Confocale Imaging van Neuropeptide Y-pHluorin: een techniek voor het visualiseren van insuline submodule exocytose in Intact lymfkliertest en menselijke eilandjes

Het algemene doel van deze analyse is om de exocytose van insulinegranules in real time in intacte pancreaseilanden te visualiseren met behulp van confocale microscopie. Deze methode zal belangrijke vragen in het vakgebied van diabetes beantwoorden. Bijvoorbeeld: wat reguleert de insuline-exocytose?

Dit is van cruciaal belang omdat granulefusie de belangrijkste gebeurtenis is in het leven van een bètacel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we intacte eilandjes kunnen gebruiken, waardoor we fusiegebeurtenissen in cellen binnen hun natuurlijke omgeving kunnen waarnemen. Madina Mahkmutova, een PhD-student uit ons laboratorium, zal de techniek demonstreren.

Begin bij aankomst van de pancreaseilandjes door deze over te brengen naar 50 milliliter falcon-buizen en centrifugeer de eilandjessuspensie bij 1.000 toeren per minuut gedurende vijf minuten. De eilandjes zullen zich onderin de buis verzamelen; breng de eilandjes in twee milliliters CMRL-kweekmedium over naar 35 millimeter petri-schalen die niet zijn behandeld voor weefselkweek en incubeer deze bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur vóór de virale infectie. Na isolatie worden ongeveer mouse pancreatic islet equivalents resuspendeerd in twee milliliters CMRL-kweekmedium en overgebracht naar 35 millimeter petri-schalen die niet zijn behandeld voor weefselkweek.

Incubeer het weefsel gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO₂ vóór de virale infectie. Om de virale infectie uit te voeren, voegt u 5 tot 10 µL van de virusstock toe aan elke 35 mm petrischaal met menselijke of muizen-eilandjes in 2 mL CMRL-kweekmedium. Na het kweken van de eilandjes gedurende 24 uur zuigt u het medium af en vervangt u dit door 2 mL CMRL-kweekmedium zonder virus.

Kweek de eilandjes gedurende vier tot zes dagen en vervang het medium elke drie dagen. Bereid de extracellulaire oplossing door de hier vermelde reagentia te combineren en steriliseer de buffer vervolgens door filtratie. Maak een basaal glucosemedium met een uiteindelijke glucoseconcentratie van 3 mM door 75 µL van een 2 M glucosestamoplossing toe te voegen aan 50 mL extracellulaire oplossing.

Om vervolgens hyperglycemisch medium met een uiteindelijke glucoseconcentratie van 16 millimolar te bereiden, voegt u 400 microliters van de twee molar glucose-stockoplossing toe aan 50 milliliters extracellulaire oplossing. Verdun eventuele aanvullende stimuli en extracellulaire oplossing die drie millimolar glucose bevatten. Behandel vóór aanvang van een experiment de dekglasjes voor met 30 microliters van een poly-d-lysine-oplossing van één milligram per milliliter en incubeer deze gedurende één uur.

Spoel de dekglasjes vervolgens grondig af met water. Breng ten minste één uur voor het experiment een groep eilandjes over naar een petri dish van 35 millimeter met extracellulaire oplossing met 3 millimolar glucose. Bewaar de resterende eilandjes bij 37 degrees celsius and 5%carbon dioxide.

Bevestig 30 minuten voor de start van een experiment het dekglas aan de beeldkamer door deze af te dichten met siliconenvet. Bevestig vervolgens de beeldkamer aan het beeldplatform. Breng daarna met een pipet 20 tot 30 eilandjes over naar het met poly-d-lysine behandelde gebied van het dekglas en laat de eilandjes 20 minuten hechten aan het oppervlak.

Deze stap is cruciaal voor het succes van het experiment; we verzamelen ongeveer 20 tot 30 eilandjes in minder dan 10 µL buffer en wachten 20 minuten. Het is belangrijk om te voorkomen dat het dekglas volledig uitdroogt om beschadiging van de eilandjes te vermijden. Terwijl de eilandjes aan het dekglas hechten, wordt het perfusiesysteem voorbereid door het grondig met water te spoelen.

Voeg vervolgens elke oplossing toe aan een ander kanaal, overeenkomstig deze tabel. Verwijder alle luchtbellen uit het systeem door elk kanaal afzonderlijk te openen en de oplossing enkele minuten te laten stromen. Controleer of de doorstroming constant is en of de slang niet lekt.

Sluit vervolgens de enkele inline-oplossingsverwarmer aan op de uitlaatbuis van de perfusie en stel de temperatuur van de uitstromende buffer in op 37 °C. Bereid daarna de vacuümpomp voor. Sluit de slang aan, zet de pomp aan en controleer of de vloeistof wordt afgezogen.

Plaats het beeldvormingsplatform met de eilandjes op de objecttafel van de microscoop en sluit het aan op het perfusiesysteem en de zuigpomp. Vul vervolgens voorzichtig de beeldvormingskamer met de extracellulaire oplossing die drie millimol glucose bevat. Om confocale beeldvorming uit te voeren, lokaliseert u de eilandjes in het gezichtsveld van de microscoop met een lage vergroting.

Zodra de eilandjes in focus zijn, schakelt u over naar objectieven met een hogere vergroting. Open de acquisitiesoftware en activeer de ingebouwde scanmodus. Selecteer xyzt-imaging en configureer vervolgens de acquisitie-instellingen door de argonlaser in te schakelen en deze op 30% in te stellen, gevolgd door de 488 nanometer laserlijn, waarbij de laserpower wordt aangepast naar ongeveer 50% voor pHluorine-excitatie.

Verzamel de emissie tussen 505 en 555 nanometer, waarbij het emissiespectrum van EGFP als leidraad dient. Kies een resolutie van 512 bij 512 pixels. Start de beeldvorming door op de live-knop te drukken en pas de gain-niveaus aan.

Stel het begin- en eindpunt van de z-stack in door scherp te stellen op de bovenkant van het eilandje en 'begin' te selecteren, en ga vervolgens naar het laatste vlak dat scherp gesteld kan worden en selecteer 'n'. Kies een z-stack grootte van 5 µm. Stel het tijdsinterval voor de acquisitie van elke z-stack in op ongeveer 1,5 tot 2 seconden en kies de optie 'acquire until stopped' voor continue beeldvorming.

Druk vervolgens op de startknop om de beeldvorming te initialiseren. Raadpleeg het tekstprotocol voor de stimuleringsprotocollen om korrel-exocytose te induceren. Met behulp van de ingebouwde scanner worden confocale beelden van het eilandje vastgelegd als timelapse-opnamen in minder dan twee seconden.

Bovendien kan deze techniek worden gecombineerd met kleurstoffen voor functionele beeldvorming, zoals kleurstoffen voor membraanpotentiaal of cytosolisch vrij calcium. Om vast te stellen of NP Y-pHluorin inderdaad een geschikt instrument is om de dynamiek van insulinegranules te monitoren, werden geïnfecteerde eilandjes immunogekleurd met antilichamen tegen GFP voor NP Y-pHluorin en de eilandjeshormonen insuline, somatostatine of glucagon. De meeste cellen die NP Y-pHluorin tot expressie brachten, waren bètacellen, aangezien zij ook insuline tot expressie brachten.

Slechts enkele glucagon-positieve alfacellen of somatostatine-positieve deltacellen waren GFP-gelabeld. Belangrijk is dat in geïnfecteerde cellen de NP Y-fusie co-lokaliseerde met insuline. Deze figuur demonstreert dat pHluorin een effectieve pH-sensor is.

Aangezien het verhogen van de intercellulaire pH met 50 millimol ammoniumchloride resulteerde in een toename van meer dan 500% in de intercellulaire fluorescentie, worden granula die NP Y-pHluorin bevatten zichtbaar onder omstandigheden die insuline-exocytose stimuleren, zoals membraandepolarisatie met kaliumchloride, doordat de pH binnen het granulum stijgt bij fusie met het plasmamembraan tijdens de opening van de fusieporie. Met behulp van confocale timelapse-beeldvorming van NP Y-pHluorin-geïnfecteerde eilandjes kunnen individuele secretiegebeurtenissen in bètacellen binnen intacte eilandjes worden gevisualiseerd.

Deze treden op als reactie op directe depolarisatie van het membraan met kaliumchloride of verschillende andere fysiologische stimuli. Bij de basale extracellulaire glucoseconcentratie wordt weinig secretorische activiteit waargenomen. Granulufusie met het plasmamembraan wordt echter getriggerd als reactie op stimulatie met een hoge glucoseconcentratie.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals immunohistochemie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals waarom granulefusie plaatsvindt in specifieke regio's van de cel. Na de ontwikkeling is deze techniek gebruikt om het temporele patroon van insulinegranulesectie in bètacelpopulaties in menselijke eilandjes te onderzoeken.