Name: Confocale Imaging van Neuropeptide Y-pHluorin: een techniek voor het visualiseren van insuline submodule exocytose in Intact lymfkliertest en menselijke eilandjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Leer confocale microscopie voor real-time visualisatie van insulinegranule-exocytose in intacte pancreas-eilandjes met behulp van pHluorin. Deze methode biedt inzicht in de regulatie van insulinesecretie voor diabetesonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedanken Marcia Boulina uit de DRI imaging core faciliteit voor hulp met de microscopen. Dit werk werd gesteund door de NIH subsidies 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 en R56 DK084321 (AC).

het Comité dierenethiek van de Universiteit van Miami heeft goedgekeurd alle experimenten.
 1. virale besmetting van Intact geïsoleerde menselijke of muis alvleesklier eilandjes <ol><li>Islet cultuur: de islet voedingsbodems bereiden: Connaught medische onderzoek laboratoria (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS en 2 mM L-Glutamine.
	<ol><li>Mens alvleesklier eilandjes worden verkregen van de geïntegreerde Islet distributie programma (NIDDK, NIH). Transfer bij aankomst, de eilandjes (~ 500 islet equivalenten) op 35-mm niet-Weefselkweek behandeld petrischaaltjes met 2 mL CMRL voedingsbodems bij 37 ° C, 5% / 95% CO 2/o 2 gedurende 24 uur vóór de virale infectie.</li>
		<li>Muis alvleesklier eilandjes kunnen worden geïsoleerd na eerder vastgestelde protocollen 16. Na isolatie, cultuur ~ 200 islet equivalenten in 35-mm niet-Weefselkweek behandeld petrischaaltjes met 2 mL CMRL voedingsbodems bij 37 ° C, 5% / 95% CO 2/o 2 gedurende 24 uur vóór de virale infectie. 
		Opmerking: Vermijd het gebruik van transgene muizen met GFP of YFP verslaggevers uitgedrukt op eilandjes te vermijden fluorescentie overlapping met NPY-pHluorin.</li>
	</ol></li> <li>Virus voorbereiding Opmerking: de NPY-pHluorin-fusie was gekloond in de pcDNA3 vector 10 en subcloned in een adenovirale vector voor adenovirale productie [adenovirus serotype 5 (DE1/E3)] door een recombinant adenovirus productiebedrijf. Het virus werd aliquoted en opgeslagen bij-80 ° C. De virale voorraad wordt geleverd door het bedrijf op titers van 10 12 tot en met 10 13 virale deeltjes (~ 3 x 10 10 - 3 x 10 11 PFU).
	<ol><li>Voor in vitro islet infectie, gebruik 10 6 PFU/mL, resulterend in een geschatte multipliciteit van infectie (MOI) van ongeveer 2 (Zie discussie voor details)</li></ol></li>
	<li>Virale infectie van de alvleesklier eilandjes 
	Let op: Werken met adenovirussen vereist Biosafety Level 2 (BSL2) procedures en certificering. Controleer met de institutionele bioveiligheid Officer voor begeleiding en opleiding op BSL2 procedures.
	<ol><li>Bereiden mens/muis eilandjes zoals hierboven beschreven.</li>
		<li>5-10 µL van voorraad virus toevoegen aan elk 35-mm petrischaal met mens/muis eilandjes in 2 mL zuiver CMRL voedingsbodems (met 10% FBS en 2 mM L-Glutamine). 
		Opmerking: Het volume van de gebruikte volgens de virale titer zoals voorzien door het bedrijf gegevensblad virus.</li>
		<li>De kleine eilandjes in het virus-bevattende cultuur media op 37 °C/5% CO 2 voor 24 h.</li>
		<li>Na 24 h, gecombineerd het virus-bevattende media en vervangen met 2 mL CMRL voedingsbodems (met 10% FBS en 2 mM L-Glutamine).</li>
		<li>De eilandjes voor 4-6 dagen bij 37 °C/5% CO 2, ter vervanging van de media om de 3 dagen cultuur.</li>
		<li>Na 4 - 6 dagen van kweken, verwachten ongeveer 30% van de eilandjecellen besmet. Eilandjes kunnen vervolgens worden gebruikt voor levende imaging experimenten.</li>
	</ol></li></ol> 2. Confocale Imaging van besmet eilandjes Opmerking: verwijzen naar de Tabel van materialen voor de materialen en het nodige materiaal voor confocal imaging.
<ol><li>Reagens voorbereiding en experimentele opzet <ol><li>bereiden extracellulaire oplossing: toevoegen van 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2.56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7.4, steriele gefilterd. 
		Opmerking: Deze buffer is normaal bereid zonder glucose en kan tot 1 maand bij 4 ° C worden bewaard. Glucose wordt toegevoegd op de dag van het experiment te bereiken van de gewenste eindconcentratie.
		<ol><li>Voorbereiden basale glucose (3 mM) medium: 75 µL van 2 M glucose stock toevoegen aan 50 mL extracellulaire oplossing.</li>
			<li>Hyperglycemic (16 mM) medium: 400 µL van 2 M glucose stock toevoegen aan 50 mL extracellulaire oplossing</li></ol>
		</li> <li>Een extra stimulans (b.v., KCl of adenosinetrifosfaat (ATP)) in extracellulaire oplossing met 3 mM glucose verdunnen.</li>
		<li>Voorbehandeling voordat u begint een experiment, de coverslips met poly-D-lysine door 30 µL van poly-D-Lysine oplossing (1 mg/mL) toe te voegen aan het dekglaasje aan voor 1 h en het grondig te spoelen met H 2 O. 
		Opmerking: De coverslips van de poly-lysine bekleed kan worden achtergelaten bij kamertemperatuur voor maximaal 6 maanden.</li>
		<li>Ten minste 1 uur voordat het experiment, met behulp van een precisiepipet 1 mL, de eilandjes overbrengen in een 35-mm petrischaal met extracellulaire oplossing met 3 mM glucose. Houd de eilandjes op 37 ° C en 5% CO 2. 
		Opmerking: Indien nodig, het plasma-membraan kan worden aangeduid in deze stap. Om een label met het plasma-membraan, voeg toe 2 µM di-8-ANEPP kleurstof aan de extracellulaire oplossing met 3 mM glucose. Incubeer de eilandjes in de kleurstof oplossing gedurende 1 uur bij 37 °C/5% CO 2. Het plasmamembraan kleurstof kan worden enthousiast op 488 nm en gedetecteerd op 620 nm.</li>
		<li>min voordat een experiment, hechten het dekglaasje aan aan de beeldvorming kamer door het afdichten met vacuüm Siliconenvet. De imaging zaal aan het imaging platform vast te stellen. 20-30 eilandjes met behulp van een precisiepipet, plaats op het gebied van poly-D-Lysine-testgroep van het dekglaasje aan en laat de eilandjes aan de oppervlakte voor 20 min. 
		Opmerking: Het is belangrijk niet te laten het dekglaasje aan volledig opdrogen om islet schade voorkomen.</li>
		<li>Terwijl de eilandjes zijn vast te houden aan het dekglaasje aan, bereid de perfusie-systeem door het grondig te spoelen met water. Elke oplossing op een ander kanaal toevoegen: 3 mM glucose (kanaal 1), 16 mM glucose (kanaal 2), 16 mM glucose met 100 µM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) en 10 µM forskolin (kanaal 3), 25 mM KCl 3 mM glucose (kanaal 4), 10 µM ATP in (glucose) 3 mM kanaal 5). Alle bubbels uit het systeem verwijderen door de opening van elk kanaal afzonderlijk en laten de stroom van de oplossing voor een paar minuten, en ervoor te zorgen dat de stroom is consistent (0,5 mL/min) en de slang niet lekt.</li>
		<li>De interne inline oplossing kachel verbinden met de perfusie uitlaat buis en aanpassen van de temperatuur van de uitstromende buffer tot 37 ° C.</li>
		<li>Bereiden de afzuigpomp. Alle bubbels uit het systeem verwijderen en ervoor te zorgen dat de stroom consistent is en de slang niet lekt.</li>
		De imaging zaal opvullen <li>zodra de eilandjes houden aan het oppervlak van het dekglaasje aan, zachtjes met de extracellulaire oplossing met 3 mM glucose. Voorkomen wassen de eilandjes uit de buurt van het oppervlak van het dekglaasje aan.</li>
		<li>Plaats van de imaging platform met de eilandjes op het podium van de Microscoop en het verbinden van de perfusie systeem en de afzuigpomp.</li>
		<li>Beurt op de stroom en voortdurend perfuse de eilandjes met de extracellulaire oplossing van 3G. Het systeem is nu klaar voor confocal imaging.</li>
	</ol></li> <li>Confocal imaging <ol><li>Ga naar de eilandjes in het veld microscoop met lagere vergroting. Zodra gericht op de eilandjes, overschakelen naar hogere vergroting doelstellingen (b.v., 63 X water onderdompeling doelstelling (63 X / 0.9 nb)).</li>
		<li>Open de overname softwarematig (Tabel van materialen) en activeer de modus resonant scanner.</li>
		<li>De XYZT imaging-modus selecteren en configureren van de overname-instellingen als volgt: <ol><li>draaien op de Argon laser en de 488 nm laser lijn en aanpassen van de kracht van de laser tot 50% voor pHluorin excitatie.</li>
			<li>Verzamelen emissie bij 505-555 nm.</li>
			<li>Kiest u een resolutie van 512 x 512 pixels. Druk op de &#34; Live &#34; knop om te beginnen van beeldvorming en aanpassen van de niveaus van de winst (typisch winst is ongeveer 600 V).</li>
			<li>Stelt u de begin- en eindtijden van de z-stack: focus op de bovenkant van het rotseilandje en kies &#34; begin &#34; en ga naar de laatste vliegtuig dat kan worden gericht en kies &#34; einde &#34;. Gebruik een z-stap grootte van 5 µm. De software berekent automatisch het aantal confocal vliegtuigen.</li>
			<li>Stelt het tijdsinterval voor de overname van elke z-stack dicht bij 1.5-2 s en kies de optie &#34; verwerven totdat deze wordt gestopt &#34; voor continue imaging.</li>
			<li>Druk op de &#34; start &#34; knop aan initialize.</li>
		</ol></li> <li>Verschillende stimulatie protocollen voor het opwekken van de submodule exocytose door zoogdierlevercellen de eilandjes met de gewenste stimuli gebruiken. Stimulatie protocollen kunnen worden aangepast aan de gewenste wetenschappelijk doel (zie hieronder).</li>
	</ol></li> <li>Stimulatie protocollen Opmerking: In elke stimulatie protocol, beginnen met het opnemen van ten minste 2 min van islet achtergrond activiteit tijdens constante perfusie met extracellulaire oplossing met 3 mM glucose. Perfuse met een stimulans voor de gewenste periode. De volgorde van stimulerende middelen, duur van de stimulatie en duur van de opnames kan worden aangepast aan de gewenste wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt. Zorg ervoor dat eilandjes grondig wassen met extracellulaire oplossing met 3 mM glucose voordat u begint een nieuwe stimulatie. Hieronder vindt u de monster stimulatie protocollen die zijn gebruikt om aan te tonen de mogelijkheden van de methode.
	<ol><li>Stimuleren met ammoniumchloride (NH 4 Cl) als positieve controle voor pHluorin pH gevoeligheid en efficiëntie van de virale infectie ( Figuur 3): 3 mM glucose (2 min) &#8594; 50 mM NH 4 Cl (2 min) in 3 mM glucose &#8594; 3 mM glucose (2 min) Opmerking: In het NH 4 Cl oplossing, NaCl vervangen op basis van mengsel.</li>
		<li>Stimuleren insuline submodule exocytose doordat de concentratie glucose ( Figuur 5 en Figuur 6): 3 mM glucose (2 min) &#8594; 16 mM glucose (15-30 min) &#8594; 3 mM glucose (2 min 
		Opmerking: Om te kunnen zien meerdere uitbarstingen van activiteit, de eilandjes voortdurend met de 16 G oplossing voor ten minste 15 min. perfuse 
		Opmerking: Teneinde de consistentie van secretoire reacties 17, kunnen gebruikers cAMP-raising agenten (100 µM IBMX en 10 µM forskolin) toevoegen aan zowel de 3 G en 16 G oplossingen. Dit verandert niet de temporele patronen van submodule secretie. Voor details zie 15 en discussie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+insulin+granule+biogenesis+and+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis.</a> Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).</li>
<li>Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta-cell+identity%2C+glucose+sensing+and+the+control+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion.</a> Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).</li>
<li>Rorsman, P., Renstrom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+granule+dynamics+in+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells.</a> Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).</li>
<li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).</li>
<li>Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vti1a+identifies+a+vesicle+pool+that+preferentially+recycles+at+rest+and+maintains+spontaneous+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission.</a> Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).</li>
<li>Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+insulin+vesicle+dynamics+during+pulsatile+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion.</a> Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).</li>
<li>Ohara-Imaizumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+exocytosis+and+endocytosis+of+insulin+secretory+granules+in+the+pancreatic+beta-cell+line+MIN6+using+pH-sensitive+green+fluorescent+protein+%28pHluorin%29+and+confocal+laser+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy.</a> Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).</li>
<li>Whim, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta+cells+synthesize+neuropeptide+Y+and+can+rapidly+release+peptide+co-transmitters%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters.</a> PLoS One. 6 (4), e19478(2011).</li>
<li>Tsuboi, T., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forms+of+%26%2334%3Bkiss-and-run%26%2334%3B+exocytosis+revealed+by+evanescent+wave+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forms of &#34;kiss-and-run&#34; exocytosis revealed by evanescent wave microscopy.</a> Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).</li>
<li>Zhu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+I+and+IX+function+redundantly+in+controlling+fusion+pore+of+large+dense+core+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles.</a> Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).</li>
<li>Aoki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+of+fusion+pore+opening+and+the+amount+of+hormone+released+are+regulated+by+myosin+II+during+kiss-and-run+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis.</a> Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).</li>
<li>Felmy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+cargo+release+from+dense+core+granules+by+size+and+actin+network%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network.</a> Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Gandasi, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+Red+Fluorescence+Proteins+as+Markers+for+Secretory+Granule+Exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis.</a> PLoS One. 10 (6), e0127801(2015).</li>
<li>Almaca, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+coordination+of+insulin+granule+exocytosis+in+intact+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets.</a> Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).</li>
<li>Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lepr%28db%29+mouse+model+of+type+2+diabetes%3A+pancreatic+islet+isolation+and+live-cell+2-photon+imaging+of+intact+islets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets.</a> J Vis Exp. (99), e52632(2015).</li>
<li>Hanna, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kiss-and-run+exocytosis+and+fusion+pores+of+secretory+vesicles+in+human+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells.</a> Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).</li>
<li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+transfection+of+isolated+pancreatic+islets%3A+a+study+of+programmed+cell+death+%28apoptosis%29+and+islet+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function.</a> J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).</li>
<li>Michael, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cargo+proteins+in+pancreatic+beta-cells%3A+design+determines+secretion+kinetics+at+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis.</a> Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).</li>
<li>Serre-Beinier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cx36+makes+channels+coupling+human+pancreatic+beta-cells%2C+and+correlates+with+insulin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression.</a> Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).</li>
<li>Rutter, G. A., Hodson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+cell+connectivity+in+pancreatic+islets%3A+a+type+2+diabetes+target%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target?</a> Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).</li>
<li>Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pHuji%2C+a+pH-sensitive+red+fluorescent+protein+for+imaging+of+exo-+and+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis.</a> J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).</li>
<li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dit manuscript beschrijft een techniek die kan worden gebruikt voor het visualiseren van exocytose van insuline korrels in beta cellen binnen intact alvleesklier eilandjes door confocale microscopie. Het maakt gebruik van NPY-pHluorin als de fluorescerende verslaggever gekloond in adenovirus een hoge transfectie efficiëntie te waarborgen.
Hoewel de methode uiterst efficiënt in onze handen was, het wellicht enkele wijzigingen die vooral afhankelijk zijn van twee parameters: 1) de kwaliteit van ...

Insuline wordt geproduceerd door de beta-cellen van de alvleesklier eiland en is een zeer belangrijke regelgever van glucose metabolisme1. Overlijden of disfunctie van beta cellen glucose homeostase verstoort en leidt tot diabetes2. Insuline is verpakt in dichte-core submodules die worden uitgebracht in een Ca2 +-afhankelijke manier3. Het is van essentieel belang om volledig te begrijpen wat bepaalt insuline secretie en opent nieuwe mogelijkheden voor de identificatie van nieuwe therapeutische doelen voor de behandeling van diabetes ophelderen hoe insuline submodule exocytose is geregeld.
Insuline exocytose is uitgebreid bestudeerd met behulp van elektrofysiologische benaderingen, zoals membraan precisiecapaciteit metingen en microscopische benaderingen in combinatie met fluorescerende moleculen. Membraan precisiecapaciteit metingen hebben goede temporele resolutie en toestaan van eencellige opnames. Echter veranderingen in de capaciteit weerspiegelen de mutatie in de oppervlakte van de cel en niet individuele fusion gebeurtenissen of insuline submodule fusie van andere niet-insuline secretoire blaasjes3onderscheiden. Microscopische benaderingen, zoals twee-foton of totale interne reflectie (TIRF) fluorescentie microscopie in combinatie met fluorescerende sondes en vesikel lading eiwitten, bieden extra detail. Deze technieken vangen enkele exocytotic evenementen en ook de pre- en post exocytotic etappes en kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de exocytotic patronen in populaties van cellen3.
Fluorescerende verslaggevers zijn drie soorten: 1) de extracellulaire, 2) cytoplasmatische of 3) vesiculaire. 1) extracellulaire verslaggevers zijn polar traceurs (bijvoorbeeld, dextrans, sulforhodamine B (SRB), lucifer geel, pyranine) die kunnen worden ingevoerd via de extracellulaire milieu-4. Het gebruik van de polar verklikstoffen zorgt voor het onderzoek van de fusie porie in een bevolking van cellen en vangt diverse intercellulaire structuren zoals bloedvaten. Echter, zij niet meldt op vesikel lading gedrag. 2) cytoplasmatische verslaggevers zijn fluorescerende sondes gekoppeld aan membraan-geassocieerde eiwitten die gezicht van het cytoplasma en zijn betrokken bij docking en exocytose. Voorbeelden zijn leden van de familie oplosbare Nfactor - ethylmaleimide-sensitive bijlage eiwit receptor (SNARE) die met succes zijn gebruikt in de neurowetenschappen voor het bestuderen van de neurotransmitter versie5. Dergelijke eiwitten bevatten meerdere bindende partners en zijn niet insuline-submodule specifieke. 3) vesiculaire verslaggevers zijn fluorescerende sondes gesmolten aan vesiculaire lading eiwitten die voor het onderzoek van lading-specifieke vesikel gedrag toestaan. Insuline-submodule specifieke lading eiwitten bevatten insuline, c-peptide islet amyloïde polypeptide en NPY o.a.6,7. NPY is alleen aanwezig in de insuline die submodules bevatten, en wordt mede uitgebracht met insuline, waardoor het een uitstekende partner voor een fluorescerende verslaggever8.
De fusie van verschillende fluorescente proteïnen te NPY eerder heeft gewerkt aan het bestuderen van de verschillende aspecten van exocytose in neuro-endocriene cellen, zoals bijvoorbeeld het vereiste van specifieke synaptotagmin isoforms9,10 en hoe de tijdsverloop van release hangt af van het cytoskelet actine en myosin II11,12. In deze studie kozen we pHluorin als de fluorescerende verslaggever, die is een gemodificeerde GFP thats niet-belichting fluorescerende bij de zure pH in dichte kern korrels, maar wordt helder fluorescerende bij blootstelling aan de neutrale extracellulaire pH-13. Volwassen insuline korrels hebben een zure pH onder de 5.5. Zodra de submodule met de plasmamembraan en opent smelt, wordt de lading wordt blootgesteld aan de neutrale extracellulaire pH van 7,4, waardoor het gebruik van de pH-gevoelige eiwitten-pHluorin als verslaggever7,14.
Gezien de gevoelige aard van de pH van de pHluorin en de selectieve expressie van NPY in insuline korrels, kan de structuur van de fusie van de NPY-pHluorin worden gebruikt om te bestuderen van de verschillende eigenschappen van insuline submodule exocytose. De virale levering van de fusion constructie zorgt voor een hoge transfectie efficiëntie en werkt op primaire beta cellen of cellijnen en geïsoleerde eilandjes. Deze methode kan ook worden gebruikt als een richtsnoer voor de studie van exocytose in een ander celtype met NPY-bevattende blaasjes. Het kan ook worden gecombineerd met een transgeen muismodel effecten van bepaalde voorwaarden (knockdowns, overexpressie, enz.) te bestuderen op exocytose. Deze techniek is eerder gebruikt voor het karakteriseren van de ruimtelijke en temporele patronen van insuline secretie van de submodule in bèta cel populaties in menselijke eilandjes15.

<table><tbody><tr><td>Upright laser-scanning confocal microscope</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>TCS-SP5</td><td>includes LAS AF, the image acquisition software</td></tr><tr><td>Imaging chamber</td><td>Warner instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Imaging chamber platform</td><td>Warner instruments</td><td>PH-1</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 glass coverslips</td><td>Daiggerbrand</td><td>G15972H</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum silicone grease</td><td>Sigma</td><td>Z273554-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel perfusion system</td><td>Warner instruments</td><td>VC-8</td><td></td></tr><tr><td>Single inline solution heater</td><td>Warner instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Temperature controller</td><td>Warner instruments</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Suction pump</td><td>Pharmacia</td><td>P-1</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish, non-tissue culture treated</td><td>VWR</td><td>10861-586</td><td></td></tr><tr><td>CMRL Medium, no glutamine</td><td>ThermoFisher</td><td>11530037</td><td></td></tr><tr><td>FBS, heat inactivated</td><td>ThermoFisher</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl solution</td><td>Sigma</td><td>S5150</td><td></td></tr><tr><td>3 M KCl solution</td><td>Sigma</td><td>60135</td><td></td></tr><tr><td>1 M CaCl2 solution</td><td>Sigma</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2 solution</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES solution</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum filter</td><td>VWR</td><td>431098</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANNEP</td><td>ThermoFisher</td><td>D3167</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F3917</td><td></td></tr></tbody></table>

confocale imaging van neuropeptide y-phluorin: een techniek voor het visualiseren van insuline submodule exocytose in intact lymfkliertest en menselijke eilandjes

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

Insuline secretie speelt een centrale rol in de homeostase van de glucose onder normale fysiologische omstandigheden zo goed zoals ziekte. Huidige benaderingen ter studie van insuline submodule exocytose gebruik electrofysiologie of microscopie gekoppeld aan de expressie van fluorescerende verslaggevers. Echter de meeste van deze technieken zijn geoptimaliseerd voor klonen cellijnen of vereisen distantiëren van de alvleesklier eilandjes. Daarentegen voorziet de methode die hier gepresenteerd in real-time visualisatie van insuline submodule exocytose in intact alvleesklier eilandjes. In dit protocol beschrijven we eerst de virale besmetting van geïsoleerde alvleesklier eilandjes met adenovirus die een pH-gevoelige groen fluorescente proteïne (GFP), pHluorin codeert, gekoppeld aan neuropeptide Y (NPY). Ten tweede, beschrijven we de confocal imaging van eilandjes vijf dagen na virale infectie en hoe u kunt controleren de secretie van insuline submodule. De besmette eilandjes zijn kort, geplaatst op een dekglaasje aan op een imaging kamer en beeld onder een rechtop scannen van laser confocal microscoop terwijl wordt voortdurend geperfundeerd met extracellulaire oplossing die verschillende prikkels. Confocale beelden verspreid over 50 µm van het eiland zijn verworven als time-lapse opnamen met behulp van een fast-resonant scanner. De fusie van insuline korrels met het plasma-membraan kan na verloop van tijd worden gevolgd. Deze procedure ook zorgt voor het testen van een batterij van stimuli in een één experiment, is compatibel met zowel muis als menselijke eilandjes en kan gecombineerd worden met verschillende kleurstoffen voor functionele beeldvorming (bijv., membraan potentiële of cytosolische calcium kleurstoffen).

De volledige workflow van de techniek is afgebeeld in Figuur 1. Muis of menselijke eilandjes kunnen kort worden besmet met adenovirus codering van NPY-pHluorin en beeld, na paar dagen in cultuur, onder een confocal microscoop. Zoals korrels zekering met plasma-membraan en open, een verhoging van fluorescentie is waargenomen en kunnen worden gekwantificeerd (Figuur 1). Om te bepalen als NPY-pHluorin inderdaad een geschikt hulpmidd...

Beschrijven we een protocol voor visualisatie van insuline exocytose in intact eilandjes met behulp van pHluorin, een pH-gevoelige groen fluorescent proteïne. Geïsoleerde eilandjes zijn besmet met adenovirus codering pHluorin gekoppeld aan het blaasje lading neuropeptide Y. Dit zorgt voor de detectie van insuline submodule fusion gebeurtenissen door confocale microscopie.

Confocale Imaging van Neuropeptide Y-pHluorin: een techniek voor het visualiseren van insuline submodule exocytose in Intact lymfkliertest en menselijke eilandjes

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...

Het algemene doel van deze analyse is om de exocytose van insulinegranules in real time in intacte pancreaseilanden te visualiseren met behulp van confocale microscopie. Deze methode zal belangrijke vragen in het vakgebied van diabetes beantwoorden. Bijvoorbeeld: wat reguleert de insuline-exocytose?Dit is van cruciaal belang omdat granulefusie de belangrijkste gebeurtenis is in het leven van een bètacel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we intacte eilandjes kunnen gebruiken, waardoor we fusiegebeurtenissen in cellen binnen hun natuurlijke omgeving kunnen waarnemen. Madina Mahkmutova, een PhD-student uit ons laboratorium, zal de techniek demonstreren.Begin bij aankomst van de pancreaseilandjes door deze over te brengen naar 50 milliliter falcon-buizen en centrifugeer de eilandjessuspensie bij 1.000 toeren per minuut gedurende vijf minuten. De eilandjes zullen zich onderin de buis verzamelen; breng de eilandjes in twee milliliters CMRL-kweekmedium over naar 35 millimeter petri-schalen die niet zijn behandeld voor weefselkweek en incubeer deze bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur vóór de virale infectie. Na isolatie worden ongeveer mouse pancreatic islet equivalents

confocal-imaging-neuropeptide-y-phluorin-technique-to-visualize

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video describes the technique of imaging islet cells in real-time, to study the changes in cytosolic calcium concentration in the minor subpopulations of the pancreatic islet cells. Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells. This can provide an insight into the cross talk between the blood glucose and the islet secretory output.

Imaging Calcium Dynamics in Pancreatic Cells: A Technique to Study Real-time Changes in Cytosolic Calcium Concentration in Pancreatic Islet

Opklaren is een krachtige tool waarmee beeldvorming verschillende biologische processen in levende dieren. In dit artikel presenteren we een gedetailleerde werkwijze voor het afbeelden van de dynamiek van subcellulaire structuren, zoals de secretoire granules in de speekselklieren van levende muizen.

Intravitale Microscopy for Imaging Subcellulaire Structuren in Levende muizen die fluorescerende eiwitten

We presenteren hier een protocol voor de isolatie van eilandjes uit het muismodel van type 2 diabetes, Leprdb en details van een live-cel assay voor het meten van insulinesecretie uit intacte eilandjes dat gebruikmaakt van 2 foton microscopie.

LepR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Model van Type 2 Diabetes: eilandjes van Langerhans Isolatie en live-cell 2-Photon Imaging van intacte Eilandjes

Dit protocol wordt een techniek beschreven voor observatie van de real-time groen fluorescentie proteïne (GFP) gelabeld Glucose Transporter 4 (GLUT4) eiwit mensenhandel op insuline stimulatie en karakterisering van de biologische rol van CCR5 in de insuline-GLUT4 signalering traject met deconvolutie microscopie.

Live beelden van GLUT4 eiwit mensenhandel muis primaire hypothalame neuronen met behulp van deconvolutie microscopie

Hier presenteren we een protocol bij afbeelding menselijke alvleesklier secties in drie dimensies (3D) met behulp van geoptimaliseerde passieve methoden wissen. Dit manuscript toont deze procedures voor de passieve optische clearing gevolgd door meerdere immunofluorescentie kleuring ter identificatie van de belangrijkste elementen van de autonome en zintuiglijke neurale netwerken innervating menselijke eilandjes.

Hoge resolutie 3D beeldvorming van het Neuro-insulaire netwerk van menselijke alvleesklier

Hier detail we een methode om levende cellen beeldvorming van gereglementeerde exocytose. Deze methode maakt gebruik van FITC-dextran, die hoopt zich op in lysosoom-gerelateerde organellen, als verslaggever. Deze eenvoudige methode kan ook onderscheid te maken tussen de verschillende modi van gereglementeerde exocytose in cellen die moeilijk zijn te genetisch manipuleren.

Imaging FITC-dextran als verslaggever voor gereglementeerde exocytose

Dit protocol schetst een methode voor kwantitatieve analyse van mitophagy eiwit complexvorming specifiek in bètacellen van primaire menselijke eilandje monsters. Deze techniek maakt dus analyse van mitophagie van beperkt biologisch materiaal mogelijk, die cruciaal zijn in de voorbeelden van kostbare humane alvleesklier bètacellen.

Visualisatie van endogene Mitophagie complexen in situ in humane pancreas Bètacellen met behulp van proximity Ligatie test

Hier presenteren we een protocol voorbeeld vorming en kwantificeren van de calcium dynamica in heterogene celpopulaties, zoals de eiland cellen van de alvleesklier. Fluorescerende verslaggevers worden geleverd in de perifere laag van cellen binnen het eilandje, die vervolgens wordt geïmmobiliseerd en imaged, en per-cel analyse van de dynamiek van de intensiteit van de fluorescentie wordt uitgevoerd.

Imaging calcium dynamica in subpopulaties van muizen pancreatic eilandje cellen

Deze studie presenteert de toepassing van levende pancreasweefselplakken op de studie van eilandjesfysiologie en eiland-immuuncelinteracties.

Observeren van eilandjesfunctie en eiland-immuuncelinteracties in levende pancreasweefselplakken

Dit protocol beschrijft hoe menselijke alvleesklierplakjes van overleden orgaandonoren kunnen worden gegenereerd om de celfunctie onder bijna-fysiologische omstandigheden te bestuderen. Deze innovatieve aanpak maakt het mogelijk om normale en structureel beschadigde eilandjes te onderzoeken en de ingewikkelde wisselwerking tussen endocriene en exocriene compartimenten.

Het genereren van plakjes menselijk pancreasweefsel om endocriene en exocriene pancreasfysiologie te bestuderen

We hebben een Duplex in situ hybridisatietest opgezet om insulinereceptorisovormen IR-A en IR-B in de plexus choroid muizen in kaart te brengen, waardoor de beperkingen van traditionele methoden worden overwonnen. Deze benadering met hoge resolutie onthult isovormspecifieke expressie en biedt nieuwe inzichten in insulinesignalering in de hersenen en mogelijke isovormgerichte therapieën voor neurologische aandoeningen.

Nauwkeurige visualisatie van insulinereceptoren A en B in de hersenen van muizen met een RNA in situ hybridisatietest

Leer confocale microscopie voor real-time visualisatie van insulinegranule-exocytose in intacte pancreas-eilandjes met behulp van pHluorin. Deze methode biedt inzicht in de regulatie van insulinesecretie voor diabetesonderzoek.

Confocale Imaging van Neuropeptide Y-pHluorin: een techniek voor het visualiseren van insuline submodule exocytose in Intact lymfkliertest en menselijke eilandjes (Video) | JoVE Journal

Confocale Imaging van Neuropeptide Y-pHluorin: een techniek voor het visualiseren van insuline submodule exocytose in Intact lymfkliertest en menselijke eilandjes

Meer video's verkennen