</td><td>gebruikt voor het kalibreren van de buisradiusconstante</td></tr><tr><td>&beta;-caseïne uit rundermelk (>99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6905</td><td>gebruikt voor het passiëren van de micropipet en de experimentele kamer</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>D(+) glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>osmomètre</td><td>Loser</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Pt-draden, 0,5 mm diameter, 99,99% zuiver</td><td>Goodfellow USA</td><td>PT005139</td><td>gebruikt voor GUV-elektroformatie</td></tr><tr><td>functiegenerator</td><td></td><td>n/a</td><td>gebruikt om stroom te creëren voor GUV-elektroformatie</td></tr><tr><td>kitseal</td><td>Vitrex (van CML France)</td><td>CRIT 140013</td><td>gebruikt om de elektroformatiekamer te afdichten</td></tr><tr><td>badsonicator</td><td></td><td>n/a</td><td>nuttig om de elektroformatiekamer schoon te maken, maar niet cruciaal</td></tr><tr><td>Nikon TE2000 omgekeerde microscoop, eC1 confocale systeem (Nikon), met twee laserlijnen (&lambda; = 488 nm en 543 nm); optische pincetten geïnduceerd door een 5 W ytterbiumvezel continuegolflaser (&lambda; > 1070 nm; IPG GmBH Duitsland)</td><td></td><td></td><td>een voorbeeld van een confocale microscopiesysteem uitgerust met optische pincetten</td></tr><tr><td>micromanipulatoren</td><td></td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>borosilicaat capillairen (met interne en externe radii van 0,78 mm en 1 mm, respectievelijk)</td><td>Harvard apparatus</td><td>30-0036</td><td></td></tr><tr><td>micropipettrekker</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2100</td><td></td></tr><tr><td>microsmeedijzer</td><td>Narishige</td><td>MF-800</td><td></td></tr><tr><td>piëzo-elektrische actuator</td><td>Physik Instrumente</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>polystyreen streptavidine gecoate kralen (diameter 3,2 &micro;m)</td><td>Spherotech</td><td>SVP-30-5</td><td></td></tr></tbody></table>

membraan nanotubes trekken van giant unilamellar blaasjes

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

De hervorming van het celmembraan is een integraal onderdeel van vele cellulaire fenomenen, zoals endocytose, mensenhandel, de vorming van filopodia, enz. Veel verschillende eiwitten associëren met een gebogen membraan omwille van hun vermogen om zin of induceren membraan kromming. Deze processen zijn gewoonlijk een veelheid aan eiwitten waardoor ze te ingewikkeld om te studeren kwantitatief in de cel. We beschrijven een protocol om te reconstrueren een gebogen membraan in vitro, het nabootsen van een gebogen cellulaire structuur, zoals de endocytotische nek. Een gigantische unilamellar blaasje (GUV) wordt gebruikt als een model van een celmembraan, waarvan de interne druk en oppervlaktespanning worden geregeld met micropipet streven. Een punt trekken kracht toe te passen op de GUV met optisch pincet creëert een nanobuis hoge kromtestraal verbonden met een platte membraan. Deze methode heeft van oudsher gebruikt voor het meten van de fundamentele mechanische eigenschappen van lipide membranen, zoals het buigen van stijfheid. In de afgelopen jaren heeft het uitgebreid bestuderen hoe eiwitten interactie met membraan kromming en de manier waarop zij invloed op de vorm en de mechanica van membranen. Een combinatie van micromanipulation, microinjection, optisch pincet en confocale microscopie systeem maakt meting van membraan kromming, membraan spanning, en de oppervlakte dichtheid van eiwitten, gelijktijdig. Uit deze metingen, kunnen vele belangrijke mechanische en morfologische eigenschappen van de eiwit-membraan systeem worden afgeleid. Bovendien, lay we-out een protocol voor het maken van GUVs in aanwezigheid van fysiologische zoute concentratie en een methode voor de kwantificering van de oppervlakte dichtheid van eiwitten op het membraan van de intensiteit van de fluorescentie van gelabelde proteïnen en lipiden.

Het experiment van buis-pulling kan geven essentiële mechanische informatie over het membraan. Bij gebrek aan eiwitten of andere moleculen die paar met membraan kromming, het membraan dwingen en straal van de buis kan worden gerelateerd met membraan spanning door het toepassen van de Hamiltoniaan boekje-Helfrich vergelijking tot een koker getrokken uit een GUV50,51 
<img...

Veel proteïnen in de cel zin en membraan kromming veroorzaken. Beschrijven we een methode om te halen membraan nanotubes van lipide blaasjes te bestuderen de interactie van proteïnen of elke kromming-actieve molecuul met gebogen membranen in vitro.

Membraan Nanotubes trekken van Giant Unilamellar blaasjes

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Het algemene doel van deze nanobuis-trekmethodologie is om kwantitatief de interacties tussen specifieke eiwitten van belang en sterk gebogen membranen te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in de biologie van celmembranen, zoals endocytose en intracellulair transport. Deze techniek stelt ons in staat om direct te kwantificeren hoe eiwitten zich binden aan gebogen membranen en elkaar wederzijds vervormen.Aanvankelijk werd deze methode gebruikt om de fundamentele mechanische eigenschappen van lipidemembranen te meten. Onlangs is het toegepast om belangrijke mechanismen in eiwit-membraaninteracties te verduidelijken, met name eiwitvorming van membranen. Begin met het verzamelen van de reusachtige unilamellaire vesiculen rechtstreeks van de platinadraden van de elektroformatiekamer.Om de experimentele kamer te construeren, plaats twee rechthoekige glazen deksels op een afstand van één millimeter op een metalen basis, waarbij openingen langs de lange randen worden gemaakt die groot genoeg zijn om een glazen micropipettip tot ten minste het midden van de kamer te laten bereiken. Vul zowel de experimentele kamer als een glazen micropipet met vijf milligram per milliliter van een zeer zuivere beta-caseïne-oplossing, en zorg ervoor dat er geen luchtbelletjes ontstaan. Terwijl de kamer wordt gepassiveerd, monteer deze op een lichtmicroscoop gecentreerd boven het objectief en steek de punt van de aspiratiemicropipet door de opening langs de lange rand tot de punt boven het objectief is.Pas het watertankniveau aan zodat de aspiratiedruk bijna nul is en vul een injectiemicropipet met het molecuul van belang, opgelost in experimenteel buffer op de juiste experimentele concentratie. Monteer de injectiemicropipet in een micromanipulator en steek de micropipet door de andere kant van de experimentele kamer. Aan het einde van de incubatie verwijdert u de beta-caseïne-oplossing uit de kamer en spoelt u de kamer meerdere keren met experimenteel buffer.Voeg vervolgens een paar microliters van vesiculoplossing toe aan de kamer, gevolgd door een paar microliters van streptavidine-gecoate kralen, tot een uiteindelijke concentratie van 0,1 keer 10 tot de negatieve 3% kralensnelheid per volume of minder. Nadat de vesiculen en kralen zich aan de bodem van de kamer hebben gezet, laat u de experimentele buffer ongeveer 15 minuten verdampen, waarna de vesiculen zichtbaar moeten golfen onder een lichtmicroscoop. Wanneer de vesiculen voldoende soepel zijn, zuigt u afzonderlijke vesiculen in de micropipet totdat de lengte van de membranen binnenin de pipet gelijk is aan of groter is dan de pipetradius.Wanneer een aspiratielappend van de juiste grootte is geïdentificeerd, verzegelt u de open randen van de kamer met minerale olie. Om de nulpositie van de aspiratiedruk in te stellen, plaatst u het uiteinde van de aspiratiepipet dicht bij een kraal en pas de hoogte van de watertank aan zodat de kraal niet wordt aangezogen of weggeblazen door de pipet. Het aanpassen van de waterhoogte is cruciaal om de membraanspanning van de vesikel die door de micropipet wordt aangezogen te beheersen.Zuig een vesikel aan en beweeg de micropipet omhoog en uit focus zonder de micropipet te breken. Gebruik optische pincetten om een kraal ongeveer 20 micrometer van de bodem van de kamer te vangen. Breng de vesikel terug in focus weg van de kraal en uitgelijnd met de optische val en registreer de beweging van de kraal gedurende één tot twee minuten om de evenwichtspositie te meten.Verlaag de druk in de micropipet zoveel mogelijk zonder de vesikel te verliezen om de membraanspanning te verminderen en breng de vesikel gedurende ongeveer een seconde in contact met de kraal om de streptavidine-biotinebindingen tot stand te brengen. Gebruik vervolgens een piëzoactuator om de vesikel voorzichtig terug te trekken om een nanobuis te creëren. Verhoog de aspiratiedruk om de aspiratietong opnieuw te creëren en lijn de buis uit binnen de as van de aspiratiepipet.Breng de buis en de vesikel volledig in focus en registreer de beweging van de kraal met een verwervingssnelheid van 30 hertz en de hoogte van de watertank ten opzichte van de nulpositie gedurende enkele minuten onder helderveldmicroscopie. Wanneer alle beelden zijn verkregen, registreert u de beweging van de kraal opnieuw bij verschillende aspiratiedrukken en membraanspanningen. Om eiwitten of moleculen van belang te injecteren, brengt u de injectiemicropipet in de buurt van de nanobuis, zorg ervoor dat de kraal in de optische val niet wordt verstoord en injecteer de eiwitten voorzichtig bij een druk van één tot twee pascal.Nadat de eiwitbinding is geëquilibreerd, herhaalt u de stappenmetingen in aanwezigheid van de toegevoegde eiwitten, zoals gedemonstreerd voor de blote membraan. Kracht- en radiusmetingen op nanobuizen getrokken uit 100% DOPC-vesiculen zijn onafhankelijk, omdat de kracht wordt gemeten aan de hand van de verplaatsing van de kraal in de optische val en de straal uit de fluorescentie-intensiteit, waardoor twee manieren worden geboden om de membraanbuigstijfheid te berekenen. De relatieve verrijking van BAR- of kaliumkanaaleiwitten op membraanbuizen boven de onderliggende vesiculen geeft aan dat de eiwitten eerder geneigd zijn om zich te binden aan gebogen membranen.Inderdaad reduceert de binding van het N-BAR-eiwit endofiline A2 aan het membraan geleidelijk de buiskracht tot nul, wat wijst op de vorming van een driedimensionale scaffold die de buis stabiel houdt. Na deze procedure kunnen andere technieken worden gecombineerd om aanvullende vragen te beantwoorden, bijvoorbeeld hoge-resolutiemicroscopie om eiwitorganisatie op membraanbuizen te detecteren of enkele deeltjestracking om eiwitmobiliteit te meten.

pulling-membrane-nanotubes-from-giant-unilamellar-vesicles

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Microfluïdische jetting tegen een druppel-interface lipide bilaag een betrouwbare manier om vesicles te genereren controle over membraan asymmetrie, incorporatie van transmembraan eiwitten en inkapseling materiaal. Deze techniek kan worden toegepast op een verscheidenheid van biologische systemen waarbij gecompartimenteerd biomoleculen gewenst bestuderen.

Lipidendubbellaag Vesicle Generation Met behulp Microfluidic Jetting

De reconstitutie van het transmembraan eiwit, KvAP, in grote unilamellaire vesicles (GUVs) is aangetoond voor twee dehydratatie-rehydratatie methode - electroformation en gel ondersteunde zwelling. In beide werkwijzen worden kleine unilamellaire blaasjes die het eiwit gefuseerd aan GUVs die vervolgens kan worden onderzocht door fluorescentie microscopie en patch-clamp elektrofysiologie vormen.

Reconstructie van een transmembraaneiwit, de Voltage-gated ionkanalen, KvAP, in Giant Unilamellaire Blaasjes voor Microscopie en Patch Clamp Studies

Het gepresenteerde protocol beschrijft de analyse van membraaneiwitgemedieerde transport op het niveau van enkelvoudige transporteurs met behulp van porie-overspande, oplosmiddelvrije lipide dubbellagen. Dit wordt bereikt door de creatie van in grote aantallen geproduceerde nanopore-arraychips, gecombineerd met zeer parallelle dataverwerving en analyse, waardoor de toekomstige vestiging van membraaneiwiteffectorscreenings mogelijk wordt.

Membraan transportprocessen geanalyseerd door een Highly Parallel Nanopore Chip System aan Single Protein Resolution

Experimenten op fase gescheiden reus unilamellar blaasjes (GUVs) worden vaak verwaarloosd fysiologische oplossing voorwaarden. Dit werk presenteert benaderingen om te bestuderen van het effect van hoge-zoutgehalte buffer op vloeistof-vloeistof fasenscheiding in geladen multicomponent GUVs als een functie van trans-membraan oplossing asymmetrie en temperatuur.

Fase gedrag van geladen blaasjes onder voorwaarden van symmetrische en asymmetrische oplossing bewaakt met fluorescentie microscopie

Presenteren we een techniek voor contactloze micromanipulation van blaasjes, met behulp van de gelokaliseerde calcium ion verlopen. Microinjection van een calcium Ionenoplossing, in de nabijheid van een gigantische lipide blaasje, is gebruikt om het remodelleren van het lipide membraan, wat resulteert in de productie van membraan buisvormige uitsteeksels.

Membraan remodelleren van gigantische blaasjes in reactie op gelokaliseerde Calcium Ion verlopen

Solid-ondersteund, eiwit-vrij, dubbele fosfolipide dubbelgelaagde membranen (DLBM) kunnen worden omgezet in complexe en dynamische lipide nanobuis netwerken en kunnen dienen als 2D onderop modellen van het endoplasmatisch reticulum.

Spontane vorming en omlegging van kunstmatige lipide nanobuis netwerken als een Bottom-Up-Model voor endoplasmatisch Reticulum

Het doel van het protocol is om de mechanische eigenschappen van de membraan van gigantische blaasjes betrouwbaar te meten met micro pipet aspiratie.

Het verkrijgen van gigantische Unilamellaire hybride blaasjes door elektro vorming en meting van hun mechanische eigenschappen door micropipet aspiratie

Dit protocol beschrijft een proces voor het fabriceren van lipide nanobuisnetwerken met behulp van glijdende kinesinemotiliteit in combinatie met gigantische unilamellaire lipideblaasjes.

Multi-Component Lipid Nanotube Networks fabriceren met behulp van de Gliding Kinesin Motility Assay

Dit artikel presenteert een methode voor het bereiden van samengestelde Giant Unilamellaire blaasjes (cGUV's) met een blaasje-in-blaasjesstructuur, met aangepaste elektrische geleidbaarheid in binnenste, ringvormige en buitenste gebieden. Elektroformatie synthetiseert eenvoudige GUV's, die via osmotische shock worden omgezet in stomatocyten en cGUV's, wat een waardevol model biedt voor het bestuderen van de biofysica van cellen met kern.

Synthese van samengestelde reusachtige unilamellaire blaasjes: een biomimetisch model van nucleaatcellen

Deze beginnershandleiding presenteert een algemeen protocol voor de bereiding van Giant Unilamellaire blaasjes (GUV's) via de druppeloverdrachtsmethode, bespreekt de kritieke stappen en biedt inzichten om mogelijke aanpassingen te helpen die nodig zijn voor verschillende toepassingen, waaronder synthetische biologie en microrobotica.

De druppeloverdrachtsmethode gebruiken om op betrouwbare wijze gigantische unilamellaire blaasjes te bereiden

Ontdek hoe membraan nanotubes uit reuze unilamellaire blaasjes worden getrokken om eiwit-membraan interacties te kwantificeren. Deze methode onthult mechanismen van endocytose en intracellulaire transportprocessen.

Membraan Nanotubes trekken van Giant Unilamellar blaasjes

Meer video's verkennen