Name: Generatie van het Model van een chronische obstructieve longziekte in muizen door herhaalde ozon blootstelling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Leer hoe je een COPD-model genereert bij muizen door herhaalde ozonblootstelling. Deze methode bootst de pathologische processen van patiënten na en biedt een platform voor mechanistisch onderzoek en het testen van nieuwe geneesmiddelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs wil dankbaarheid uitspreken aan de heer Boyin Qin (Shanghai publiek Clinical gezondheidscentrum) voor de technische hulp bij de evaluatie van de µCT in dit protocol.

Opmerking: de OE-model heeft zijn gegenereerd en gebruikt in reeds gerapporteerde onderzoek 30 , 31 , 32. Alle dierproeven werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Shanghai Jiaotong University.
 1. muizen <ol><li>huis pathogenen vrije, 7 - tot 9-week-oude vrouwelijke BALB/c muizen in individuele geventileerde kooien in een dier faciliteit onder gecontroleerde temperatuur (20 ° C) en luchtvochtigheid (40-60%). Bieden een 12 uur licht en 12 uur donker cyclus in de faciliteit. Voedsel en water ad libitum.</li>
</ol> 2. Ozon of Air blootstelling <ol><li>genereren ozon met een elektrische generator in een doos (bijvoorbeeld Perspex) acryl afdichting. Het blazen van de lucht uit de doos met behulp van een kleine lucht blower door een air vent buis die gekoppeld is aan de binnenkant als buitenkant van de doos. De concentratie van ozon in de doos met behulp van een sonde van ozon te volgen. Wacht tot de concentratie van ozon in het vak 2,5 delen per bereikt miljoen (ppm). 
	Opmerking: De sonde ozon kan automatisch schakelen tussen de ozon-generator in- of uitschakelen en kunt het beschermingsniveau ozon in het vak 2,5 ppm.</li>
	<li>Plaatst de muizen in het vak wanneer de hoeveelheid ozon 2,5 ppm bereikt. Laat de muizen in het vak voor 3U telkens om hen bloot te stellen aan ozon. 
	Opmerking: Het vak kan handhaven een ozon 2,5 ppm gedurende de 3 uur door de ozon generator automatisch over te schakelen in- of uitschakelen en waait de CO 2 die wordt geproduceerd door de muizen uit de doos.</li>
	<li>Geven twee ozon posities (elke blootstelling gedurende 3U) per week (een keer om de 3 dagen) voor 7 weken; de controle muizen in de lucht tegelijkertijd en voor dezelfde periode bloot.</li>
</ol> 3. Micro-berekend tomografie <ol><li>anesthetize aan het einde van week 7, de muizen met een intraperitoneale injectie pelltobarbitalum chloorverbinding (1%, 0,6 - 0,8 ml/100 g) aanpassen van de dosis volgens individuele situaties om te zien dat de muis niet reageren op een teen snuifje. Monitor en houd de muis op een regelmatige ademhaling frequentie; en zorg ervoor dat geen vrijwillige bewegingen bestaan gedurende de procedures.</li>
	<li>Plaats van de narcose muizen in de kamer van een micro-berekend tomografie (µCT).</li>
	<li>Kalibreren de µCT met behulp van het standaard protocol en de fabrikant &#39; s instructies. De röntgenbuis vastgesteldop 50 kV en de stroom bij 450 µA. 
	Opmerking: Zowel de röntgenfoto en de detector draaien rond de muizen.</li>
	<li>De µCT analyses uit te voeren door de overname van 515 prognoses met een effectieve pixelgrootte van 0.092 mm, een belichtingstijd van 300 ms voor één segment, en de dikte van een segment van 0.093 mm.</li>
	<li>Reconstrueren de longen met de verworven beelden met behulp van een software. De grijswaarden beeld helderheid aanpassen door de vaststelling van het minimum en het maximum van de grijswaarde op Hounsfield-eenheden,-750 en-550, respectievelijk. 
	Opmerking: De software wordt automatisch berekend met de volumes van de Long parenchym en de lage-demping gebied (LAA) 34 , 35.</li>
	<li>Bereken het percentage van LAA (LAA %) door het verdelen van het LAA-volume door het volume van de totale longkanker.</li></ol>
 4. Loopband Test <ol><li>geven de muizen een aanpassing bij een snelheid van 10 m/min gedurende 10 minuten op een lopende loopband machine. Opmerking testen: de elektriciteit is altijd af wanneer de procedure wordt gevoerd.</li> <li>beheren een vermoeidheid test met de muizen.
	<ol><li>De muizen met een snelheid van 10 m/min gedurende 5 minuten opwarmen</li>
		<li>De snelheid verhogen tot 15 m/min gedurende 10 minuten</li>
		<li>Verhogen de trainingsintensiteit: verhoging van de snelheid door 5 m/min, vanaf 20 m/min, elke 30 min tot muizen kan niet worden uitgevoerd 36.</li>
	</ol></li> <li>De totale uitgevoerd afstand en tijd als vermoeidheid afstand en tijd van de vermoeidheid, respectievelijk opnemen.</li></ol>
 5. pulmonaire functie metingen <ol><li>Anesthetize de muizen met een intraperitoneale injectie pelltobarbitalum chloorverbinding (1%, 0,6 - 0,8 ml/100 g) aanpassen van de dosis volgens individuele situaties om te zien dat de muis doet niet reageren op een snuifje teen en wachten tot de muizen hebben volgehouden spontane ademhaling. Monitor en houd de muis op een regelmatige ademhaling frequentie; en zorg ervoor dat geen vrijwillige bewegingen bestaan gedurende de procedures.</li>
	<li>Zorgvuldig de muizen tracheostomize en plaats ze in de plethysmograph van een lichaam dat is aangesloten op een computer gestuurde ventilator. 
	Opmerking: Ventilatie wordt beheerd via een ventiel proximally gelegen aan de Endotracheale tube. De instelling biedt verschillende semi-automatische manoeuvres, met inbegrip van de manoeuvre van de quasi-statische druk-volume en de manoeuvre van de snelle stroom volume.</li>
	<li>Leggen gemiddeld ademhaling frequentie van 150 adem/min aan de narcose muis via druk-gecontroleerde ventilatie tot een regelmatige ademhaling patroon en volledige vervaldatum bij elke ademhaling cyclus wordt verkregen.</li>
	<li>De quasi-statische druk-volume-manoeuvre uitvoeren met het apparaat met behulp van de negatieve druk gegenereerd in de plethysmograph.</li>
	<li>Voeren de snelle stroom volume manoeuvreren binnen de quasi-statische druk-volume-lussen om de FVC- en de FEV te registreren. Opblazen van de longen naar + 30 cm H 2 O en onmiddellijk daarna verbinding maken het tot een zeer negatieve druk om af te dwingen verlopen totdat het restvolume op-30 cm H 2 O. Record de FEV in de eerste 25, 50 en 75 ms van uitademing (FEV 25 is FEV 50 en FEV 75, respectievelijk). Verwerpen de suboptimaal manoeuvres. Voor elke test met elke één muis, voeren een minimum van drie aanvaardbaar manoeuvres te verkrijgen van een betrouwbare gemiddelde voor alle numerieke parameters.</li>
</ol> 6. BALF collectie <ol><li>na terminal anesthesie met pelltobarbitalum chloorverbinding ((1%, 1.8-2.4 ml/100 g) aanpassen van de dosis volgens individuele situaties om te zien dat de muis niet op een snuifje teen reageren en verliezen van de adem), lavage de muizen met 2 mL PBS via een 1 diameter mm endotracheale buis en vervolgens ophalen de BALF 10.</li>
	<li>Zwembad de opgehaalde lavage aliquots samen en centrifugeer ze bij 4 ° C en 250 x g gedurende 10 minuten</li>
	<li>Verzamelen het supernatant voor onmiddellijk gebruik en opslaan van de rest op-80 ° C of vloeibare stikstof.</li>
	<li>Telling van het totale aantal cellen met behulp van een hemocytometer.</li>
	<li>Resuspendeer de cel pellet in PBS en vervolgens draai (1.400 x g, 6 min) 250 µL van de geresuspendeerde cellen op dia's met behulp van een centrifuge dia. kringveld.</li>
	<li>Toepassing Wright kleuring aan cellen op de dia's volgens de fabrikant &#39; s-protocol.</li>
	<li>200 cellen per muis tellen; de cellen worden geïdentificeerd als neutrofiele granulocyten, macrofagen volgens standaard morfologie, onder 400 X vergroting; en hun getallen tellen.</li>
</ol> 7. Cardiale bloedmonsters <ol><li>verzamelen van bloed via cardiale punctie, laden in 1.5-mL buizen, en houd het op ijs voor 30 min.</li>
	<li>Centrifugeren van de bloedmonsters voor 5 min op 2.000 x g- en 4 ° C.</li>
	<li>Het supernatant (serum) overbrengen naar een nieuwe buis en sla deze op-80 ° C of vloeibare stikstof.</li>
	<li>Het serum voorbereiden IL-1β, IL-10 en TNF-α detectietests met behulp van de respectieve ELISA kits.</li>
</ol> 8. Long Morfometrische analyse <ol><li>ontleden de longen en de tracheas van de muizen.
	<ol><li>Plaats elke euthanized muis op een chirurgische bord onmiddellijk achter offer.</li>
		<li>Ontleden weg de platysma en anterior tracheale spieren om te visualiseren en toegang tot de tracheale ringen.</li>
		<li>Open van de thoracale holte. Ontleden van de longen en de luchtpijp, maar niet het hart van de longen doen scheiden.</li>
	</ol>
	</li> <li>De Endotracheale katheter verbinden met een injectiespuit met 4% paraformaldehyde door een PE90 polyethyleen buis. 
	Let op: Paraformaldehyde is giftig. Draag handschoenen en veiligheidsbril en gebruik van de oplossing in een zuurkast.</li>
	<li>Blazen de longen volledig met behulp van 4% paraformaldehyde (10 druppels, ~ 200 µL) via de Endotracheale katheter. Verwijderen van het hart na de voltooiing van de inflatie.</li>
	<li>Behouden de Long in een tube van 15 mL met 10 mL 4% paraformaldehyde voor ten minste 4 h.</li>
	De Long inbedden <li>in paraffine. 5-µm secties verkrijgen door paraffine blok met rotary microtome segmenteren. Tijdens de afdelen, bloot de maximale oppervlakte van longweefsel binnen het gebied van de bronchiale boom.</li>
	<li>Voor Morfometrische analyse, verrichten haematoxyline en eosine (H &#38; E) kleuring op de baanvakken.</li>
	<li>Beeld van de secties met een helder-veld rechtop Microscoop (objectief, 20 X; belichtingstijd, 1.667 ms).</li>
	<li>Hebben twee onderzoekers verblind bij het protocol van behandeling onafhankelijk tellen de histologische secties. Gebruik de gemiddelde lineaire snijpunt (L m) als parameter voor het meten van de afstand van de Inter alveolaire septal wall. Bepalen van de L-m met behulp van de volgende stappen uit: <ol><li>de beelden van de secties in Photoshop opent en tekent u een tasje-raster in de afbeelding met de lange lijnen vijf 550 µm.</li>
		<li>Het aantal longblaasjes over de rasterlijn.</li>
		De L-m berekenen <li>door de lengte van de rasterlijn te delen door het aantal longblaasjes. Afbeelding voor kwantificering, vijf secties per muis. Verwerven van tien beelden van elke sectie (één afbeelding per veld) en willekeurig te beoordelen. Tijdens veldselectie, velden van airways en vaartuigen te voorkomen door het bewegen van één veld vooruit of in een andere richting. 
		Opmerking: De gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± S.E.M. Een VN-gepaarde t-test werd uitgevoerd ter vergelijking tussen lucht-blootgesteld muizen en muizen ozon-blootgesteld. Drie dieren van elke groep werden gebruikt voor het berekenen van de significant verschil. Een p-waarde van &#60; 0.05 werd beschouwd als belangrijke.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Z.W.S. en W.W. zijn huidige medewerkers en aandeel optiehouders van de cellulaire biologie-groep (NASDAQ: CBMG). De andere auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.

In deze studie presenteren we een betrouwbare methode voor het genereren van een nieuw model van COPD. In vergelijking met andere modellen (dat wil zeggen, LP's of modellen beschermingsmiddelen), recapituleert dit model OE de pathologische proces van COPD patiënten. Omdat sigarettenrook het belangrijkste gevaarlijke materiaal dat ervoor zorgt dat COPD in menselijke patiënten40 is, blijft het CS-model de meest populaire COPD model41,42</...

Er wordt geschat dat COPD, emfyseem en chronische bronchitis, misschien wel de derde belangrijkste doodsoorzaak in de wereld in 20201,2. De potentiële incidentie van COPD in een populatie ouder dan 40 jaar wordt geschat op 12,7% bij mannen en 8,3% bij vrouwtjes binnen de komende 40 jaar3. Geen medicijnen zijn momenteel beschikbaar voor het omkeren van de progressieve verslechtering van COPD patiënten4. Betrouwbare diermodellen van COPD niet alleen eisen de nabootsing van de ziekte pathologisch proces maar ook vereisen een korte generatie periode. Huidige COPD-modellen, met inbegrip van de LP's of een PPE-geïnduceerde model, kunnen veroorzaken emfyseem-achtige symptomen5,6. Eenmalige toediening of een week-lange uitdaging van LPS of PPE muizen of ratten resulteert in duidelijke neutrophilia in de bronchoalveolar lavage vloeistof (BALF), verhogingen pro-inflammatoire mediatoren (b.v., TNF-α en IL-1β) in de BALF of serum, produceert Long parenchymal vernietiging, uitgebreide luchtruimten, en grenzen luchtstroom5,6,7,8,9,10. Echter LPS of PPE zijn geen oorzaken van menselijke COPD en dus doen niet na te bootsen de pathologische proces11. Een CS-geïnduceerde model geproduceerd een persistente luchtstroom beperking, Long parenchymal vernietiging en verminderde functionele oefening capaciteit. Een traditionele CS-protocol vereist echter ten minste 3 maanden voor het genereren van een COPD model12,13,14,15. Het is dus belangrijk voor het genereren van een nieuwe, efficiëntere diermodel die voldoet aan de twee eisen.
Onlangs, naast het roken van sigaretten, luchtverontreiniging en beroepsmatige blootstelling meer voorkomende oorzaken van COPD16,17,18zijn geworden. Ozon, als een van de belangrijkste verontreinigende stoffen (hoewel niet de belangrijkste component van luchtverontreiniging) kan direct reageren met de luchtwegen en beschadiging van het longweefsel voor zowel kinderen en jonge volwassenen19,20,21 ,22,23,24,25. Ozon, evenals andere stimulatoren waaronder LPS, PPE en CS, zijn betrokken in een ernstig van biochemische pathways van pulmonaire oxidatieve stress en DNA-beschadiging en zijn gekoppeld aan de inleiding en de bevordering van COPD26,27. Een andere factor is dat de symptomen van sommige COPD-patiënten verslechteren na wordt blootgesteld aan ozon, die aangeeft dat ozon Long functie18,28,29kan verstoren. Dus, we een nieuw model van de COPD gegenereerd door herhaaldelijk bloot muizen aan hoge concentraties van ozon voor 7 weken; Dit resulteerde in de luchtstroom gebreken en longschade parenchymal lijken op die van eerdere onderzoeken30,31,32. Wij uitgebreid het OE-protocol tot vrouwelijke muizen in deze studie en gereproduceerd met succes de emfyseem waargenomen bij mannelijke muizen in onze eerdere studies30,31,-32. Omdat COPD sterfte gedaald bij mannen maar verhoogd bij vrouwen in vele landen33, een COPD-model bij vrouwtjes is nodig om te studeren van de mechanismen en methoden te ontwikkelen therapeutische voor vrouwelijke COPD patiënten. De toepasbaarheid van het model van de OE voor alle geslachten leent verdere steun aan het gebruik ervan als een COPD-model.

<table><tbody><tr><td>BALB/c muizen</td><td>Slac Laboratory Animal, Shanghai, China</td><td>N/A</td><td>In dit onderzoek werden 7-tot-9-week-oude vrouwelijke BALB/c muizen gebruikt.</td></tr><tr><td>Afzonderlijke ventilatiekooien</td><td>Suhang, Shanghai, China</td><td>Modelnummer: MU64S7</td><td>De kooien werden gebruikt voor het huisvesten van muizen in het dierenlaboratorium.</td></tr><tr><td>Sealing perspex-box</td><td>Suhang, Shanghai, China</td><td>N/A</td><td>De doos werd gebruikt om de ozongenerator te bevatten. Muizen werden blootgesteld aan ozon binnen de doos.</td></tr><tr><td>Elektrische generator</td><td>Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Duitsland</td><td>Model 500</td><td>Het apparaat werd gebruikt voor het genereren van ozon.</td></tr><tr><td>Ozonsonde</td><td>ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK</td><td>Ozone 300</td><td>Het apparaat werd gebruikt voor het bewaken en regelen van de ozongeneratie.</td></tr><tr><td>Pelltobarbitalum natricum</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P3761</td><td>Muizen werden verdoofd door intraperitoneale injectie van pelltobarbitalum natricum.</td></tr><tr><td>Micro-Computed Tomography</td><td>GE Healthcare, London, ON, Canada</td><td>RS0800639-0075</td><td>Dit apparaat werd gebruikt voor het verkrijgen van beelden van de long.</td></tr><tr><td>Micro-view 2.01 ABA-software</td><td>GE Healthcare, London, ON, Canada</td><td>Micro-view 2.01</td><td>Dit apparaat werd gebruikt voor het reconstrueren van de long en het analyseren van volume, LAA van de long.</td></tr><tr><td>Loopbandmachine</td><td>Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China</td><td>DSPT-208</td><td>Deze machine werd gebruikt voor vermoeidheidstest.</td></tr><tr><td>Lichaamsplethysmograph</td><td>eSpira® Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK</td><td>Forced Manoeuvres System</td><td>Dit apparaat werd gebruikt om de longfunctie via spirometrie te testen.</td></tr><tr><td>Ventilator</td><td>eSpira® Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK</td><td>Forced Manoeuvres System</td><td>Dit apparaat werd gebruikt om de longfunctie via spirometrie te testen.</td></tr><tr><td>Slide spinner centrifuge</td><td>Denville Scientific, Holliston, MA, USA</td><td>C1183</td><td>Het werd gebruikt om BALF-cellen op dia's te draaien.</td></tr><tr><td>Wright-kleuring</td><td>Hanhong, Shanghai, China</td><td>RE04000054</td><td>Het werd gebruikt om macrofagen, neutrofielen in de gesuspendeerde BALF te kleuren.</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific, Horsham, PA, USA</td><td>4000</td><td>Het werd gebruikt om cellen te tellen.</td></tr><tr><td>IL-1β</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab100704</td><td>Ze werden gebruikt om de respectieve factoren in serum te testen.</td></tr><tr><td>IL-10</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab46103</td><td>Ze werden gebruikt om de respectieve factoren in serum te testen.</td></tr><tr><td>TNF-α</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab100747</td><td>Ze werden gebruikt om de respectieve factoren in serum te testen.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P6148</td><td>De long werd opgeblazen met 4% paraformaldehyde.</td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Hualing, Shanghai, China</td><td>56#</td><td>Het werd gebruikt om de long in te bedden.</td></tr><tr><td>Roterende microtoom</td><td>Leica, Wetzlar, Hesse, Duitsland</td><td>RM2255</td><td>Het werd gebruikt voor het snijden van de long.</td></tr><tr><td>Hematoxyline en Eosine (H&E) kleuringsoplossing</td><td>Solarbio, Beijing, China</td><td>G1120</td><td>H&E kleuring werd gedaan voor morfometrische analyse.</td></tr><tr><td>Staande helderveldmicroscoop</td><td>Olympus, Center Valley, PA, USA</td><td>CX41</td><td>Het werd gebruikt om de H&E gekleurde dia's te bekijken.</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 12</td><td>Adobe, San Jose, CA, USA</td><td>Adobe Photoshop 12</td><td>Het werd gebruikt om het aantal longblaasjes op de H&E gekleurde beelden te tellen.</td></tr><tr><td>GraphPad prism 5</td><td>Graphpad Software Inc., San Diego, CA</td><td>GraphPad prism 5</td><td>Het werd gebruikt voor data-analyse en het maken van figuren.</td></tr></tbody></table>

generatie van het model van een chronische obstructieve longziekte in muizen door herhaalde ozon blootstelling

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Chronische obstructieve longziekte (COPD) wordt gekenmerkt door aanhoudende luchtstroom beperking en Long parenchymal vernietigen. Het heeft een zeer hoge incidentie in populaties veroudering. De huidige conventionele therapieën voor COPD focus vooral op symptoom-aanpassen drugs; de ontwikkeling van nieuwe therapieën is dus dringend noodzakelijk. Gekwalificeerde diermodellen van COPD kunnen bijdragen aan het karakteriseren van de onderliggende mechanismen en kunnen worden gebruikt voor nieuwe drug screening. Huidige modellen van de COPD, zoals lipopolysaccharide (LPS) of de varkens Pancreas elastase (PPE)-geïnduceerde emfyseem model, genereren van COPD-achtige letsels in de longen en de luchtwegen, maar doen niet anders lijken op de pathogenese van menselijke COPD. Een sigarettenrook (CS)-geïnduceerde model blijft een van de populairste, omdat het niet alleen COPD-achtige letsels in de luchtwegen simuleert, maar het is ook gebaseerd op één van de belangrijkste gevaarlijke materialen die COPD veroorzaakt bij de mens. Echter beperken de tijdrovend en arbeidsintensief aspecten van het CS-geïnduceerde model drastisch de toepassing ervan in nieuwe drug screening. In deze studie werd gegenereerd we met succes een nieuw model van de COPD door muizen tot hoge niveaus van ozon bloot te leggen. Dit model het volgende aangetoond: 1) geforceerde expiratoire 25, 50 en 75/forced vital capaciteit van het volume daalde (FEV25/FVC, FEV50/FVC en FEV75/FVC), met vermelding van de achteruitgang van de longfunctie; 2) uitgebreide Long longblaasjes met Long parenchymal vernietiging; 3) verminderde vermoeidheid tijd en afstand; en 4) verhoogd van ontsteking. Samen genomen, blijkt deze gegevens dat de ozonlaag blootstelling (OE) model een betrouwbare dierlijk model dat is vergelijkbaar met mensen omdat ozon overbelichting is één van de etiologische factoren van COPD. Bovendien, duurde het slechts 6-8 weken, gebaseerd op onze eerdere werk, een OE om model te maken, terwijl het 3 tot 12 maanden voor het opwekken van het model van sigarettenrook, die aangeeft dat de OE-model zou kunnen een goede keuze voor COPD onderzoek zijn vereist.

Voorbeelden van 3D µCT beelden van elke groep worden weergegeven in Figuur 1een. De ozon-blootgesteld muizen had een aanzienlijk grotere totale Long volume (Figuur 1een en b) en LAA % (Figuur 1c) dan deed de muizen controle lucht-blootgesteld. Het volume van de longen en de LAA % bleef verhoogde na zes weken van ozon blootstelling31...

Deze studie beschrijft de succesvolle generatie voor een nieuwe diermodel van chronische obstructieve longziekte (COPD) door muizen aan hoge concentraties van ozon herhaaldelijk bloot te leggen.

Generatie van het Model van een chronische obstructieve longziekte in muizen door herhaalde ozon blootstelling

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

Het algemene doel van dit experiment is om chronische obstructieve longziekte of COPD te induceren via ozonexpositie, OE, bij muizen. Dit nieuwe OE-model kan worden toegepast bij de karakterisering van het onderliggende mechanisme van COPD en kan worden gebruikt voor de screening van nieuwe geneesmiddelen. De belangrijkste voordelen van dit OE-model zijn dat het de pathologische processen van COPD-patiënten nabootst.Het kan in slechts zes tot acht weken worden gegenereerd. De procedure wordt gedemonstreerd door Weijaian Sang, een research fellow in onze groep. Om ozon te genereren, gebruikt u een elektrische generator en een kleine luchtblazer om lucht door een afgesloten Perspex-box te blazen via een ventilatiebuis die aan de binnen- en buitenkant van de box is aangesloten, waarbij een ozonsonde wordt gebruikt om de ozonconcentratie in de box te bewaken.Wanneer de ozonconcentratie 2,5 parts per million bereikt, worden de muizen gedurende 3 uur in de box geplaatst. Aan het einde van week 7 worden de met ozon behandelde dieren via micro-computertomografie gebeeld volgens standaardprotocollen. Om de door ozon geïnduceerde veranderingen en functionele capaciteiten, zoals longvermoeidheid, te testen, worden de muizen eerst opgewarmd op een loopband met een snelheid van 10 meter per minuut.Verhoog na 5 minuten de snelheid naar 15 meter per minuut voor een periode van 10 minuten. Blijf de snelheid elke 30 minuten met vijf meter per minuut verhogen totdat de muizen niet langer kunnen rennen. De totale renafstand en rentijd voor elk dier worden respectievelijk genoteerd als vermoeidheidsafstand en vermoeidheidstijd.Om de longfunctie van de aan ozon blootgestelde dieren te meten, plaatst u een geanestheseerde muis in een lichaamsplethysmograaf die is verbonden met een computergestuurde ventilator. Gebruik drukgestuurde ventilatie om een gemiddelde ademhalingsfrequentie van 150 ademhalingen per minuut op te leggen aan het geanestheseerde dier, totdat een regelmatig ademhalingspatroon en een volledige uitademing bij elke ademhalingscyclus zijn bereikt. Registreer vervolgens het geforceerde expiratoire volume in de eerste 25, 50 en 75 milliseconden van de uitademing, waarbij suboptimale manoeuvres worden verworpen.Na het toedienen van terminale anesthesie wordt een endotracheale tube met een diameter van 1 mm gebruikt om de dieren twee keer te spoelen met 1 mL PBS per spoeling. Voeg de verkregen spoelsels van elk dier samen voor centrifugatie en verzamel de supernatanten in vloeibare stikstof. Resuspendeer de pellets in verse PPS voor het tellen en rust twee houders per muis uit met een microscoopglas, een filterkaart en een trechter.Voeg ongeveer 100 tot 125 µL van de resuspenderde cellen toe aan elke trechter. Plaats de houders in een cytocentrifuge en centrifugeer de cellen op de objectglazen. Breng vervolgens de juiste kleuringsoplossing aan op de cellen volgens de instructies van de fabrikant en tel 200 cellen per muis bij een 400-voudige vergroting.Voor cardiale bloedafname wordt ongeveer 500 microliters bloed verzameld bij de met ozon blootgestelde dieren via een hartpunctie. Voeg het bloed vervolgens toe aan 1,5 milliliter buisjes op ijs. Na 30 minuten op ijs worden de bloedmonsters gecentrifugeerd en worden de serum-supernatanten overgebracht naar nieuwe buisjes voor bewaring in vloeibare stikstof.De monsters kunnen later worden ontdooid voor de bepaling van de serumcytokine-expressieniveaus via ELISA volgens standaardprotocollen. Plaats voor de longmorfometrische analyse de eerste muis in rugligging na de hartpunctie. Open vervolgens de borstholte en dissekeer het platysma en de anterieure tracheaalspieren weg om toegang te krijgen tot de trachea-ringen.Oogst de longen en de trachea zonder het hart van de longen te scheiden. Gebruik vervolgens een PE90 polyethyleenbuis om een endotracheale katheter te verbinden met een spuit die 4% formaldehyde bevat en blaas de longen volledig op met ongeveer 200 microliters paraformaldehyde. Plaats de longen vervolgens in een 15 milliliter buis met 10 milliliter verse vier procent formaldehyde voor ten minste vier uur.Zoals beoordeeld via micro-computertomografie, vertonen ozon-blootgestelde muizen een significant groter totaal longvolume en een hoger percentage aan gebieden met een lage attenuatie dan de controle-dieren die aan omgevingslucht werden blootgesteld. Het emfyseem-fenotype wordt ook aangetoond door de vergrote longalveoli en toegenomen gemiddelde lineaire intercepten. Beoordeling van de longfunctie via plethysmograaf laat zien dat alle parameters die afnemen bij ozon-blootgestelde muizen consistent zijn met de typische functionele longdefecten die worden waargenomen bij patiënten met chronisch obstructieve longziekte.Bovendien vermindert blootstelling aan ozon de vermoeidheidstijd en de vermoeidheidsafstand in inspanningstolerantietests aanzienlijk. Ozonbehandelde dieren vertonen ook een significante toename van inflammatoire cellen, waaronder macrofagen en neutrofielen, evenals een significante afname van IL-10 en een toename van IL-1 beta en TNF alpha, wat aantoont dat het ozonblootstellingsmodel symptomen nabootst die lijken op chronische obstructieve longziekte bij mensen. Door deze procedure uit te voeren op andere muizenstammen, zoals C57 BR6-muizen, kan dit OE-model worden gegenereerd. Na de ontwikkeling van deze techniek wordt de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van longziekten om de onderliggende mechanismen van COPD te onderzoeken.Vergeet niet dat het werken met paraformaldehyde gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen, een veiligheidsbril en het gebruik van de oplossing in de zuurkast, altijd moeten worden genomen bij het werken met dit reagens.

generation-chronic-obstructive-pulmonary-disease-model-mice-repeated

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Het huidige protocol bevat een gedetailleerde stap-voor-stap beschrijving van de vereiste om metingen van de ademhalingswegen mechanica, alsmede de beoordeling van de luchtwegen voor geïnhaleerde methacholine in muizen met behulp van de geforceerde oscillatie techniek (flexiVent voeren procedures; SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canada).

Evaluatie van Respiratory System Mechanics in Muizen met behulp van de Gedwongen Oscillatie techniek

We beschrijven de agar-kralen methode om hardnekkige langdurige chronische Pseudomonas aeruginosa luchtweginfectie te vestigen in het muismodel.

Long Term Chronische<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Luchtweginfectie in Muizen

Het doel van dit protocol is om geautomatiseerde methoden te bieden om chronische longpathologieën te kwantificeren in een muismodel van COPD. Het protocol omvat het blootstellen van muizen aan sigarettenrook (CS), het meten van longfunctie, het opblazen van de longen en het gebruik van morfometrische methoden om emfyseem en kleine luchtwegremodellering bij muizen te meten.

Geautomatiseerde Meting van longemfyseem en Kleine luchtweg remodeling in sigarettenrook blootgesteld Muizen

Hier gepresenteerd is een nuttig protocol voor Long fixatie die een stabiele aandoening creëert voor histologische evaluatie van Long specimens uit een muismodel van emfyseem. Het belangrijkste voordeel van dit model is dat het veel longen met dezelfde constante druk kan oplossen zonder longcollaps of deflatie.

Long fixatie onder constante druk voor de evaluatie van emfyseem bij muizen

Hier beschrijven we een methode voor de beoordeling van de Long-expressie van miRNAs die zijn voorspeld te reguleren van inflammatoire genen met behulp van muizen blootgesteld aan ozon of gefilterde lucht in verschillende stadia van de oestrische cyclus.

Long microRNA profilering in de oestrische cyclus in ozon-blootgesteld muizen

Dit manuscript beschrijft een protocol om te bepalen of blootstelling aan ozon, een criterium luchtverontreinigende stof, in vivo alveolaire macrofaag-efferocytose belemmert. Dit protocol maakt gebruik van veelgebruikte reagentia en technieken en kan worden aangepast aan meerdere modellen van long letsel om de effecten op alveolaire macrofaag efferocytose te bepalen.

In vivo beoordeling van alveolaire macrofaag Efferocytose na blootstelling aan ozon

Gecombineerde ozon- en bacteriële endotoxine blootgestelde muizen vertonen wijdverspreide celdood, waaronder die van neutrofielen. We zagen cellulaire aanpassingen zoals verstoring van cytoskelet lamellipodie, verhoogde cellulaire expressie van complexe V ATP synthase subeenheid β en angiostatine in broncho-alveolaire lavage, onderdrukking van de immuunrespons van de longen en vertraagde neutrofiele rekrutering.

Visualiseren van long cellulaire aanpassingen tijdens gecombineerde ozon en LPS geïnduceerde murine acute longletsel

Er zijn verschillende diermodellen van longfibrose opgesteld met behulp van bleomycine om de pathogenese van longfibrose te verduidelijken en nieuwe medicijndoelen te vinden. De meeste longfibrosemodellen die gericht zijn op longweefsel hebben echter een ongelijke toediening van geneesmiddelen. Hier stellen we een model voor van uniforme longfibrose geïnduceerd door nasale bleomycine-verneveling.

Een muismodel van longfibrose geïnduceerd door nasale bleomycineverneveling

Dit protocol beschrijft een methode voor het opstellen van een muismodel van silicose door herhaalde blootstelling aan silicasuspensies via een neusinfuus. Dit model kan efficiënt, gemakkelijk en flexibel het pathologische proces van menselijke silicose nabootsen met een hoge herhaalbaarheid en economie.

Een silicosemuismodel dat tot stand komt door herhaalde inademing van kristallijn silicastof

Dit protocol schetst een methode voor het induceren van longfibrose bij muizen door herhaalde orofaryngeale toediening van bleomycine, wat pathologische kenmerken oplevert die sterk lijken op die van idiopathische longfibrose.

Verfijnd muizenmodel van idiopathische longfibrose

Hier presenteren we een protocol om pulmonale fibrose bij muizen te modelleren met gebruik van geaerosoliseerde bleomycine toegediend via de luchtpijp. Deze geoptimaliseerde methode maakt uniforme, kwantitatieve en precieze toediening mogelijk zonder chirurgische incisie, wat de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van door bleomycine geïnduceerde fibrose verbetert.

Een verfijnde aerosolgebaseerde intratracheale bleomycine toedieningsmethode voor reproduceerbare en minimaal invasieve muismodellen van pulmonale fibrose

Leer hoe je een COPD-model genereert bij muizen door herhaalde ozonblootstelling. Deze methode bootst de pathologische processen van patiënten na en biedt een platform voor mechanistisch onderzoek en het testen van nieuwe geneesmiddelen.

Generatie van het Model van een chronische obstructieve longziekte in muizen door herhaalde ozon blootstelling

Meer video's verkennen