Name: In Vivo Detectie en analyse van Rb eiwit SUMOylation in menselijke cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Leer de detectie van Rb-eiwit SUMOylatie in menselijke cellen onder endogene en exogene omstandigheden. Deze methode met HEK293-cellen biedt inzicht in eiwitmodificatieprocessen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door subsidies van de wetenschap en de technologie Commissie van Shanghai (Grant nr. 14411961800) en de National Natural Science Foundation of China (Grant nr. 81300805).

1. detectie van endogene Rb SUMOylation in de vroege fase van de G1 <ol><li>cel cultuur en celcyclus synchronisatie.
	<ol><li>Handhaven HEK293 cellen in groeimedium met Dulbecco &#39; s gewijzigd Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 1% Pen-Strep en 10% foetale runderserum (FBS) bij 37 ° C en 5% CO 2 in een broedmachine.</li>
		<li>Synchroniseren de HEK293 cellen in de G0 fase.
		<ol><li>, Graaf de HEK293 cellen met behulp van een hemocytometer en zaad ~1.5 x 10 7 cellen in een 15 cm schotel met 25 ml groeimedium gedurende 24 uur vóór de behandeling. Na het bereiken van een samenloop van 70% - 80%, aspirate het medium en wassen de cellen tweemaal met 5 mL voorverwarmde-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
			<li>Voeg 25 mL DMEM met 1% penicilline-streptomycine en Incubeer de cellen bij 37 ° C 72 h. wassen de cellen uit de plaat met 3 mL ijskoud PBS. Breng de cellen in een nieuwe tube van 5 mL.</li>
			<li>Een klein deel van de cellen aan de celcyclus analyse onderworpen door stroom cytometry (stap 1.2); de resterende meerderheid van de cellen verzamelen door centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en vervolgens opslaan in een vriezer van ultra-lage temperatuur tot analyse van Rb SUMOylation.</li>
		</ol></li> <li>Te verkrijgen van de G1-fase cellen, aan het eind van het synchronisatieproces G0, verwijderen van de DMEM en voeg weer vers groeimedium, waardoor de cellen van de HEK293 opnieuw invoeren van de celcyclus. Vervolgens de cellen verzamelen in verschillende fasen van de G1 (vroege G1: 30 min; G1: 2 h) voor de celcyclus analyse en verdere SUMO assay.</li>
		<li>Synchroniseren de HEK293 cellen in de S-fase met behulp van de methode double-thymidine blok.
		De cellen van de <ol><li>groeien HEK293 cellen aan een confluentie van 50% en wassen met voorverwarmde PBS. Voeg vervolgens groeimedium aangevuld met 2.5 mM thymidine voor 18u (eerste blok).</li>
			<li>Verwijder het medium van thymidine-bevattende en daarna wassen de cellen tweemaal met voorverwarmde PBS. Toevoegen van verse groeimedium voor 14u vrij te geven van de cellen.</li>
			<li>Verwijderen van het medium met een pipet en toevoegen van groeimedium aangevuld met 2.5 mM thymidine voor een andere 18 h (tweede blok) vóór het uitvoeren van een analyse van de celcyclus en Rb SUMOylation.</li>
		</ol></li> <li>Voor de G2/M synchronisatie, plaat ~1.5 × 10 7 HEK293 cellen aan een 15 cm schotel met 25 mL groeimedium gedurende 24 uur. Voeg vervolgens nocodazole naar het medium totdat een eindconcentratie van 400 ng/mL wordt verkregen. Ten slotte, Incubeer de cellen gedurende 16 uur vóór het uitvoeren van de analyse van de celcyclus en Rb SUMOylation.</li>
	</ol></li> <li>Analyse van de celcyclus door stroom cytometry.
	<ol><li>Resuspendeer de gesynchroniseerde HEK293 in PBS en dan fix de celsuspensie met ijskoude 70% ethanol gedurende 2 uur bij 4 ° C. er rekening mee dat de celsuspensie ontkleuring toevoegen aan de ijskoude 100% ethanol te verkrijgen van een eindconcentratie van te minimaliseren cel clustering 70% ethanol terwijl zachtjes vortexing.</li>
		<li>De cellen gedurende 5 min. 500 x g centrifugeren dan zorgvuldig Verwijder het supernatant en wassen van de cellen tweemaal met PBS. Herhaal de stap van de centrifuge.</li>
		<li>Voeg toe 500 µL PBS met 50 µg Mo/mL nucleïnezuur vlek propidium jodide, 0,1% Triton X-100 en 1 µg/mL RNase A tot en met de cellen en meng goed. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij 37 ° C.</li>
		<li>Bewaren de monsters bij 4 ° C tot analyse door stroom cytometry.</li>
	</ol></li> <li>Immunoprecipitation van eiwit van endogene Rb.
	<ol><li>Voorbereiden de HEK293 cel lysates.
		<ol><li>Lyse de gesynchroniseerde HEK293 cellen door zachtjes schorsing opnieuw hen in 1 mL ijskoud radio-immunoprecipitation assay (RIPA) lysis-buffermengsel (tabel 1) met vers toegevoegd 20 mM N-Ethylmaleimide, een isopeptidase-remmer die kunnen blokkeren van SUMO proteasen en stabiliseren van SUMO geconjugeerde.</li>
			<li>Verder Meng de cellen op het ijs door Dounce homogenisering, ultrasoonapparaat of gewoon passeren 10 keer via een 21 G naald aangesloten op een 2 mL spuit. Vervolgens, Incubeer de cellen op het ijs gedurende 5 minuten 
			Opmerking: De anionactieve detergentia natrium dodecyl sulfaat (SDS) in de buffer RIPA is van cruciaal belang voor de latere vaststelling van de Rb-SUMO, omdat het kan elimineren het aspecifieke SUMO-signaal dat is afgeleid van de niet-covalente interactie tussen de Rb eiwit en andere niet-Rb SUMO-soort(en).</li>
		</ol></li> <li>De cel lysates bij 18.000 x g gedurende 30 min Centrifugeer bij 4 ° C. het supernatant overbrengen in nieuwe micro-centrifuge buizen van 1,5 mL. 
		Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De eiwitten kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C gedurende ten minste 6 maanden.</li>
		<li>Ter voorbereiding van de invoercontrole van elk monster voor de latere westelijke vlek, een klein gedeelte van het supernatans dat hierboven beschreven opslaan om een nieuwe buis en sla op -80 ° C.</li>
		<li>Toevoegen aan de bovenstaande supernatant, 1 microgram van aspecifieke muis immunoglobulin G (IgG) van dezelfde soorten en isotype als het monoklonaal antilichaam Rb en 20 µL van 50% eiwit A/G-sepharose drijfmest. Vervolgens, Incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C met zachte rotatie.</li>
		<li>De monsters bij 3000 x g gedurende 3 min Centrifugeer bij 4 ° C. zorgvuldig verzamelen van het supernatant zonder verstoring van de kralen, en deze overbrengen naar de nieuwe 1,5 mL micro-centrifuge buizen. Om elk van de monsters, voeg 5 µL Rb primair antilichaam en 40 µL van 50% eiwit A/G-sepharose drijfmest. Vervolgens, na een nacht bebroeden bij 4 ° C met zachte rotatie.</li>
		<li>Verzamel de kralen door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 3 min bij 4 ° C, en verwijder voorzichtig het supernatant door pipetteren. Merk op dat om te voorkomen dat het verlies van de kraal, doen niet de droge kralen gecombineerd.</li>
		<li>Wassen de kralen viermaal met 1 mL van de buffer RIPA. Elk tijd, meng de buizen goed door rotatie hen bij 4 ° C gedurende 15 min. verzamelen de kralen door lage snelheid centrifugeren bij 3000 x g gedurende 3 min bij 4 ° C en vervolgens negeren het supernatant.</li>
		<li>Na het verwijderen van supernatant van de laatste wasbeurt, resuspendeer de kralen in 30 µL 1 x natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) laden buffer (tabel 1) en meng goed.
		<ol><li>Incubate de buizen bij 100 ° C in een serie blokkeren voor 10 min. Centrifugeer de monsters bij 12.000 x g gedurende 1 minuut aan de pellet de kralen. Zorgvuldig verzamelen van het supernatant zonder verstoring van de kralen, en deze overbrengen naar 1,5 mL micro-centrifuge buizen.</li>
		</ol></li> <li>Analyseer de monsters door 4% - 20% kleurovergang SDS-pagina gel en Western blot of bewaar ze bij-20 ° C voor later gebruik.</li>
	</ol></li></ol> 2. Analyse van exogene Rb-SUMOylation 6XHis-gelabeld in menselijke cellen <ol><li>cel cultuur en transfectie.
	<ol><li>Zaad ~ 6 × 10 6 HEK293 cellen in een 10 cm schotel en incubeer gedurende 24 uur in groeimedium onder normale cel kweekomstandigheden te verwerven van 75% - 85% confluente cellen. Voor transfectie, neem het groeimedium en voeg 6 mL van verminderde serum voorverwarmde medium (Zie Tabel van materialen) en plaats vervolgens de gerechten terug in de incubator.</li>
		<li>Voor de Rb constitutieve SUMOylation assay, invoegtoepassing 15 µg 6XHis-gelabeld Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT en Ubc9-C93S-plasmiden 500 µL verminderde serum medium in 1,5 mL micro-centrifuge buizen, respectievelijk.
		<ol><li>Te analyseren de SUMO-vervoeging van wild type Rb en haar SUMOylation-defecte mutant, meng 10 µg ofwel 6XHis-gelabeld Rb-WT of Rb-K720R plasmide samen met GFP-SUMO1 (10 µg) in 500 µL verminderd serum medium in 1,5 mL micro-centrifuge buizen 13.</li>
		</ol></li> <li>Ondertussen, in een aparte buis, Meng 50 µL transfectiereagens (Zie Tabel van materialen) in 500 µL verminderd serum medium, en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten</li>
		<li>Volledig combineren van de twee afzonderlijke buizen hierboven beschreven, en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten toevoegen de transfectie reagens/plasmide complexen aan de cellen en blijven cultuur voor 8 h bij 5% CO 2 en 37 ° C.</li>
		<li>Verminderde serum medium vervangen door groeimedium, en Incubeer de cellen onder normale kweekomstandigheden voor 48 h na transfectie.</li>
	</ol></li> <li>Nikkel affiniteit pull-down van de Rb 6XHis-gelabeld proteïne.
	<ol><li>Lyse transfected cellen HEK293 en extract van de totale eiwitten zoals beschreven punt 1.3.1.</li>
		<li>Centrifuge de cel lysates bij 18.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. zorgvuldig verzamelen van het supernatant en deze overbrengen naar schone buizen. 
		Opmerking: Het eiwit kan worden bevroren op dit punt voor meer dan 6 maanden -80 ° C.</li>
		<li>Ter voorbereiding van de invoercontrole van elk monster voor de latere westelijke vlek, het opslaan van een klein gedeelte van het supernatant hierboven beschreven om een nieuwe buis en sla op -80 ° C.</li>
		<li>Wassen 25 µL van 50% nikkel nitrilotriacetic zuur (Ni-NTA) agarose kralen met RIPA buffer tweemaal in een 1,5 mL micro-centrifuge buis voor elk monster. Verzamelen van de kralen door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 3 min bij 4 ° C.</li>
		<li>Add 1 M imidazool aan elk monster te verkrijgen van een eindconcentratie van 10 mM. Dan, voeg elk monster aan de buis met de bereid Ni-NTA agarose kralen.</li>
		<li>Broeden de kralen en de lysates gedurende 2 uur bij 4 ° C met zachte rotatie. Draai de kralen bij 3000 x g gedurende 3 min bij 4 ° C, en verwijder voorzichtig het supernatant door pipetteren. Parel om verlies te voorkomen, doen niet gecombineerd droge kralen.</li>
		<li>Wassen de kralen met 1 mL was buffer met 20 mM imidazool (tabel 1). Elk tijd, meng de buizen goed door rotatie bij 4 ° C gedurende 15 min. Collect de kralen door spinnen bij 3000 x g gedurende 3 min bij 4 ° C en negeren het supernatant.</li>
		<li>Na de definitieve wash, 30 µL van elutie buffer met 250 mM imidazool (tabel 1) toevoegen aan elk monster en flick om te mengen. Vervolgens, Incubeer gedurende 20 min bij 4 ° C tot de eiwitten Elueer.</li>
		Elk monster mengen <li>met 6 × SDS-pagina laden buffer (tabel 1). Vervolgens, Incubeer de buizen bij 100 ° C in een blok van de warmte voor 10 min.</li>
		<li>Centrifuge op 12.000 x g voor 1 min aan de pellet van de kralen. Zorgvuldig het supernatant zonder verstoring van de kralen verzamelen en overbrengen van de monsters naar 1,5 ml micro-centrifuge buizen. De monsters kunnen worden geanalyseerd door de westelijke vlek of opgeslagen bij-20 ° C voor later gebruik.</li>
	</ol></li></ol> 3. Western Blot <ol><li>de immunoprecipitation laden of pull-down van de vorige stappen naar 4-20% kleurovergang SDS-pagina gelen verkregen monsters. Voeren van elektroforese bij 120 V voor 90 min te scheiden van de eiwitten.</li>
	<li>Overbrengen in de eiwitten uit de gel een Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride membraan door electroblotting bij 300 mA gedurende 90 minuten bij 4 ° C met behulp van de methode van de overdracht van de tank. Het membraan PVDF in blok buffer met 5% nonfat melk (tabel 1) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur blokkeren.</li>
	<li>Incubate het membraan met primair antilichaam in antilichaam verdunning buffer met 3% bovien serumalbumine (BSA) (tabel 1) 's nachts bij 4 ° C. Voor primaire antilichamen, gebruikt u een werkende concentratie van 0,5 µg/mL (anti-SUMO1 antistof) of een verdunning van 1:2000 (anti-Rb en anti-tubuline antilichamen) of 1:5,000 (anti-GFP en anti-zijn antilichaam).</li>
	<li>Wassen het membraan 3 x voor 10 min telkens 1 x tris-gebufferde zoutoplossing met Tween (TBST) buffer (tabel 1). Incubeer het membraan met soorten specifieke Horseradish Peroxidase HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen verdunde 1:5,000 in blok buffer met 5% nonfat melk (tabel 1). Wassen van het membraan 3 x voor 10 min telkens met 1 x TBST buffer.</li>
	<li>Incubeer het membraan met Verbeterde Chemiluminescentie (ECL) oplossing werken. Betrekking hebben op het membraan met plastic wrap en worden blootgesteld aan een X-ray film afhankelijk van sterkte signaal.</li>
</ol>

<ol><li>Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+cycle+transcription+during+G1+and+S+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of cell cycle transcription during G1 and S phases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).</li>
<li>Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G1+cell-cycle+control+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">G1 cell-cycle control and cancer.</a> Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).</li>
<li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinoblastoma+protein+and+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The retinoblastoma protein and cell cycle control.</a> Cell. 81 (3), 323-330 (1995).</li>
<li>Giacinti, C., Giordano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RB+and+cell+cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RB and cell cycle progression.</a> Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).</li>
<li>Burkhart, D. L., Sage, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+tumour+suppression+by+the+retinoblastoma+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene.</a> Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).</li>
<li>Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rb%2Fchromatin+connection+and+epigenetic+control%3A+opinion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion.</a> Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).</li>
<li>Hilgendorf, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinoblastoma+protein+induces+apoptosis+directly+at+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria.</a> Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).</li>
<li>Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+within+the+pRb+pathway%3A+is+there+a+code+of+conduct%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct.</a> Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).</li>
<li>Macdonald, J. I., Dick, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modifications+of+the+retinoblastoma+tumor+suppressor+protein+as+determinants+of+function%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cancer%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function.</a> Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).</li>
<li>Ezhevsky, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypo-phosphorylation+of+the+retinoblastoma+protein+%28pRb%29+by+cyclin+D%3ACdk4%2F6+complexes+results+in+active+pRb%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).</li>
<li>Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+oncoproteins+E1A+and+E7+and+cellular+LxCxE+proteins+repress+SUMO+modification+of+the+retinoblastoma+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor.</a> Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+SUMO-2%2F3+induced+senescence+through+p53-+and+pRB-mediated+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways.</a> J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).</li>
<li>Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation+of+Rb+enhances+its+binding+with+CDK2+and+phosphorylation+at+early+G1+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase.</a> Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).</li>
<li>Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concepts+in+sumoylation%3A+a+decade+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concepts in sumoylation: a decade on.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).</li>
<li>Flotho, A., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylation%3A+a+regulatory+protein+modification+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease.</a> Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).</li>
<li>Eifler, K., Vertegaal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation-Mediated+Regulation+of+Cell+Cycle+Progression+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer.</a> Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).</li>
<li>Wilkinson, K. A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms%2C+regulation+and+consequences+of+protein+SUMOylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation.</a> Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).</li>
<li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus%3A+different+functions%2C+similar+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).</li>
<li>Sharma, P., Kuehn, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SENP1-modulated+sumoylation+regulates+retinoblastoma+protein+%28RB%29+and+Lamin+A%2FC+interaction+and+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization.</a> Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).</li>
<li>Jakobs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubc9+fusion-directed+SUMOylation+%28UFDS%29%3A+a+method+to+analyze+function+of+protein+SUMOylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation.</a> Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).</li>
<li>Gareau, J. R., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUMO+pathway%3A+emerging+mechanisms+that+shape+specificity%2C+conjugation+and+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).</li>
<li>Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+E2-mediated+SUMO+conjugation+revealed+by+a+complex+between+ubiquitin-conjugating+enzyme+Ubc9+and+RanGAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1.</a> Cell. 108 (3), 345-356 (2002).</li>
<li>Saitoh, H., Hinchey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+small+ubiquitin-related+protein+modifiers+SUMO-1+versus+SUMO-2%2F3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3.</a> J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).</li>
<li>Ayaydin, F., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+in+vivo+dynamics+of+vertebrate+SUMO+paralogues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit witboek beschrijft een protocol om te detecteren en analyseren van de endogene SUMOylation van Rb in menselijke cellen. Als deze methode specifiek op de endogene Rb eiwit zonder een afwisseling van globale SUMO-gerelateerde signaal gericht is, is het een belangrijk instrument voor het onderzoeken van de Rb-SUMO wijziging volledig natuurlijke fysiologische omstandigheden.
Dit om doel te bereiken, is het belangrijk om in gedachten te houden dat: 1) Hoewel SUMO vier isoforms (SUMO1-4, elk doo...

De nauwkeurige controle van de celcyclus in eukaryote cellen is gebaseerd op een strakke regelgeving netwerk, die ervoor zorgt dat bepaalde gebeurtenissen in een geordende wijze1,2 plaatsvinden. Een van de hoofdrolspelers in dit netwerk is het Retinoblastoom (Rb) eiwit, de eerste gekloonde tumor suppressor1,3. De Rb-eiwit wordt beschouwd als een negatieve regelgever van de celcyclus, vooral voor de G0/G1 te S faseovergang,4,5van de groei van de tumor. Gebrekkige werking van de Rb van hetzij rechtstreeks leidt tot de meest voorkomende intraoculaire maligniteit bij kinderen, retinoblastoom, of draagt bij aan de ontwikkeling van vele andere soorten kanker5. Bovendien, Rb is betrokken bij veel cellulaire routes, met inbegrip van celdifferentiatie, chromatine-remodeling en apoptosis mitochondriën-gemedieerde3,6,7.
Posttranslationele modificaties spelen een sleutelrol bij de regulering van RB functie8,9. Fosforylering is een dergelijke wijziging, en het leidt meestal tot Rb inactivatie. In rustige G0 cellen is Rb actief met een lage fosforylatie niveau. Als cellen vooruitgang door middel van G0/G1-fase, is Rb sequentieel hyper-phosphorylated door een reeks van cycline-afhankelijk proteïne kinases (CDKs) en cyclines, zoals cycline E/CDK2 en cycline D/CDK4/6, die de inactivering van Rb en elimineren van haar vermogen om het onderdrukken van de celcyclus gerelateerde gen expressie4,10. RB kan ook worden gewijzigd door kleine ubiquitin-gerelateerde modifier (SUMO)11,12,13.
SUMO is een ubiquitin-achtig eiwit die covalent is gekoppeld aan een verscheidenheid van target eiwitten. Het is van cruciaal belang voor diverse cellulaire processen, waaronder celcyclus verordening, transcriptie, cellulaire eiwit-lokalisatie en afbraak, vervoer en DNA herstellen14,15,16, 17 , 18. de SUMO vervoeging traject bestaat uit het dimeric SUMO E1 activerend enzym SAE1/UBA2, de één E2 conjugating enzym Ubc9, meerdere E3 ligases en SUMO-specifieke proteasen. In het algemeen, ontluikende SUMO eiwitten moeten proteolytically worden verwerkt voor het genereren van de volwassen vorm. De volwassen SUMO is geactiveerd door de heterodimer van de E1 en vervolgens overgebracht naar het E2-enzym Ubc9. Ten slotte, de C-terminal glycine van SUMO is covalent geconjugeerd met het doel lysine van een substraat, en dit proces wordt meestal vergemakkelijkt door E3 ligases. De SUMO-eiwit kan worden verwijderd uit het gemodificeerde substraat door specifieke proteasen. Een eerdere studie door de auteurs van deze paper bleek dat SUMOylation van Rb zijn binding aan CDK2 verhoogt, leiden tot hyper-fosforylatie in de vroege fase van de G1, een proces die nodig voor de celcyclus progressie13 is. We toonden ook aan dat het verlies van Rb SUMOylation een verminderde celproliferatie veroorzaakt. Bovendien werd onlangs aangetoond dat de SUMOylation van Rb de Rb proteïne remmen omzet beschermt, waardoor het niveau van de Rb eiwitten in cellen19. Daarom speelt SUMOylation een belangrijke rol in functie van de Rb in diverse cellulaire processen. Verdere studie de functionele gevolgen en de fysiologische relevantie van Rb SUMOylation, het is belangrijk om een effectieve methode voor het analyseren van de SUMO status van Rb in menselijke cellen of weefsels van de patiënt.
SUMOylation is een omkeerbare en zeer dynamisch proces. Het is dus meestal moeilijk op te sporen van de SUMO gemodificeerde eiwitten volledig endogene omstandigheden. Dit document stelt een methode voor het detecteren van endogene Rb SUMOylation. Bovendien, het toont hoe te detecteren van exogene Rb SUMOylation van wild-type Rb én de SUMO-deficiënte mutatie11. In het bijzonder beschreven Jacobs et al. een methode voor het vergroten van de SUMO wijziging van een bepaald substraat specifiek door Ubc9 fusion geleide SUMOylation (UFDS)20. Dit protocol wordt op basis van deze methode, en beschreven hoe de gedwongen SUMOylation van Rb en de functionele gevolgen ervan te analyseren. Gezien het feit dat honderden SUMO substraten eerder beschreven zijn en meer vermeende SUMO substraten geconstateerd van vele proteomic gebaseerde testen, kan dit protocol worden toegepast om te analyseren de SUMO-wijziging van deze eiwitten in menselijke cellen.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>AMRESCO</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>N-Ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>E3876&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>AMRESCO</td><td>M107</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Substitute (NP-40)</td><td>AMRESCO</td><td>M158</td><td></td></tr><tr><td>protease inhibitor</td><td>Roche</td><td>5892970001</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Immunoglobulin G (IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Rb antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#9309</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G-Sepharose Beads</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2003</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine-2000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads</td><td>Qiagen</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel</td><td>BIO-RAD</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>AMRESCO</td><td>M147</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin antibody</td><td>Abmart</td><td>M30109</td><td></td></tr><tr><td>SUMO1 antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-2044</td><td></td></tr><tr><td>GFP antibody</td><td>Abmart</td><td>M20004</td><td></td></tr><tr><td>Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>enhanced chemiluminescence (ECL) Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo detectie en analyse van rb eiwit sumoylation in menselijke cellen

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

De posttranslationele modificaties van eiwitten zijn kritisch voor de juiste regulering van intracellulaire signaaltransductie. Onder deze wijzigingen is kleine ubiquitin-gerelateerde modifier (SUMO) een ubiquitin-achtig eiwit dat covalent lysine residuen van een verscheidenheid van target eiwitten vastzit te reguleren van cellulaire processen, zoals gene transcriptie, DNA-reparatie, eiwit interactie en afbraak, subcellular vervoer en signaaltransductie. De meest gemeenschappelijke aanpak voor het opsporen van eiwit SUMOylation is gebaseerd op de expressie en de zuivering van recombinante tagged eiwitten bij bacteriën, waardoor voor een in vitro biochemische reactie is eenvoudig en geschikt voor adressering mechanistische vragen. Als gevolg van de complexiteit van het proces van SUMOylation in vivois het echter moeilijker te detecteren en analyseren van eiwitten in cellen, met name wanneer omstandigheden endogene SUMOylation. Een recente studie door de auteurs van deze paper openbaarden dat endogene Retinoblastoom (Rb) eiwit, een tumor suppressor dat is essentieel voor de negatieve regulering van de celcyclus, specifiek SUMOylated in de vroege fase van de G1. Dit witboek beschrijft een protocol voor de detectie en analyse van Rb SUMOylation onder zowel endogene als exogene voorwaarden in menselijke cellen. Dit protocol is geschikt voor het onderzoek van het phenotypical en functionele SUMO-wijziging van de Rb, evenals vele andere SUMO-gerichte eiwitten bevatten, in menselijke cellen.

U wilt opsporen endogene Rb SUMOylation tijdens de celcyclus, deze studie eerst gesynchroniseerd HEK293 cellen in vijf verschillende stadia van de celcyclus (G0, vroege G1, G1, S en G2/M) zoals beschreven in de sectie protocol van dit document. De kwaliteit van synchronisatie werd bevestigd met behulp van de vlek van nucleic zuur met propidium jodide gevolgd door stroom cytometry analyse (Figuur 1). Vervolgens werden de cellen verzameld en lysed door denature...

Kleine ubiquitin-gerelateerde modifier (SUMO) familie eiwitten zijn geconjugeerd lysine residuen van doel eiwitten voor het regelen van diverse cellulaire processen. Dit witboek beschrijft een protocol voor de detectie van Retinoblastoom (Rb) eiwit SUMOylation onder endogene en exogene voorwaarden in menselijke cellen.

In Vivo Detectie en analyse van Rb eiwit SUMOylation in menselijke cellen

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

Het algemene doel van dit experiment is het detecteren van de SUMOylering van retinoblastoomproteïnen onder endogene en exogene omstandigheden in menselijke cellen. Eiwitten uit de familie van de kleine ubiquitine-gerelateerde modifier, of SUMO, worden geconjugeerd aan de lysineresten van doelproteïnen om diverse cellulaire processen te reguleren. Meestal is het starten van een proteïne-SUMOylering in cellen uitdagender vanwege de complexiteit van SUMOylering in vivo.Dit experiment detecteert de SUMOylering van zowel endogene als exogene Rb-eiwitten. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de SUMOylering van Rb-eiwitten, is deze ook geschikt voor de detectie van veel andere SUMO-doeleiwitten in cellen. Begin met het toevoegen van 25 milliliters DMEM met één procent penicilline streptomycin, en incubeer de HEK293-cellen bij 37 °C gedurende 72 uur.Was de cellen van de plaat met drie milliliter ijskoude PBS. Draag de cellen vervolgens over naar een nieuwe buis van vijf milliliter. Om G1-fase cellen te verkrijgen aan het einde van het G0-synchronisatieproces, wordt het DMEM verwijderd en vers groeimedium toegevoegd, zodat de HEK293-cellen de celcyclus opnieuw kunnen betreden.Verzamel

in-vivo-detection-analysis-rb-protein-sumoylation-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates the in vitro method for SUMOylation of substrate proteins using a sequential enzyme cascade. Further, the SUMOylated status of the protein is identified using the electrophoresis and immunoblotting technique.

SUMOylation Assay: An In Vitro Technique to Detect the SUMOylation Status of Substrate Proteins by Immunoblotting

Ratiometrische bimoleculaire bakens (RBMBs) kan worden gebruikt om het interne gemanipuleerde RNA-transcripten in levende cellen. Hier beschrijven we de bereiding en zuivering van RBMBs, levering van RBMBs in cellen van microporatie en fluorescentie beeldvorming van afzonderlijke RNA transcripten in real-time.

Real-time beeldvorming van Single Engineered RNA-transcripten in levende cellen door gebruik Ratiometrische Bimoleculaire Beacons

Dit manuscript beschrijft de detectie van sumoylation en ubiquitinering van kinetochoor eiwitten, Ndc10 en Ndc80, in de gist Saccharomyces cerevisiae.

Eiwitzuivering Techniek dat Detectie van sumoylation en Ubiquitinering van Budding gist kinetochoor Eiwitten Ndc10 en Ndc80 Maakt

Eiwit-eiwit interacties kunnen zowel in de kern als in het cytoplasma van een cel optreden. Om deze interacties te onderzoeken, worden traditionele co-immunoprecipitatie en moderne proximity ligatie-assay toegepast. In deze studie vergelijken we deze twee methoden om de verdeling van NF90-RBM3 interacties in de kern en het cytoplasma te visualiseren.

Visualisatie van eiwit-eiwit interacties in nucleaire en cytoplasmatische fracties door Co-immunoprecipitatie en<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligatie Assay

We beschrijven een protocol te identificeren van RNA-bindende proteÃ¯nen en kaart van de regio's hun RNA-bindende in levende cellen met behulp van UV-gemedieerde photocrosslinking en massaspectrometrie.

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

In tegenstelling tot ubiquitin ligases, zijn paar E3 SUMO ligases geïdentificeerd. Deze gewijzigde in vitro SUMOylation protocol vermag roman SUMO E3 ligases identificeren door een reconstructie in vitro assay.

In Vitro SUMOylation Assay te studeren SUMO E3 Ligase activiteit

Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling van een dominant-negatieve afleidbare systeem, waarin elk eiwit kan voorwaardelijk worden geïnactiveerd door omkeerbaar overexpressing een dominant-negatieve mutant versie van het.

Afleidbare en omkeerbare Dominant-negatief (DN) eiwit remming

SUMO is een essentiële en zeer behouden, kleine ubiquitin-achtige modifier proteïne. In dit protocol beschrijven we het gebruik van een stress-tolerante recombinant SUMO-trappen eiwit (kmUTAG) te visualiseren native, untagged SUMO geconjugeerde en hun lokalisatie in een verscheidenheid van soorten cellen.

Lokalisatie van SUMO-gemodificeerde eiwitten met behulp van fluorescerende Sumo-trapping eiwitten

Hier presenteren we een protocol om te verrijken, isoleren, identificeren en karakteriseren van eiwitten die zijn gewijzigd door SUMO in vivo zowel van menselijke hepatoma cellen en lever tumoren verkregen uit muizen modellen van hepatocellulaire carcinoom met behulp van SUMO-bindende entiteiten (SUBEs).

SUMO-bindende entiteiten (SUBEs) als hulpmiddelen voor de verrijking, isolatie, identificatie en karakterisering van de SUMO proteome in leverkanker

Dit protocol is gericht op het opzetten van ubiquitine (UB) en ubiquitine-likes (Ubls) specifieke proteomes om veranderingen van dit soort post-translationele modificaties (Ptm's) te identificeren, geassocieerd met een specifieke aandoening zoals een behandeling of een fenotype.

Profilering van Ubiquitin en Ubiquitin-achtige afhankelijke post-translationele modificaties en identificatie van belangrijke veranderingen

Deze protocollen bieden de methodologie die wordt gebruikt om de enzymatische activiteit van individuele leden van de eiwit arginine methyltransferase (PRMT) familie in cellen te beoordelen. Gedetailleerde richtlijnen voor het beoordelen van PRMT-activiteit met behulp van endogene en exogene biomarkers, methyl-arginine-herkennende antilichamen en remmertoolverbindingen worden beschreven.

Kwantitatieve methoden voor het bestuderen van eiwit Arginine Methyltransferase 1-9 activiteit in cellen

Leer de detectie van Rb-eiwit SUMOylatie in menselijke cellen onder endogene en exogene omstandigheden. Deze methode met HEK293-cellen biedt inzicht in eiwitmodificatieprocessen.

In Vivo Detectie en analyse van Rb eiwit SUMOylation in menselijke cellen

Meer video's verkennen