Een gids voor productie, kristallisatie en structuurbepaling van menselijke IKK1/α

Het doel van deze procedure is om richtlijnen te bieden voor de productie, kristallisatie en structurele bepaling van de menselijke IKK1-alpha om de mechanistische basis van zijn signaleringsfunctie te begrijpen en platforms voor rationeel medicijnontwerp te creëren. Deze methode moet onderzoekers helpen bij het bepalen van de structuur van IKK1, die antwoorden zou geven op belangrijke vragen op het gebied van immuunsignalering. Deze techniek beschrijft een gestroomlijnd pad naar het verkrijgen van kristallen van IKK-eiwitten, die nogal refractisch zijn voor kristallisatie en om verschillende kritische informatie te verstrekken bij het overwinnen van knelpunten bij het bepalen van de structuren.

Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn bij deze methode het moeilijk hebben, omdat het genereren van milligramhoeveelheden oplosbaar, goed gedragen eiwit vereist, de expressie ervan in insectencellen vereist en kristallisatie kan worden gedaan onder slechts een zeer smal venster van omstandigheden. De moleculaire vervangingsprocedure die wordt gebruikt bij het bepalen van de structuur van IKK1 kan ook erg lastig zijn, vooral vanwege de slechte afbuigingseigenschap van de kristallen, niet op de plaats van de asymmetrische eenheid die veel IKK1-moleculen bevat bij afwezigheid van geschikte zoekmodellen. Het aantonen van de procedures zijn Kyle Shumate en Sonjiala Hotchkiss, studenten van mijn laboratorium.

Op dag één, plaat Sf9 cellen in twee milliliter Sf903 insectencel medium, in elke put van een zes-put plaat en incubate op 27 graden Celsius. Doorsnee de cellen wanneer ze een dichtheid van twee tot drie keer 10 bereiken tot de zes cellen per milliliter in suspensie door het te verdunnen naar verse media, bij een dichtheid van ongeveer zes keer 10 tot vijf. Op dag twee verdun acht microliter Sf9-transfectiereagensagemiddel in 100 microliter van SF-903 of Grace's Insect Medium.

Dan vortex het mengsel kort. Verdun in een aparte buis een microgram kitzuiverde recombinant bacmid in 100 microliter van hetzelfde medium. Combineer het verdunde DNA en transfectie reagens.

Na het uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende 15 tot 30 minuten, verwijder het medium uit de put. Voeg vervolgens een milliliter vers medium toe. Voeg vervolgens het verdunde DNA-transfectiereagensmengsel dropwise toe aan de cellen, waarbij de valgrootte zodanig wordt aangepast dat het niet ontwapenen aanhangende cellen.

Voeg na zes uur 1,5 milliliter vers medium toe bovenop de cellen. Incubeer de cellen bij 27 graden Celsius, het controleren van de putten periodiek om de 12 uur op tekenen van virale infectie. Op dag vijf, verwijder het medium met cellen, 60 tot 72 uur na infectie.

Na het overbrengen van het medium in buizen, centrifuge gedurende vijf minuten op 500 keer g en vier graden Celsius. Wanneer u klaar bent, sla de supernatant, dat is de P1 virus stack. Op dag één, resuspend de eerder voorbereide His-IKK1 celpellet in 40 milliliter lysebuffer.

Plaats de celsuspensie op ijs en lyse de cellen door sonicatie op 60%tot 70% duty cycli en vijf tot 10 pulsen van 30-seconden duur met een interval van meer dan een minuut. Verhelder het lysaat door centrifugatie bij meer dan of gelijk aan 28.000 g gedurende 45 minuten bij vier graden Celsius. Na het voorbereiden van een Nickel-NTA Agarose hars, volgens het tekstprotocol, elute de His-tagged IKK1 alpha eiwit onder zwaartekracht stroom met behulp van 20 milliliter elution buffer.

Verzamel een tot 1,5 milliliter fracties. Na het combineren van de fracties die het eiwit bevatten, verteer het monster 's nachts met TEV protease bij vier graden Celsius. In de ochtend van dag twee ontcunb tuurt het eiwit met één millimolar ATP, in aanwezigheid van magnesiumchloride, bèta-glycerofosfat, natriumfluoride en natriumortovanat gedurende een uur bij 27 graden Celsius.

Na incubatie filtert u de eiwitoplossing door een filter van 0,45 micron. Laad vervolgens ongeveer zes milliliter van het monster op een 120 milliliter preparative size-exclusion kolom, bevestigd aan een geautomatiseerd vloeibaar chromatografiesysteem. Na evenwicht voert u de chromatografie van grootte-uitsluiting uit met een stroomsnelheid van één milliliter per minuut en verzamel ze twee milliliterfracties.

Tijdens de run, monitor elution op 280 en 254 nanometer. Na het trekken van de zuivere fracties, concentreren in een 30-kilodalton, moleculair gewicht cut-off centrifugale concentrator, volgens de instructies van de fabrikant. Dan afzien van 25-microliter aliquots van het geconcentreerde eiwit en flash-freeze in vloeibare stikstof.

Met behulp van een robot, pipet 80 tot 100 microliter van een kristallisatie reagens in het reservoir van een 96-put plaat. Met behulp van een kristallisatierobot, afzien en meng 0,2 tot 0,25 microliter van IKK1 en zijn remmer complex met hetzelfde volume van reservoir oplossing. Sluit onmiddellijk na het instellen van de druppels elke plaat af met optisch heldere folies om verdamping te voorkomen.

Broed de ene plaat op 18 graden Celsius en de andere plaat op vier graden Celsius in een koude kamer. Gebruik een stereo microscoop met een polarisator om te controleren op het uiterlijk van kristal in elke druppel, elke dag, voor de eerste zeven dagen en vervolgens met langere intervallen. Na de voorbereiding van IKK1 en het remmercomplex zoals eerder beschreven, breng je de putoplossingen over op elke put van een 24-putplaat.

Plaats een tot 1,5 microliter goed oplossing op een schone glazen coverslip. Voeg een gelijk volume van IKK1 en de remmer complex aan de glazen coverslip en meng zachtjes door pipet op en neer drie tot vier keer. Na het aanbrengen van vet op de ringen van elke put van de plaat, draai de glazen coverslip over en plaats op de respectieve goed met tangen.

Sluit vervolgens de put af door op de glazen coverslip te drukken. Na het opzetten van alle druppels in de 24-put plaat, uitbroeden in de koude kamer, in het donker. Controleer af en toe de druppels onder een microscoop op het uiterlijk en de groei van kristallen.

Zodra de kristalgroei is voltooid, verwijder voorzichtig de glazen coverslip met het kristal en plaats het op een vast oppervlak met de kristaldruppel naar boven gericht. Voeg voorzichtig 10 microliter cryo een oplossing op de top van de druppel en meng voorzichtig door pipetting, zodat het kristal niet wordt aangeraakt. Met behulp van een microscoop, langzaam verwijderen van wat vloeistof uit het kristal en houd ongeveer vijf tot acht microliter van de oplossing.

Voeg voorzichtig 2,5 tot vier microliters cryo B-oplossing toe aan de druppel en meng voorzichtig door pipetten. Bedek de glazen coverslip met een kleine Petrie schotel om directe luchtstroom over het kristal te voorkomen. Na vijf minuten wachten, zorgvuldig kies een enkel kristal uit de druppel in een passende cryoloop gemonteerd op een goede basis.

Flash-vries het kristal in vloeibare stikstof. Bewaar vervolgens het kristal met cryoloop in een puck ondergedompeld in vloeibare stikstof in een Dewar-kolf tot ze klaar zijn voor röntgendiffractie bij het synchrotron. Na uitgebreide studies met verschillende IKK1-varianten werden kristallen verkregen met één afgekapte constructie, die alleen geschikte röntgeneigenschappen vertoonde in aanwezigheid van de IKK-remmer XII.

Het gecombineerde effect van röntgengegevens met een lage resolutie met zwakke intensiteiten, een groot aantal IKK1-moleculen in de asymmetrische eenheid en conformatievariatie van het IKK1 monomeric-dimeric-model, in vergelijking met bekende IKK2-modellen, maakten het moeilijk om een moleculaire vervangingsoplossing, IKK1, te verkrijgen en de structuur ervan te bepalen. Verschillende IKK2-structuren wezen op verschillende intermonomeeroriëntatie binnen de dimers, zodat de afstand tussen de alfacarbons van P578 in de twee kinase-domeinen, in vier verschillende dimermodellen, varieerde tussen 39 en 61 angstroms. Het verkrijgen van een nuttig zoekmodel was mogelijk vanwege de lage resolutie cryoelectron microscopie kaart en een hoge nauwkeurigheid model van IKK1 domeinen die kunnen worden gegenereerd op basis van een hoge resolutie IKK2 structuur.

Het oorspronkelijke model gaf een oriëntatie van kinase domein gedraaid 24 graden ten opzichte van die van een IKK2 monomeer en een N-terminal opening van 58 angstroms. Met behulp van een van de dimers met de 52-angstrom opening als een model, zes dimers in de asymmetrische eenheid werden gevestigd. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden uitgevoerd in een paar maanden, als het goed wordt uitgevoerd.

Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat het verkrijgen van een oplosbaar, actief en goed gedragen eiwit is de eerste kritieke stap. Na het bekijken van deze video, moet u een goed algemeen begrip van alle stappen die moeten worden gevolgd in nauwgezette details, om succesvol te zijn in het kristalliseren en het bepalen van de structuur van IKK1 eiwit. Het leren van deze procedure, er is nog steeds structuren van andere IKK familie eiwitten die ook kunnen worden bepaald om aanvullende vragen over kinase-mitogen signalering te beantwoorden.