Generatie van het Model van een chronische obstructieve longziekte in muizen door herhaalde ozon blootstelling

Het algemene doel van dit experiment is om chronische obstructieve longziekte of C-O-P-D te induceren via ozonblootstelling, O-E bij muizen. Dit nieuwe OE-model kan plaatsvinden bij de karakterisering van de onderliggende mechanismen van COPD en kan worden gebruikt voor het screenen van nieuwe medicijnen. De belangrijkste voordelen van dit OE-model zijn dat het de pathologische processen van COPD-patiënten nabootst.

Het kan in slechts zes tot acht weken worden gegenereerd. De procedure zal worden gedemonstreerd door Weijaian Sang, een onderzoeksmedewerker in onze groep. Om ozon te genereren, gebruik een elektrische generator en een kleine luchtblazer om de lucht uit een afgesloten Perspex-doos te blazen via een luchtafvoerpijp verbonden aan de binnen- en buitenkant van de doos met behulp van een ozon-sonde om de concentratie van ozon in de doos te bewaken.

Wanneer de ozonconcentratie 2,5 delen per miljoen bereikt, plaats de muizen gedurende 3 uur in de doos. Aan het einde van week 7, beeld de met ozon behandelde dieren af door micro-computed tomography volgens standaardprotocollen. Om de ozon-geïnduceerde veranderingen en functionele capaciteiten zoals longvermoeidheid te testen, verwarm de muizen eerst op een snelheid van 10 meter per minuut op een loopband.

Na 5 minuten, verhoog de snelheid tot 15 meter per minuut gedurende een periode van 10 minuten. Blijf de snelheid verhogen met vijf meter per minuut voor elke 30 minuten totdat de muizen niet meer kunnen rennen. Noteer de totale afstand en looptijd voor elk dier als vermoeidheidsafstand en vermoeidheidstijd, respectievelijk.

Om de longfunctie van de met ozon blootgestelde dieren te meten, plaats een verdoofde muis in een bodyplethysmograph verbonden met een computergestuurde ventilator. Gebruik drukgecontroleerde ventilatie om een gemiddelde ademhalingsfrequentie van 150 ademhalingen per minuut op te leggen aan het verdoofde dier totdat een regelmatig ademhalingspatroon en een volledige expiratoire fase in elke ademhalingscyclus is verkregen. Noteer vervolgens het forced expiratoir volume in de eerste 25, 50 en 75 milliseconden van de exhalatie, waarbij eventuele suboptimale manoeuvres worden afgewezen.

Na terminale anesthesie, gebruik een endobuccale buis met een diameter van één millimeter om de dieren twee keer te lavage met één milliliter PBS per lavage. Bundel de opgehaalde lavage-aliquots van elk dier voor centrifugatie en verzamel de supernatanten op vloeibare stikstof. Re-suspendeer de pellets in vers PPS voor tellen en bevestig twee houders per muis met een microscoopglaasje, filterkaart en trechter.

Voeg ongeveer 100 tot 125 microliter van de gesuspendeerde cellen toe aan elke trechter. Laad de houders op een cytocentrifuge en draai de cellen op de glijbanen. Breng vervolgens de juiste kleuringsoplossing aan op de cellen volgens de instructies van de fabrikant en tel 200 cellen per muis onder een 400-voudige vergroting.

Voor hartspier-bloedmonsterneming, verzamel ongeveer 500 microliter bloed van de met ozon blootgestelde dieren via hartpunctie. En voeg het bloed toe aan 1,5 milliliter buisjes op ijs. Na 30 minuten op ijs, centrifugeer de bloedmonsters en breng de serumsupernatant in nieuwe buisjes over voor opslag op vloeibare stikstof.

De monsters kunnen later worden ontdooid voor de beoordeling van serumcytokine-expressieniveaus door ELISA volgens standaardprotocollen. Voor longmorfometrische analyse, plaats de eerste muis in de rugligging na hartmonsterneming. Open vervolgens de borstholte en snij de platysma en de voorste luchtwegspieren weg om toegang te krijgen tot de tracheale ringen.

Verzamel de longen en de luchtpijp zonder het hart van de longen te scheiden. Gebruik vervolgens een PE90 polyethyleenbuis om een endobuccale katheter te verbinden met een spuit bevattende 4% formaldehyde en blaas de longen volledig op met ongeveer 200 microliter paraformaldehyde. Plaats vervolgens de longen in een 15 milliliter buisje bevattende 10 milliliter vers vier procent formaldehyde gedurende minimaal vier uur.

Zoals beoordeeld door microcomputed tomography, vertoont ozon blootgestelde muizen een significant groter totaal longvolume en percentage van laag attenuatiegebied dan controle dieren blootgesteld aan omgevingslucht. Het emfyseem fenotype wordt ook aangetoond door de vergrote longblaasjes en verhoogde gemiddelde lineaire intercepts. Longfunctiebeoordeling door plethysmograph toont aan dat alle parameters die afnemen bij met ozon blootgestelde muizen consistent zijn met de typische longfunctionele defecten waargenomen bij patiënten met chronische obstructieve longziekte.

Bovendien vermindert ozonblootstelling significant de vermoeidheidstijd en vermoeidheidsafstand in een oefentolerantietest. Behandelde dieren met ozon vertonen ook een significante toename in ontstekingscellen, waaronder macrofagen en neutrofielen, evenals een significante afname in IL-10 en een toename in IL-1 bèta en TNF alfa, wat aantoont dat het ozonblootstellingsmodel symptomen van chronische obstructieve longziekte bij de mens nabootst. Door deze procedure toe te passen op andere muisstammen zoals de C57 BR6 muizen, kan dit OE-model worden gegenereerd. Na de ontwikkeling van deze techniek, opent dit de weg voor onderzoekers op het gebied van longziekten om de onderliggende mechanismen van COPD te onderzoeken.

Vergeet niet dat het werken met paraformaldehyde gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen, veiligheidsbrillen en het gebruik van de oplossing in de afzuiging altijd moeten worden genomen bij het werken met dit reagens.