Name: Een gids voor productie, kristallisatie en structuurbepaling van menselijke IKK1/α (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Leer de productie, kristallisatie en structuurbepaling van menselijk IKK1/α voor signaaltransductieonderzoek. Deze methode helpt onderzoekers bij rationeel medicijnontwerp.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken het personeel van de straallijnen 19ID, 24ID en 13ID bij de geavanceerde Photon bron, Lemont, IL, voor ondersteuning tijdens het verzamelen van de gegevens op verschillende kristallen. Wij zijn dankbaar aan Dmitry Lyumkis, Salk Instituut voor het ophalen van de lage resolutie cryo-EM kaart in vroege stadia van EM kaart/modelbouw, die werd gebruikt om de eerste IKK1 moleculaire vervanging zoeken model te bouwen. Het onderzoek leidt tot deze resultaten heeft financiering ontvangen van NIH grants AI064326, CA141722 en GM071862 naar GG. SP is momenteel een Wellcome Trust DBT India tussenliggende Fellow.

<ol><li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB%2C+an+active+player+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+immunology+research%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li>
<li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+inflammation%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140 (6), 883-899 (2010).</li>
<li>Ben-Neriah, Y., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+meets+cancer%2C+with+NF-kappaB+as+the+matchmaker%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker.</a> Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).</li>
<li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).</li>
<li>Karin, M., Ben-Neriah, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+meets+ubiquitination%3A+the+control+of+NF-%5Bkappa%5DB+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity.</a> Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).</li>
<li>Ghosh, S., Karin, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11983155">Missing pieces in the NF-kappaB puzzle.</a> Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).</li>
<li>Sun, S. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22435551">The noncanonical NF-kappaB pathway.</a> Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).</li>
<li>Bonizzi, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+NF-kappaB+activation+pathways+and+their+role+in+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity.</a> Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).</li>
<li>DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytokine-responsive+IkappaB+kinase+that+activates+the+transcription+factor+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB.</a> Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).</li>
<li>Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus+specificity+of+gene+expression+programs+determined+by+temporal+control+of+IKK+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity.</a> Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).</li>
<li>Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IkappaB+kinase+complex+%28IKK%29+contains+two+kinase+subunits%2C+IKKalpha+and+IKKbeta%2C+necessary+for+IkappaB+phosphorylation+and+NF-kappaB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation.</a> Cell. 91 (2), 243-252 (1997).</li>
<li>Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK-gamma+is+an+essential+regulatory+subunit+of+the+IkappaB+kinase+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex.</a> Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).</li>
<li>Yamaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementation+cloning+of+NEMO%2C+a+component+of+the+IkappaB+kinase+complex+essential+for+NF-kappaB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation.</a> Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).</li>
<li>Li, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IKKbeta+subunit+of+IkappaB+kinase+%28IKK%29+is+essential+for+nuclear+factor+kappaB+activation+and+prevention+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis.</a> J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).</li>
<li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+principles+in+NF-kappaB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Shared principles in NF-kappaB signaling.</a> Cell. 132 (3), 344-362 (2008).</li>
<li>Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nuclear+factor-kappaB+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity.</a> Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).</li>
<li>Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAFF-induced+NEMO-independent+processing+of+NF-kappa+B2+in+maturing+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells.</a> Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).</li>
<li>Senftleben, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+by+IKKalpha+of+a+second%2C+evolutionary+conserved%2C+NF-kappa+B+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway.</a> Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).</li>
<li>Coope, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100+to+p52%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52.</a> EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).</li>
<li>Dejardin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lymphotoxin-beta+receptor+induces+different+patterns+of+gene+expression+via+two+NF-kappaB+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways.</a> Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).</li>
<li>Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+p100+processing+by+NF-kappaB-inducing+kinase+involves+docking+IkappaB+kinase+alpha+%28IKKalpha%29+to+p100+and+IKKalpha-mediated+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation.</a> The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).</li>
<li>Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB-inducing+kinase+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100.</a> Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).</li>
<li>Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+basally+translated+NF-kappaB-inducing+kinase+%28NIK%29+protein+functions+as+a+molecular+switch+of+processing+of+NF-kappaB2+p100%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100.</a> J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).</li>
<li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+NF-kappaB+activation+requires+coordinated+assembly+of+a+regulatory+complex+of+the+adaptors+cIAP1%2C+cIAP2%2C+TRAF2+and+TRAF3+and+the+kinase+NIK%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).</li>
<li>Vallabhapurapu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonredundant+and+complementary+functions+of+TRAF2+and+TRAF3+in+a+ubiquitination+cascade+that+activates+NIK-dependent+alternative+NF-kappaB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).</li>
<li>Annunziata, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+engagement+of+the+classical+and+alternative+NF-kappaB+pathways+by+diverse+genetic+abnormalities+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).</li>
<li>Keats, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+mutations+activate+the+noncanonical+NF-kappaB+pathway+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).</li>
<li>Staudt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+activation+of+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22%5BJournal%5D)">Oncogenic activation of NF-kappaB.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109(2010).</li>
<li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS Biol. 11 (6), e1001581(2013).</li>
<li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).</li>
<li>Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IkappaB+kinase+complexes%3A+gateways+to+NF-kappaB+activation+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription.</a> Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).</li>
<li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).</li>
<li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+for+the+Activation+of+IKK1%2Falpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha.</a> Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).</li>
<li>Otwinowski, Z. aM., W, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+X-ray+Diffraction+Data+Collected+in+Oscillation+Mode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode.</a> Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+human+IkappaB+kinase+beta+asymmetric+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?he5368">Phaser crystallographic software.</a> Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Vagin, A. T., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?li5010">MOLREP: an automated program for molecular replacement.</a> J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).</li>
<li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Version+1.2+of+the+Crystallography+and+NMR+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Version 1.2 of the Crystallography and NMR system.</a> Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).</li>
<li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallography+%26+NMR+system%3A+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).</li>
<li>McRee, D. E. <a target="_blank" href="http://www.iucr.org/__data/assets/pdf_file/0010/8983/dem.pdf">XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview.</a> J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).</li>
<li>Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+biomolecular+crystallography+with+low-resolution+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data.</a> Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).</li>
<li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS biology. 11 (6), e1001581(2013).</li>
<li>Christopher, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discovery+of+2-amino-3%2C5-diarylbenzamide+inhibitors+of+IKK-alpha+and+IKK-beta+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+medicinal+chemistry+letters%22%5BJournal%5D)">The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases.</a> Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).</li>
<li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+crystallographic+model+and+data+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Linking crystallographic model and data quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li>
<li>Chen, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MolProbity%3A+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.

Productie, kristallisatie en structuur oplossing van twee verwante IKK eiwitten We bepalen de X-ray kristalstructuur van IKK1/α met de gedachte dat het een relatief eenvoudige oefening gezien onze ervaring met IKK2/β eiwitproductie, kristallisatie en structuurbepaling zou zijn uiteengezet. Maar waren we zeer verrast dat deze twee verwante proteïnen heel anders met betrekking tot het gemak van kristallisatie gedragen. Ondanks pogingen van verschillende spraakmakende laboratoria nam de bepaling van de s...

Transcriptionele activiteiten van de NF-recombination familie van dimeric transcriptiefactoren zijn vereist voor diverse cellulaire functies variërend van ontsteking en immuniteit tot overleving en dood. Deze activiteiten worden strikt gecontroleerd in cellen en een verlies van verordening leidt tot verscheidene pathologische condities, zoals auto-immune aandoeningen en kanker1,2,3. Bij het ontbreken van een stimulans, worden de activiteiten van NF-recombination geremde IκB (remmer van - recombination) eiwitten4bewaard. De fosforylatie van specifieke Ser residuen op IκB eiwitten markeert ze voor ubiquitination en aantasting van de latere remmen of selectieve verwerking5. Twee zeer homologe Ser/Thr kinases, IKK2/β en IKK1/α, fungeren als centrale regulatoren van NF-recombination activiteiten door het uitvoeren van deze fosforylatie gebeurtenissen6,7.
Interacties tussen een ligand en een receptor transduces een signaal door een reeks van bemiddelaars die leiden tot de activering van NF-recombination factoren. De NF-recombination seingeving proces kan globaal worden ingedeeld in twee afzonderlijke trajecten-canonieke en niet-canonieke (alternatieve)8. De activiteit van IKK2/β regelt voornamelijk de NF-recombination signalering van het canonieke leertraject dat essentieel is voor inflammatoire en aangeboren immuunresponsen9. Een duidelijk kenmerk van dit traject is een snelle en kortstondige activering van IKK2/β10 binnen een tot nu toe biochemically genfunctieonderzoek IKK complexe — geacht te worden samengesteld uit IKK1 en IKK2, evenals een regelgevende component, NEMO (NF-recombination essentiële Modulator )11,12,13. Tussen de twee katalytische IKK subeenheden van het complex IKK, IKK2 is voornamelijk verantwoordelijk14 voor de fosforylatie van bepaalde residuen van prototypische IκBs (α en -β, γ-) gebonden aan NF-recombination, en ook een atypische IκB eiwit, NF-κB1/p105, die een voorloper van de NF-recombination p50 subeenheid5. Fosforylering geïnduceerde ubiquitination en remmen de afbraak van IκB (of verwerking van p105) leidt tot de release en de activering van een bepaalde set van NF-recombination Dimeren15. Aberrant NF-recombination activiteit als gevolg van verkeerd gereglementeerde functie van IKK2 heeft waargenomen bij veel kankers zo goed zoals auto-immune aandoeningen2,3,16.
In tegenstelling tot IKK2/β regelt de activiteit van IKK1/α NF-recombination signalering van de niet-canonieke pathway, die essentieel is voor ontwikkeling en immuniteit. IKK1 kinaseenzym specifieke residuen van NF-κB2/p100 op haar C-terminal IκBδ-segment, wat tot de verwerking en de generatie van p52 leidt. De vorming van transcriptionally actieve p52:RelB heterodimer initieert een langzaam en duurzaam antwoord op ontwikkelingsstoornissen signalen7,17,18,19,20. Interessant, is de generatie van de centrale NF-recombination factor p52 van dit traject kritisch afhankelijk van een andere factor, NF-recombination inducerende Kinase (NIK)21,22, maar niet op IKK2 of NEMO. In rustende cellen blijft het niveau van NIK laag vanwege haar constante proteasoom-afhankelijke degradatie23,24,25. Bij stimulatie van cellen door 'niet-canonieke' liganden, en in bepaalde kwaadaardige cellen, NIK wordt gestabiliseerd te werven en te activeren IKK1 / α. Kinase activiteiten van zowel de IKK1 als de NIK zijn essentieel voor een efficiënte verwerking van p100 in p527. IKK1 en NIK phosphorylate drie serines (Ser866, 870 en 872) van NF-κB2/p100 op zijn segment van de C-terminal IκBδ wat leidt tot de verwerking en de generatie van p52. Aberrant activering van de niet-canonieke pathway heeft betrokken bij vele maligniteiten waaronder multiple myeloma26,27,28.
Verscheidene zeer efficiënte en specifieke remmers voor IKK2/β zijn bekend, hoewel niemand tot nu toe hebben bleek te zijn een effectieve drug. In tegenstelling, zijn IKK1/α-specifieke remmers schaars. Dit kan het gevolg zijn deels van ons gebrek aan structurele en biochemische informatieover IKK1/α, waardoor ons begrip van de mechanistische basis van activering van NF-recombination door IKK1 in cellen, en rationele drug design wordt beperkt. De X-ray structuren van IKK2/β voorzien ons van inzichten in het mechanisme van de activering van IKK2/β29; echter, deze structuren niet kon onthullen hoe verschillende upstream prikkels activeren activering van IKK1/α of IKK2/β voor het regelen van verschillende sets van NF-recombination activiteiten 30,31. Om te begrijpen de mechanistische basis ten grondslag liggen aan de duidelijke signaalfunctie van IKK1/α, en om een platform voor rationele drug design, we gericht op het bepalen van de structuur van IKK1/α.

<table><tbody><tr><td>Cellfectin/Cellfectin II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362100</td><td>Cellfectin is nu stopgezet, vervangen door Cellfectin II</td></tr><tr><td>Sf900 III Insect cell medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>SF9 cells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12659017</td><td></td></tr><tr><td>anti-IKK1 antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56704</td><td>Voorheen verkocht door Imgenex</td></tr><tr><td>anti-PentaHis antibody</td><td>Qiagen</td><td>34460</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Nitrocellulose kan ook worden gebruikt</td></tr><tr><td>Ni-NTA agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Bradford assay reagent</td><td>BioRad</td><td>500001</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 column</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>Amicon concentrator</td><td>Millipore</td><td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td><td></td></tr><tr><td>Compound A</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calbiochem IKK-inhibitor XII</td><td>Calbiochem</td><td>401491</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>SIGMA</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>MLN120B</td><td>Millenium</td><td>Gift item</td><td></td></tr><tr><td>AMPPNP</td><td>SIGMA</td><td>A2647</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate</td><td>SIGMA</td><td>51227, 42867, 31404,</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62101</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>SIGMA</td><td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td><td>Sommige van hen zijn nieuwe cat # in het SIGMA-catalogus. Wat we hadden, was oorspronkelijk van Fluka die een andere cat # had.</td></tr><tr><td>Crystallization Screens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-130</td><td></td></tr><tr><td>Index HT</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-134</td><td></td></tr><tr><td>PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-139</td><td></td></tr><tr><td>PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-086</td><td></td></tr><tr><td>SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-136</td><td></td></tr><tr><td>Crystal mounts</td><td>Hampton Research</td><td>HR8-188, 190, 192, 194</td><td></td></tr><tr><td>Synchrotron</td><td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&rsquo;s Argonne National Laboratory</td><td>Beamline 19 ID</td><td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&rsquo;s Argonne National Laboratory biedt ultra-heldere, hoogenergetische, door een opslagring gegenereerde röntgenstralen voor onderzoek in bijna alle wetenschappelijke disciplines.</td></tr></tbody></table>

een gids voor productie, kristallisatie en structuurbepaling van menselijke ikk1/α

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

Een klasse van extracellulaire stimuli vereist activering van IKK1/α voor het opwekken van de generatie van een NF-recombination subeenheid, p52, door verwerking van haar voorloper p100. P52 fungeert als een homodimer of heterodimer met een ander NF-recombination subeenheid, RelB. Deze Dimeren reguleren op hun beurt de expressie van genen die betrokken zijn bij ontsteking, overleving van de cel en celcyclus honderden. IKK1/α blijft voornamelijk geassocieerd met IKK2/β en NEMO als een ternaire complex. Een klein zwembad voor het wordt echter ook als een laag molecuulgewicht complex(es) waargenomen. Het is onbekend of de p100 verwerking activiteit wordt geactiveerd door activering van IKK1/α binnen het grotere of het kleinere complex zwembad. Constitutieve activiteit van IKK1/α is geconstateerd in de verschillende vormen van kanker en ontstekingsziekten. Om te begrijpen van het mechanisme van activering van IKK1/α en het gebruik ervan als een drug target inschakelt, we recombinante IKK1/α uitgedrukt in verschillende hostsystemen, zoals E. coli, insect, en zoogdiercellen. Gelukt insect cellen, verkrijgen van mg hoeveelheden van zeer zuivere eiwitten, het kristalliseren in aanwezigheid van Remmers, en voor het vaststellen van zijn X-ray kristalstructuur uiting van oplosbare IKK1/α in baculovirus besmet. Hier beschrijven we de gedetailleerde stappen voor het produceren van de recombinant eiwit, haar kristallisatie en vastbesloten met X-ray kristal structuur.

Klonen en expressie van verschillende constructies van IKK1/α Volledige lengte die menselijke IKK1/α werd gekloond in de baculovirus expressie vector pFastBacHTa binnen haar beperkingsplaatsen EcoRI en kennisgevingen te verkrijgen van een N-terminal hexa-Histidine gelabeld IKK1. De tag kan worden verwijderd door TEV protease spijsvertering. Aangezien volledige lengte IKK1/α flexibele regio's aan beide uiteinden bevat, en flexibele regio's meestal een eiwit bemoeilijken...

IκB Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) is een Ser/Thr proteïne kinase dat in een horde van cellulaire activiteiten voornamelijk via activering van NF-recombination transcriptiefactoren betrokken is. Hier beschrijven we de belangrijkste stappen die nodig zijn voor de productie en de crystal structuurbepaling van dit eiwit.

Een gids voor productie, kristallisatie en structuurbepaling van menselijke IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Het doel van deze procedure is om richtlijnen te bieden voor de productie, kristallisatie en structurele bepaling van de menselijke IKK1-alpha om de mechanistische basis van zijn signaleringsfunctie te begrijpen en platforms voor rationeel medicijnontwerp te creëren. Deze methode moet onderzoekers helpen bij het bepalen van de structuur van IKK1, die antwoorden zou geven op belangrijke vragen op het gebied van immuunsignalering. Deze techniek beschrijft een gestroomlijnd pad naar het verkrijgen van kristallen van IKK-eiwitten, die nogal refractisch zijn voor kristallisatie en om verschillende kritische informatie te verstrekken bij het overwinnen van knelpunten bij het bepalen van de structuren.Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn bij deze methode het moeilijk hebben, omdat het genereren van milligramhoeveelheden oplosbaar, goed gedragen eiwit vereist, de expressie ervan in insectencellen vereist en kristallisatie kan worden gedaan onder slechts een zeer smal venster van omstandigheden. De moleculaire vervangingsprocedure die wordt gebruikt bij het bepalen van de structuur van IKK1 kan ook erg lastig zijn, vooral vanwege de slechte afbuigingseigenschap van de kristall

a-guide-to-production-crystallization-structure-determination-human

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Structure-based drug design speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van geneesmiddelen. Nastreven van meerdere doelen tegelijkertijd verhoogt de kans op succes voor lood ontdekking. Het volgende artikel belicht hoe de Seattle Structural Genomics Centrum Infectieziektebestrijding maakt gebruik van een multi-target benadering voor gen-tot-structuur bepaling van de PB2 influenza A subunit.

Multi-target Parallel Processing Aanpak voor Gene-to-structuur bepalen van de Influenza Polymerase PB2 Subunit

Kristalstructuur van eiwit-DNA-complexen kan inzicht verschaffen in eiwitfunctie, mechanisme, evenals de aard van de specifieke interactie. Hier rapporteren we hoe de lengte en sequentie uiteinden van duplex DNA optimaliseren voor co-kristallisatie...

Iteratieve optimalisatie van DNA-duplexen voor kristallisatie van SeqA-DNA complexen

β-vat buitenmembraaneiwitten (OMP's) hebben veel functies binnen de buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën, mitochondriën en chloroplasten. Hier hopen we een bekende knelpunt in structurele studies te verlichten door protocollen te presenteren voor de productie van β-vat OMP's in voldoende hoeveelheden voor structuurbepaling door röntgenkristallografie of NMR-spectroscopie.

Van Constructen naar Crystals - Naar Structuur Bepaling van β-barrel Outer Membrane Proteins

We beschrijven een kader dat eenvoudige biochemische en computationele analyses combineert om de karakterisering en kristallisatie van grote coiled-coil-domeinen te begeleiden. Dit kader kan worden aangepast voor globulaire eiwitten of worden uitgebreid om een verscheidenheid aan hoogdoorvoertechnieken te integreren.

De combinatie van natte en droge Lab Technieken om de kristallisatie van grote opgerolde-coil bevattende eiwitten Gids

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is een uitgescheiden metalloprotease en veelbelovend geneesmiddel-doelwit van de humane ziekteverwekker Clostridium difficile. Hier beschrijven we alle methoden die nodig zijn voor de productie en structuurbepaling van dit eiwit.

Productie, kristallisatie en structuur bepalen van<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via Microseeding en zink-SAD

Een protocol wordt gepresenteerd voor röntgenkristallografie onder toepassing van eiwitmicrokristallen. Twee voorbeelden die in vivo- gegroeide microkristallen analyseren na zuivering of in cellulose worden vergeleken.

Microkristallografie van eiwitkristallen en<em&gt; In Cellulo</em&gt; Diffractie

Benaderingen voor de biofysische en structurele karakterisatie van glycoproteïnen presenteren wij met de immunoglobuline vouw door biolayer interferometrie, isothermische titratie calorimetrie en röntgendiffractie.

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

We beschrijven protocollen voor de structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO door Röntgen kristallografie. De methoden omvatten eiwit expressie, zuivering en karakterisering, evenals strategieën voor succesvolle kristal optimalisatie en structuurbepaling van het eiwit in zijn ongebonden vorm.

Productie, kristallisatie en structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO

Het protocol beschrijft experimentele methoden om stabiele grote histocompatibiliteitscomplexen (MHC) klasse I te verkrijgen door middel van mogelijke β2-microglobuline (β2m) vervangingen van verschillende soorten. De structurele vergelijking van MHC I gestabiliseerd door homologe en heterologe β2m werd onderzocht.

Stabiliteit en structuur van Vleermuis Major Histocompatibiliteit Complexe Klasse I met Heterologe β2-Microglobuline

Dit artikel presenteert een methode om eiwitkristallen te genereren die zijn afgeleid met I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisoftaalzuur) met behulp van microseeding om nieuwe kristallisatieomstandigheden in schaarse matrixschermen te genereren. De trays kunnen worden opgezet met behulp van vloeibare doseerrobots of met de hand.

De afleiding van eiwitkristallen met I3C met behulp van Random Microseed Matrix Screening

Deze bijdrage beschrijft hoe eiwitkristallisatie op kristal-op-kristalapparaten kan worden ingesteld en hoe geautomatiseerde seriële gegevensverzameling bij kamertemperatuur kan worden uitgevoerd met behulp van het on-chip kristallisatieplatform.

On-chip kristallisatie en grootschalige seriële diffractie bij kamertemperatuur

Leer de productie, kristallisatie en structuurbepaling van menselijk IKK1/α voor signaaltransductieonderzoek. Deze methode helpt onderzoekers bij rationeel medicijnontwerp.

Een gids voor productie, kristallisatie en structuurbepaling van menselijke IKK1/α

Meer video's verkennen