In Vitro Karakterisering van de elektrofysiologische eigenschappen van Colon Afferent vezels in ratten

Het algemene doel van dit protocol is om de methodologie voor de elektrofysiologische opnames van sensorische zenuwen van het colorectum in vitro te demonstreren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in vitro penveld, zoals de bijdrage van de buitenste perifere efferente gevoeligheid om hyperalgesie te corrigeren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de onderscheiding van het colorectum mogelijk maakt op dezelfde manier als de halsslagaderonderscheiding wordt uitgevoerd in vivo, bij dieren of bij patiënten.

Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat het lokaliseren van de ganglia en het dissekeren van de zenuwen relatief moeilijk is. Om deze procedure te beginnen, stel de buikholte van een diep geanestheseerde rat bloot door een middenlijnsnede op de buikwand uit te voeren met een scalpel. Trek vervolgens het mesenterium en andere weefsels opzij om het colorectum bloot te leggen.

Plaats vervolgens het dier onder de dissectiemicroscoop. Door zorgvuldige dissectie lokaliseert u het linker bekkenganglion en identificeert u de bekkenzenuwen en de lumbale splanchnische zenuwen die zich eraan aansluiten. Snijd vervolgens deze zenuwen enkele millimeters van het bekkenganglion af.

Het lokaliseren van het bekkenganglion en het dissekeren van zenuwen is de meest cruciale en moeilijke stap van deze procedure. Snijd vervolgens het symfysebeen door om het rectum bloot te leggen. Verwijder de weefsels boven het colorectum en zorg ervoor dat het bekkenganglion intact blijft.

Na het doden van de rat door intraveneuze injectie van een overdosis pentobarbital, doorknipt u de dikke darm ongeveer drie centimeter boven het bekkenganglion en verwijdert u het colorectum van het dier met behulp van een pincet. Breng vervolgens het colorectum over in een petrischaal gevuld met voorgekoelde Krebs-oplossing. Verwijder de uitwerpselen door het colon voorzichtig te spoelen.

Verwijder vervolgens de restanten van de blaas en andere weefsels voorzichtig, zonder het bekkenganglion aan te tasten. Plaats in deze procedure de dikke darm in een opnamekamer en doordrenk het weefsel continu met met carbogen voorziene Krebs-oplossing. Kanuleer vervolgens het colorectum aan zowel de orale als anale uiteinden en begin met de intraluminale infusie van de dikke darm met fysiologische zoutoplossing in de oraal naar anaal richting, lokaliseer vervolgens het belangrijkste bekkenganglion onder de dissectiemicroscoop en gebruik insectenpinnen om het ganglion bloot te leggen.

Met zorgvuldige dissectie vindt u een fijne zenuwtak die van het ganglion afkomt en naar de dikke darm loopt, snijd vervolgens de zenuw dicht bij het ganglion af. Voor de volgende stap zet u het verwarmingsbad aan en houdt u de Krebs-oplossing op 34 graden Celsius. Inspecteer nu een vooraf uitgetrokken glaspijpje onder de dissectiemicroscoop.

Breek de punt van de elektrode met een pincet zodat deze een grootte heeft die compatibel is met de diameter van de te registreren zenuw. Zaag vervolgens de punt af door deze dicht bij een lichtvlam te plaatsen. Nieuwelingen in deze methodologie kunnen het lastig vinden om de punt van de elektrode bij de grootte van de zenuw af te zagen.

Plaats vervolgens de afgeschuinde elektrode in de elektrodehouder en sluit een 10 ml-spuit aan op de zijpoort van de houder voor het aanbrengen van negatieve of positieve druk op de elektrode. Verbind vervolgens de houder met de hoofdfase van de bioversterker en monteer de hoofdfase op een manipulator. Beweeg vervolgens de elektrode naar het weefselbad en vul de elektrode met de Krebs-oplossing door lichte zuiging aan te brengen tot deze contact maakt met de zilverdraad van de houder.

Plaats vervolgens de punt van de elektrode dicht bij het gesneden uiteinde van de zenuw en breng negatieve druk aan om de zenuw in de elektrode te zuigen. Breng vervolgens meer negatieve druk aan, zodat ongeveer een millimeter van de zenuw in de elektrode wordt getrokken en een strakke afdichting vormt. Schakel nu de bioversterker in en stel de filter in op 300 tot drieduizend hertz.

Bewaak het signaal op de oscilloscoop en registreer het zenuwsignaal en het intraluminale druksignalen in de spike data verwerkingssoftware. Breng vervolgens een rampuitzetting van de dikke darm aan door de driewegkraan op de uitlaatcanule te sluiten terwijl u intraluminaal doorblijft infunderen. Bewaak de intraluminale druk totdat deze 60 millimeter kwik bereikt, open vervolgens de driewegkraan op de afvoercanule.

Herhaal deze procedure op regelmatige intervallen van vijftien minuten en breng geneesmiddelen extra of intraluminaal toe om de chemische gevoeligheid van de afferente zenuwen te testen. Hier is de schematische illustratie van de experimentele opstelling voor de ex vivo buis colorectum bereiding met een representatieve opname van een zenuw distaal van het bekkenganglion. In de bereidingen van normale ratten hebben de colonische afferente zenuwen typisch een laag niveau van een regelmatige spontane activiteit.

Rampuitzetting van de dikke darm induceert een geleidelijke toename van de vuurfrequentie. De mechanosensorische eigenschappen van elke zenuw worden weergegeven door het plotten van de intraluminale drukafferent zenuwresponscurve. Alternatief kan de registratie worden gemaakt van een tak van de bekkenzenuwen proximaal van het bekkenganglion.

Het profiel van de mechanosensorische activiteit van de proximale bekkenzenuwen is meestal vergelijkbaar met dat gezien in de zenuw distaal van het bekkenganglion. Hoofdcomponentenanalyse van de golfvormen van de actiepotentialen van de multi-eenheidsregistratie kan worden gemaakt om enkele eenheidactiviteit te onderscheiden. Hier zijn de gesuperponeerde golfvormen van twee individuele bekkenafferens.

Eenmaal beheerst, kan deze techniek in twee uur worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van de anatomie van de belangrijkste bekkenganglia en de andere zenuwen en in staat moeten zijn om de ganglia te lokaliseren om de zenuwen te dissekeren en de afferente activiteit te registreren. Een voor