Name: Karakterisering van cel migratie binnen driedimensionale In Vitro wond omgevingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Leer celmigratie analyseren in 3D fibrine-matrices voor wondgenezingsonderzoek met humane dermale fibroblasten. Deze reproduceerbare methode helpt therapeutische strategieën te verbeteren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering voor dit werk werd verstrekt door de American Heart Association (16SDG29870005) en de North Carolina State University Research en innovatie zaad financiering.

1. dag 1: cel en de bereiding van het reagens Opmerking: alle cel en reagens voorbereiding dient te worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast ter voorkoming van verontreiniging van monsters.
<ol><li>Warm gefilterd Dulbecco &#39; s gewijzigd Eagle &#39; s Medium (DMEM), foetaal runderserum (FBS), L-glutamine en penicilline/streptomycine in een waterbad 37 ° C.</li>
	<li>Voorbereiden neonatale menselijke dermale fibroblast (HDFn) media door haar aan te vullen opgewarmd DMEM met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine en 1% L-glutamine.</li>
	<li>Ontdooi een flesje van bevroren HDFns en centrifuge voor 8 min. op 200 x g te verwijderen cryopreservatie medium. Resuspendeer de cellen in de voorbereide HDFn media bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen/mL en zaad in een maatkolf van het cultuur T-75.</li>
	<li>Plaats de kolf in een incubator (37 ° C, 5% CO 2) dat de celproliferatie.</li>
	<li>Winkel HDFn media bij 4 ° C.</li>
	<li>Pro - en anti - migratory reagentia bereiden desgewenst.</li>
</ol> 2. Dag 3: Sferoïde voorbereiding <ol><li>de volgende uitvoeren in een cultuur kap ter voorkoming van verontreiniging van monsters.</li>
	<li>Wanneer cellen bereikt 80% confluentie, gecombineerd media en voeg 5 mL van 0,25% trypsine-EDTA. Winkel destillatiekolf in een incubator 37 ° C gedurende 5 minuten om volledig los van cellen van het oppervlak van de kolf te.</li>
	<li>5 mL van verwarmde media Voeg aan de maatkolf om te neutraliseren de trypsine.</li>
	<li>In een microcentrifuge buis, meng 10 μL van Trypan Blue en 10 μL van de celsuspensie.</li>
	<li>Centrifuge de oorspronkelijke celsuspensie gedurende 8 minuten op 200 x g.</li>
	<li>Terwijl de celsuspensie worden gecentrifugeerd, 10 μL van de celsuspensie Trypan Blue toevoegen aan een hemocytometer en uitvoeren van een cel tellen.</li>
	<li>Na centrifugeren, gecombineerd media zonder het loskomen van de cel-pellet. Resuspendeer de pellet cel bij een concentratie van 1,25 x 10 5 cellen/mL.</li>
	<li>Voeg 5 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) naar de onderkant van een 10 cm petrischaal te handhaven een gehydrateerd klimaat tijdens sferoïde groei.</li>
	<li>Omkeren de deksel van de petrischaal. Voeg enkele druppels voor 20 μL van de celsuspensie op de binnenzijde van de deksel van de petrischaal.</li>
	<li>Snel het deksel weer omkeren en plaats deze terug aan de onderkant van de schotel, voorzichtig om niet te verjagen van de hangende druppels. Figuur 1 illustreert met succes gevormde hangende druppels.</li>
	<li>Zorgvuldig plaats de schotel in een 37 ° C incubator en toestaan spheroïden om te groeien in een hangende drop cultuur voor een periode van 72 h.</li>
</ol> 3. Dag 6: Het inbedden van spheroïden in 3D Matrix <ol><li>de volgende uitvoeren in een cultuur kap ter voorkoming van verontreiniging van monsters.</li>
	<li>Voor de vorming van eerste fibrine laag, maken een klonter-oplossing van voldoende volume toe te voegen 100 μl van clot oplossing per putje voor zoveel wells als nodig (1 sferoïde per putje). Stolsels bestaan uit 10% 10 X HEPES buffer door volume (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50 mM CaCl 2, pH 7.4), 2 mg/mL menselijk fibrinogeen en 0.1 U/mL menselijke Alfa trombine. Het resterende deel van de klonter volume bestaat uit ultrazuiver water.
	<ol><li>Toevoegen trombine laatst en snel toevoegen oplossing aan gewenste putjes in een 48-well plaat om te voorkomen dat stolsels actinemonomeren voorafgaand aan wordt toegevoegd aan putjes.</li>
	</ol></li> <li>Voorzichtig schudden/kraan goed plaat om ervoor te zorgen dat fibrine clot mengsel is de gehele coating goed, en plaats dan goed plaat in de incubator voor 1 h om de onderste clot laag te polymeriseren. Niet schud goed plaat hard genoeg voor het opwekken van de luchtbel vorming; gewoon rock plaat als nodig is totdat het geheel van de put is bekleed. Als grotere clot volumes worden gebruikt, deze stap niet noodzakelijk kan zijn.</li>
	<li>Spheroïden overbrengen in de laag fibrine.
	<ol><li>Verwijderen de put plaat en de petrischaal met spheroïden in de opknoping cultuur uit de incubator neerzetten en spheroïden onder een microscoop te onderzoeken. Vervolgens zet de schotel in de cultuur kap.</li>
		<li>Zorgvuldig het omkeren van de deksel van de petrischaal toegang naar de opknoping drop culturen.</li>
		<li>Met behulp van een naald van de 21 G verbonden met een spuit van 1 mL, zorgvuldig transfer een druppel uit het omgekeerde deksel in het midden van elk goed, zorg niet om het doorprikken van de gepolymeriseerde fibrine laag coating van de bodem van de put. Om effectief de daling, Trek langzaam de daling in de naald. Stoppen met het trekken van de zuiger terug zodra de gehele daling binnen de naald; luchtbellen, die effectieve sferoïde overdracht of latere imaging verstoren kunnen terug te trekken de daling te ver kan introduceren.</li>
		<li>Onderzoeken van de goed plaat onder een microscoop om ervoor te zorgen dat de spheroïden correct in alle gewenste putten hebben overgedragen.</li>
	</ol></li> <li>Voor de vorming van tweede fibrine laag, maken een andere clot oplossing met behulp van de dezelfde voorbereiding zoals hierboven voor de oprichting van de eerste laag fibrine (stap 3.2). Zorgvuldig Pipetteer 100 μl op elke daling sferoïde-bevattende en onderzoeken onder een Microscoop opnieuw om ervoor te zorgen dat de spheroïden nog steeds intact zijn en zijn niet geduwd aan de randen van de putten.</li>
	<li>De goed plaat aan de incubator terug en laat de tweede laag te polymeriseren voor 1 h.</li>
</ol> 4. Dag 6: Toevoeging van Pro-trekkende of remmende factoren <ol><li>warme HDFn media tot 37 ° C.</li>
	<li>De volgende stappen uitvoeren in een kap om verontreiniging te voorkomen.</li>
	<li>Media voorbereiden op elke groep met inbegrip van de juiste concentraties van pro/anti-migratory agenten moeten worden geëvalueerd.</li>
	<li>Verwijderen van de goed plaat uit de incubator en plaats in de kap van een cultuur.</li>
	<li>Voeg toe 500 μL van standaard media aan elk putje van de controlegroep sferoïde, 500 μL van remmende media aan elk putje van de migratie-geremd sferoïde groep en 500 μL van pro-trekkende media aan elk putje van de groep migratie-enhanced sferoïde.</li>
	<li>De goed plaat terug te keren naar de incubator.</li>
	<li>Verandering media elke 48 h.</li>
</ol> 5. Dagen 6-9: evaluatie van de migratie van de cel en proliferatie <ol><li>afbeelding spheroïden met helderveld microscopie onmiddellijk na toevoeging van media (0 h) en vervolgens elke 24 h voor 72 h. Optioneel: op elk tijdstip, een z-stack beeld te nemen om te bepalen of migratie plaatsvindt in vliegtuigen buiten het primaire gebied van focus. In onze ervaring dit niet het geval; het is echter nuttig om ervoor te zorgen dit is het geval in elk experiment.</li>
	<li>Gebruik ImageJ cel uitgroei in elk putje bepalen door het analyseren van de procentuele toename van de ruimte voor elke sferoïde door het traceren van de rand van een cel voor elke sferoïde op elke opeenvolgende tijdstip en met behulp van de &#34; maatregel &#34; functie voor het verkrijgen van het gebied.</li>
</ol>

<ol><li>Chester, D., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+biophysical+properties+of+provisional+matrix+proteins+in+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair.</a> Matrix Biol. , (2016).</li>
<li>Martin, P., Leibovich, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cells+during+wound+repair%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).</li>
<li>Lin, B., Yin, T., Wu, Y. I., Inoue, T., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+chemotaxis+and+contact+inhibition+of+locomotion+determines+exploratory+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Interplay between chemotaxis and contact inhibition of locomotion determines exploratory cell migration.</a> Nat Commun. 6, 6619(2015).</li>
<li>Ngalim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+Adhesive+and+Soluble+Gradients+for+Imaging+Cell+Migration+with+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
<li>Charras, G., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+influences+of+the+extracellular+environment+on+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical influences of the extracellular environment on cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 15 (12), 813-824 (2014).</li>
<li>Petrie, R. J., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+Lead+the+Way%3A+A+Unified+View+of+3D+Cell+Motility%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts Lead the Way: A Unified View of 3D Cell Motility.</a> Trends Cell Biol. 25 (11), 666-674 (2015).</li>
<li>Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolarized+signaling+reveals+two+distinct+modes+of+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration.</a> J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).</li>
<li>Carlson, M. W., Dong, S., Garlick, J. A., Egles, C. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-3-642-00534-3_12">Tissue-Engineered Models for the Study of Cutaneous Wound-Healing.</a> Bioengineering Research of Chronic Wounds. , http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-642-00534-3_12 263-280 (2009).</li>
<li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> J Cell Bio. 184 (4), 481-490 (2009).</li>
<li>Fraley, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinctive+role+for+focal+adhesion+proteins+in+three-dimensional+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility.</a> Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).</li>
<li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+versus+directionally+persistent+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).</li>
<li>Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Cell+Migration+within+a+Three-dimensional+Collagen+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix.</a> J Vis Exp. (92), (2014).</li>
<li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2221-3759/2/4/198">A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model.</a> J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).</li>
<li>Ross, R., Benditt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+and+collagen+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Wound healing and collagen formation.</a> The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).</li>
<li>Sproul, E. P., Argraves, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytokine+axis+regulates+elastin+formation+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">A cytokine axis regulates elastin formation and degradation.</a> Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).</li>
<li>Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+signaling+in+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+REs+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Elastin signaling in wound repair.</a> Birth Defects REs C Embryo Today. 96 (3), 248-257 (2012).</li>
<li>Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Matrix+and+Dermal+Fibroblast+Function+in+the+Healing+Wound%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Extracellular Matrix and Dermal Fibroblast Function in the Healing Wound.</a> Adv Wound Care. 5 (3), 119-136 (2016).</li>
<li>Cox, S., Cole, M., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+Human+Dermal+Fibroblasts+in+Three-Dimensional+Fibrin+Clots%3A+Dependence+on+Fibrinogen+and+Thrombin+Concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Behavior of Human Dermal Fibroblasts in Three-Dimensional Fibrin Clots: Dependence on Fibrinogen and Thrombin Concentration.</a> Tissue Eng. 10 (5-6), 942-954 (2004).</li>
<li>Brown, A. C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin-based+biomaterials%3A+Modulation+of+macroscopic+properties+through+rational+design+at+the+molecular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Fibrin-based biomaterials: Modulation of macroscopic properties through rational design at the molecular level.</a> Acta Biomaterialia. 10 (4), 1502-1514 (2014).</li>
<li>Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+anti-inflammatory+mesenchymal+stem%2Fprecursor+cells+%28MSCs%29+through+sphere+formation+using+hanging+drop+culture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of anti-inflammatory mesenchymal stem/precursor cells (MSCs) through sphere formation using hanging drop culture technique.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 28, Unit-2B.6 (2014).</li>
<li>Bainbridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+and+the+role+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Wound healing and the role of fibroblasts.</a> J Wound Care. 22 (8), 410-412 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol maakt het mogelijk voor het onderzoek van de cel migratie in de wondgenezing ECMs door middel van een 3D-model in vitro verbonden . Een cruciale stap in de goede uitvoering van de procedure is de goede ontwikkeling van de fibroblast spheroïden; cel concentratie tijdens voorbereiding is geoptimaliseerd voor het geven van een beginconcentratie van 2.500 cellen/drop, waardoor spheroïden aan formulier betrouwbaar over een incubatietijd van 72 uur. Als een onvoldoende aantal cellen worden gebruikt, wordt...

Wondgenezing is een complex proces dat leidt tot het herstel van weefsel integriteit na letsel. Dit proces is onderverdeeld in vier overlappende stadia omsloten door hemostase, ontsteking, proliferatie en remodeling, die elk geregeld zijn door een complexe combinatie van oplosbare signalen, cel-matrix interacties en cel-cel communicatie. 1 , 2 de orkestratie van deze signalen regelt een veelheid van cellulaire reacties in de wondgenezing en bovenal cel migratie. 3 , 4 cel migratie is een zeer dynamisch proces afhankelijk van zowel cellulaire fenotypes en de biochemische en biofysische eigenschappen van de extracellulaire matrix milieu. 5 cellen voortdurend sonde hun milieu van de extracellulaire matrix door middel van integrine-gemedieerde trajecten; Dit proces maakt cellen te voelen van een breed scala van matrix eigenschappen met inbegrip van de topografie, stijfheid en opsluiting. Tweedimensionale (2D) analyse van cel migratie blijkt dat migratie wordt gedreven door lamellipodia formatie op geavanceerde kennisgebieden door middel van de generatie van actine-filament-bundels. Latere vorming van focal verklevingen op geavanceerde kennisgebieden, in combinatie met actomyosine gedreven contractie en intrekking bij de afvallende flank, rijdt de cel uit. 6 de cellulaire migratie three-dimensional (3D) op dit moment niet goed wordt begrepen, recente studies tonen echter aan dat 3D migratie is beduidend anders dan de hierboven mechanisme in 2D beschreven en waarschijnlijk door alteratief mechanismen gedreven wordt. Bijvoorbeeld, recente studies door Petrie et al. aangetoond dat, afhankelijk van de eigenschappen van de ECM, cellen in 3D-matrices tussen lamellipodium en lobopodium gedreven mechanismen van migratie schakelen kunnen. 7 omdat cel migratie een essentieel onderdeel van de wond genezing reactie is, 3D-modellen van cel migratie zijn cruciaal voor het begrip van fysiologische reacties op verschillende stimuli tijdens de wondgenezing. Hoewel cel trekgedrag op 2D oppervlakken is aangetoond dat variëren sterk van migratie in 3D-matrices, meest recente in vitro modellen van cel migratie tijdens het genezingsproces, met inbegrip van de gevestigde kras assay, wond gebruiken 2D enkelgelaagde culturen. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 meer onlangs ontwikkelde testen hebben een 3D matrix gebruikt, maar nog steeds cultuur cellen in een enkelgelaagde op de top van de matrix, dus de beperking van de mogelijkheid om echt recapituleren de driedimensionaliteit van de cel milieu in vivo. 15
Het doel van de hier beschreven methode is om te studeren cel migratie in een fysiologisch relevante 3D-model, in plaats van op een 2D ondergrond, om een meer robuuste inzicht van migratie reacties die zijn gekoppeld aan de toegepaste prikkels. Deze methode zorgt voor de evaluatie van cel migratie binnen een 3D fibrine clot matrix in aanwezigheid van de factoren die activeren of remmen trajecten die is gekoppeld aan cel migratie. Een matrix van fibrine werd gekozen voor deze methode als gevolg van de kritische rol van fibrine in een vroeg stadium van de wondgenezing; volgende letsel, een fibrine clot wordt gevormd binnen wond omgevingen te vloeien bloedverlies en fungeert als een steiger voor de eerste cel infiltratie tijdens weefselherstel en remodeling. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 bovendien fibrine klinisch als een chirurgische sealant wordt gebruikt en de samenstelling van de mastieken is gebonden aan cel migratie en ultimate genezing van resultaten. Een eerdere studie door Cox et al. fibroblast migratie met fibrine stolsels bestaat uit verschillende fibrine en trombine concentraties met het oog op het optimaliseren van een fibrine-sealant onderzocht. Migratie van cellen uit fibrine stolsels op kunststof gerechten werd in deze studies gekwantificeerd. 20 hier presenteren we een methode waarmee de kwantificering van de migratie van de cellen binnen de 3D fibrine-omgeving. Terwijl de specifiek in dit protocol beschreven methode fibrine gebruikt, kan dit model eenvoudig worden aangepast voor het gebruik van alternatieve matrix materialen zoals gewenst, zoals collageen of andere 3D-matrices. Daarnaast presenteren wij het gebruik van de fibroblast spheroïden in deze test omdat fibroblast migratie in het bed van de wond van het allergrootste belang voor de synthese van de extracellulaire matrix en reparatie/remodelleren van weefsel is. Echter, tijdens de reparatie proces neutrofielen zijn het eerste celtype migreren naar het bed van de wond, gevolgd door macrofagen. Fibroblasten beginnen dan te infiltreren in de omgeving van de wond ongeveer 48 uur na de eerste schade, aan het begin van de proliferatieve fase van de wond genezingsproces. 19 deze test kan eenvoudig worden aangepast om op te nemen van neutrofiele granulocyten, macrofagen, of andere celtypes te evalueren hoe wijzigingen in fibrine clot structuur van invloed zijn op migratie van deze celtypes. 21
Ter uitvoering van deze bepaling, ten eerste, een sferoïde fibroblast gevormd met behulp van een wijziging van de technieken beschreven voor cultuur van de cel van de stam. 22 de fibroblast sferoïde wordt vervolgens omgezet in een 3D fibrine-matrix, waarna uitgroei kan worden gemakkelijk gecontroleerd en gekwantificeerd gedurende meerdere dagen. Dit protocol rekening wordt gehouden met de 3D van fysiologische systemen door inbedding 3D cel spheroïden binnen een matrix van fibrine, dus het vermijden van de beperkingen in relevantie teweeggebracht door het gebruik van een 2D groei oppervlak met een enkelgelaagde cel naar model trekgedrag, terwijl toch toe te staan voor de evaluatie van de werking van de cel in een zeer gecontroleerde in vitro -omgeving.

<table><tbody><tr><td>Materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4,5 g/L Glucose, met Sodium Pyruvaat, zonder L-Glutamine</td><td>VWR</td><td>VWRL0148-0500</td><td>DMEM dat al L-glutamine bevat, kan ook worden gebruikt</td></tr><tr><td>100mm Tissue Cultuurschaal, Niet-Behandeld, Gesteriliseerd, Niet-Pyrogen</td><td>VWR</td><td>10861-594</td><td>Schalen van elk formaat kunnen worden gebruikt voor druppelcultuur</td></tr><tr><td>Fetaal Runderserum uit door USDA goedgekeurde landen, hitte-geïnactiveerd, steriel gefilterd, getest voor celcultuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1680149</td><td>Niet nodig als u DMEM gebruikt dat al L-glutamine bevat</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine Oplossing gestabiliseerd, steriel gefilterd, met 10.000 eenheden penicilline en 10 mg streptomycine/mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Menselijke Dermale Fibroblasten, neonataal</td><td>Thermo Fisher</td><td>C0045C</td><td>Kan worden vervangen door andere celtypen van belang</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2' naald</td><td>BD</td><td>305167</td><td>22 G x 1 1/2 naalden werken ook</td></tr><tr><td>1 mL spuit</td><td>VWR</td><td>89174-491</td><td>Spuiten van elk volume kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Cel Cultuur Multiwell Platen, Polystyreen, Greiner Bio-One (Afzonderlijk Verpakt) (48 putjes)</td><td>VWR</td><td>82051-004</td><td></td></tr><tr><td>Huiselijke Fibrinogeen - Plasminogeen, von Willebrand Factor en Fibronectine Gedepleteerd</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>FIB 3</td><td>Kan worden vervangen door matrixeiwit van belang</td></tr><tr><td>Huiselijke Alfa Trombine</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>HT 1002a</td><td>Kan niet noodzakelijk zijn, afhankelijk van het matrixeiwit van belang</td></tr><tr><td>Uitrusting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSL2 celcultuur kap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde microscoop met 10X objectief</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge compatibel met 15 mL buizen</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

karakterisering van cel migratie binnen driedimensionale in vitro wond omgevingen

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Momenteel de meeste in vitro modellen van wondgenezing, zoals gevestigde kras testen, betrekken studeren cel migratie en wond sluiting op twee-dimensionale oppervlakken. De fysiologische omgeving in welke in vivo wond genezing plaatsvindt is echter driedimensionale in plaats van twee-dimensionale. Het wordt steeds duidelijker dat cel gedrag verschilt sterk in tweedimensionale vs. driedimensionale omgevingen; Daarom is er behoefte aan een meer fysiologisch relevante in vitro modellen voor het bestuderen van de cel migratie gedrag in de wond sluiting. De hierin beschreven methode zorgt voor de studie van de cel migratie in een driedimensionaal model dat beter fysiologische omstandigheden dan tevoren vastgelegde tweedimensionale kras testen weerspiegelt. Het doel van dit model is te evalueren cel uitgroei via het onderzoek van de cel migratie van een sferoïde lichaam ingebed in een matrix van fibrine in aanwezigheid van pro - of anti - migratory factoren. Met behulp van deze methode, cel uitvloeisel van het lichaam sferoïde in een drie-dimensionale matrix kan worden waargenomen en na verloop van tijd via helderveld microscopie en analyse van sferoïde lichaamszone gemakkelijk meetbaar is. Het effect van pro-trekkende en/of remmende factoren op cel migratie kan ook worden geëvalueerd in dit systeem. Deze methode biedt onderzoekers met een eenvoudige methode voor het analyseren van cel migratie in driedimensionale wond verbonden matrices in vitro, waardoor de relevantie van in vitro cel studies voorafgaand aan het gebruik van in vivo dier modellen.

Sferoïde cultuur kan worden gebruikt om met succes het evalueren van het effect van pro- en anti-trekvogels agenten op fibroblast migratie in vitro 3D fibroblast spheroïden kunnen worden gevormd via opknoping drop cultuur over een periode van 72 h (Figuur 1). Na de periode van de cultuur, spheroïden worden ingebed binnen de klonter matrix en beeld met behulp van helderveld microscopie (Figuur 2). Het eerste ge...

Het doel van dit protocol is te evalueren van het effect van de factoren van de pro - en anti - migratory op cel migratie binnen een driedimensionale fibrine-matrix.

Karakterisering van cel migratie binnen driedimensionale In Vitro wond omgevingen

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Het algemene doel van deze procedure is om het effect van specifieke behandelingen van belang op de celmigratie in een driedimensionaal, met wondgenezing geassocieerd fibrine-steigerwerk te observeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van wondgenezing, zoals de wijze waarop veranderingen in de structuur van het vezelnetwerk de celmigratie naar fibrine-stolsels op wondlocaties beïnvloeden; het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige en reproduceerbare methode biedt voor het analyseren van celmigratie binnen fibrine-stolsels in 3D. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn aan deze methode moeite hebben, omdat het overbrengen van de sferoïden lastig kan zijn.Begin met het opwarmen van een flacon met bevroren neonatale humane dermale fibroblasten in een waterbad van 37 °C. Zodra de cellen net ontdooid zijn, worden ze verzameld door middel van centrifugatie en wordt de pellet opnieuw gesuspendeerd in vers medium voor neonatale humane dermale fibroblasten bij een concentratie van 1 x 10⁶ cellen per milliliter. Zaai de cellen vervolgens uit in een T75-kweekfles voor een incubatie van 72 uur bij 37 °C en 5% CO₂.Wanneer de cultuur een confluentie van 80% bereikt, worden de cellen losgemaakt met vijf milliliters trypsin EDTA. Na vijf minuten bij 37 °C wordt de trypsine geneutraliseerd met vijf milliliters opgewarmd medium en worden 40 µL cellen in een ratio van 1:1 gemengd met trypaanblauw. Reserveer een aliquot van 10 µL cellen voor het tellen.Verzamel de cellen door middel van centrifugatie en resuspendeer het pellet tot een concentratie van 1,25 x 10⁵ cellen per milliliter. Bedek vervolgens de bodem van een petrischaal van 10 centimeter met vijf milliliter steriele PBS. Keer daarna het deksel van de petrischaal om en breng meerdere druppels van 20 µL van de celstuspensie aan op het binnenoppervlak van het deksel.Wanneer alle druppels zijn geplaatst, wordt het deksel opnieuw op de schaal geplaatst, waarbij erop wordt gelet dat de hangende druppels niet worden verschoven, waarna de schaal voorzichtig gedurende 72 uur in een incubator op 37 degree celsius wordt geplaatst. Aan het einde van de incubatie wordt 100 microliters stollingsoplossing per sferoïde per put toegevoegd aan een 48-well plaat, waarna de plaat voorzichtig wordt geschud en aangetikt om ervoor te zorgen dat het fibrinestolmengsel de gehele put bedekt. Plaats de plaat gedurende één uur in de incubator.Wanneer de stollingslaag gepolymeriseerd is, bevestig dan onder een lichtmicroscoop de aanwezigheid van sferoïden in de hanging drop-cultuur en plaats de 48-wells plaat en de schaal met de hanging drop-cultuur in een celkweekkast. Keer het deksel van de petrischaal voorzichtig om om toegang te krijgen tot de hanging drop-culturen en gebruik een spuit van één milliliter uitgerust met een 21G-naald om één druppel in elke fibrine-gecoate well over te brengen. Wees extra voorzichtig bij het aspireren en uitplaten van de sferoïden, aangezien de meest moeilijke en kritische stap in het proces het overbrengen van de sferoïden is zonder deze te beschadigen.Inspecteer de plaat onder de microscoop om te bevestigen dat de sferoïden correct in de juiste putjes zijn geplaatst. Breng voorzichtig 100 µL vers bereide stollingsoplossing aan bovenop elke druppel die sferoïden bevat en inspecteer de sferoïden opnieuw onder de microscoop om te bevestigen dat ze nog intact zijn en zich in het midden van elk putje bevinden. Plaats de 48-wells plaat vervolgens terug in de incubator om de tweede fibrinelaag te laten polymeriseren.Behandel na één uur elke well met 500 µL van het geschikte medium voor de overeenkomstige experimentele sferoïdegroep en plaats de plaat terug in de incubator bij 37 °C. Maak elke 24 tot 72 uur beelden van de sferoïden met bright-field microscopie, waarbij een z-stack wordt gebruikt om opeenvolgende doorsneden van de 3D-celcultuur te bekijken. Traceer vervolgens, in de geschikte software voor beeldanalyse, de celrand van elke sferoïde op elk opeenvolgend tijdstip en gebruik de meetfunctie om de procentuele toename van het oppervlak voor elke sferoïde te bepalen.Na kweek in het pro- of anti-migraterende agens van interesse, kunnen de initiële gebieden van de sferoïden worden bepaald via bright-field microscopie en gebruikt worden als referentie om de graad van daaropvolgende celuitgroei vanuit de sferoïde-lichamen op elk opeenvolgend tijdstip vast te stellen. In dit representatieve experiment vertoonden de sferoïden die waren blootgesteld aan een pro-migraterend agens een significant verhoogde graad van migratie weg van het oorspronkelijke sferoïde-lichaam in vergelijking met de sferoïden die waren blootgesteld aan een migratie-remmend of controle-agens. Omgekeerd vertoonden de sferoïden die waren blootgesteld aan een anti-migraterend agens een significant verlaagde graad van migratie weg van het oorspronkelijke sferoïde-lichaam, vergeleken met de controle-behandelde sferoïden.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze, mits correct uitgevoerd, in twee en een half uur worden voltooid, exclusief de tijd voor de celkweek. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het kweken en inkapselen van celsferoïden voor driedimensionale in vitro celmigratie-assays. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals histologie en immunohistochemie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over hoe de structuur van het fibrinenetwerk binnen het stolsel of de actinestelling in de sferoïdecellen correleren met een toename of afname van de celmigratie.Vergeet niet dat het werken met celculturen en naalden extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden getroffen tijdens het uitvoeren van deze procedure, zoals het dragen van de juiste beschermende kleding en het werken in een steriele cultuurkap.

characterizing-cell-migration-within-three-dimensional-vitro-wound

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit artikel behandelt een methode om fluorescerend label collageen dat verder kan worden gebruikt voor zowel vaste en levende beeldvorming van 3D celculturen. Wij bieden ook een geoptimaliseerd protocol om endogene cytoskeleteiwitten van cellen gekweekt in 3D-omgevingen te visualiseren.

Het openbaren van de organisatie van het cytoskelet van invasieve kankercellen in 3D

Vaak gebruikt, zijn zeer toegankelijk methoden voor de behandeling van cel migratie en invasie in vitro beschreven. De eerste methode is de cel wondsluiting assay die celmotiliteit meet. De tweede methode is de transwell migratie en invasie assay die de chemotactische en invasieve vermogen van cellen beoordeelt.

In vitro cel-migratie en invasie assays

Dit artikel geeft gedetailleerde methodologieën voor het gebruik van driedimensionale (3D) assays om borstkanker cel invasie kwantificeren. Concreet bespreken we het nodig om dergelijke assays procedures, kwantificering en gegevensanalyse, alsook werkwijzen voor het verlies van membraan integriteit die ontstaat wanneer cellen binnendringen onderzoeken.

Kwantificering van de Breast Cancer Cell Invasiviteit met een drie-dimensionale (3D) Model

Celmigratie is een biologisch verschijnsel dat betrokken is bij een overvloed aan fysiologische, zoals wondgenezing en immuunreacties en pathofysiologische processen, zoals kanker. De 3D-matrix van collageen migratie assay is een veelzijdig instrument om de trekkende eigenschappen van verschillende celtypes te analyseren binnen in een 3D-fysiologische-achtige omgeving.

Analyse van cel-migratie binnen Driedimensionale Collagen Matrix

De mechanische eigenschappen en de microstructuur van de extracellulaire matrix sterk beïnvloeden 3D migratie van cellen. Een in vitro werkwijze om de tijdruimtelijk celmigratie gedrag biofysisch variabele omgevingen zowel bevolking en afzonderlijke cel niveaus, gaande beschreven.

Concentrische Gel Systeem om de biofysische rol van matrix Microenvironment op 3D-Cell Migratie Bestudeer

Deze studie meldt twee verschillende methoden voor de analyse van de invasie van de cel en migratie: de bepaling van Boyden kamer en de in vitro video Microscoop gebaseerde wondgenezing bepaling. De protocollen voor deze twee experimenten worden beschreven, en hun voor- en nadelen worden vergeleken.

Evaluatie van de invasie van de cel en het migratieproces: een vergelijking van de Video Microscoop gebaseerde kras wond Assay en de bepaling van Boyden kamer

Dit protocol beschrijft een omgekeerde verticale invasie-bepaling die kan worden gebruikt om het kwantificeren van de mogelijkheden voor migratie en invasie van cellen in een driedimensionale omgeving met behoud van de cel-communicatie. Deze test is geschikt voor zeldzame en/of gevoelige cellen.

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

Dit manuscript beschrijft hoe incisie-achtige letsels gemaakt op gekweekte epitheliale cel monolayers gunstig model wond genezing in vitro, waardoor voor beeldvorming door confocal of laser scanning microscopie, en die kan voorzien van kwalitatief hoogwaardige kwantitatieve en kwalitatieve gegevens voor het bestuderen van zowel cel gedrag en de mechanismen die betrokken zijn bij migratie.

Methoden voor de beoordeling van epitheliale cel migratie tijdens het In Vitro wondgenezing op basis van microscopie

Hier presenteren we een protocol om te evalueren van het effect van peptiden op de migratie van bronchiale epitheliale cellen. Deze methode zorgt voor de snelle en zeer reproduceerbaar accumulatie van kwantitatieve gegevens over de snelheid van cel migratie en wond sluiting.

Een roman In Vitro wond genezing Assay om te evalueren van de cel migratie

Dit artikel beschrijft een methode om wonden te creëren in het epitheel van een levende Clytia hemisphaerica medusa en wondgenezing in beeld te brengen met een hoge resolutie in vivo. Daarnaast wordt een techniek gepresenteerd om kleurstoffen en medicijnen te introduceren om signaalprocessen in de epitheelcellen en extracellulaire matrix tijdens wondgenezing te verstoren.

Karakterisering van epitheliale wondgenezing in vivo met behulp van het Cnidarische modelorganisme Clytia hemisphaerica

Een protocol voor de kwantitatieve evaluatie van 3D-celmigratie binnen en in het grensvlak van granulaire hydrogels wordt hier gepresenteerd.

Kwantificering van driedimensionale celmigratie binnen en in granulaire hydrogel biomaterialen

Leer celmigratie analyseren in 3D fibrine-matrices voor wondgenezingsonderzoek met humane dermale fibroblasten. Deze reproduceerbare methode helpt therapeutische strategieën te verbeteren.

Karakterisering van cel migratie binnen driedimensionale In Vitro wond omgevingen

Meer video's verkennen