Karakterisering van cel migratie binnen driedimensionale In Vitro wond omgevingen

Het algemene doel van deze procedure is om het effect van specifieke behandelingen van belang te observeren op celmigratie in een driedimensionaal wondgeassocieerd fibrine-scaffold. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het veld van wondgenezing, over hoe veranderingen in de vezelnetwerkstructuur de celmigratie beïnvloeden en de fibrine-klonten op wondplaatsen, het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige en reproduceerbare methode biedt voor het analyseren van celmigratie binnen fibrine-klonten in 3D. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat het overbrengen van de sferoïden moeilijk kan zijn.

Begin door een flesje bevroren neo-natale humane dermale fibroblasten te verwarmen in een waterbad van 37 graden Celsius. Wanneer de cellen net zijn ontdooid, verzamel ze door centrifugatie en suspendeer het pellet in vers neo-nataal humaan dermaal fibroblastmedium met een concentratie van 1 x 10 tot de 6e cellen per milliliter. Zaai vervolgens de cellen in een T75-kweekkolf voor een incubatie van 72 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Wanneer de kweek 80% confluency bereikt, detacheer de cellen met vijf milliliter trypsine-EDTA. Na vijf minuten bij 37 graden Celsius, neutraliseer de trypsine met vijf milliliter verwarmd medium en meng 40 microliter cellen met trypaanblauw in een 1:1 verhouding. Bewaar een 10 microliter aliquot van cellen voor het tellen.

Verzamel de cellen door centrifugatie en suspendeer het pellet op een concentratie van 1,25 x 10 tot de 5e cellen per milliliter. Bekleed vervolgens de bodem van een 10 centimeter petrischaal met vijf milliliter steriel PBS. Draai vervolgens het petrischaaldikje om en voeg meerdere druppels van 20 microliter van de celsuspensie toe op het binnenoppervlak van het deksel.

Wanneer alle druppels zijn geplaatst, draai het deksel weer om op de schotel, zorg ervoor dat de hangende druppels niet losraken en plaats de schotel voorzichtig in een 37 graden Celsius incubator gedurende 72 uur. Aan het einde van de incubatie, voeg 100 microliter klootoplossing per sferoïd per put toe aan een 48-welplate en schud en tik voorzichtig de plaat om ervoor te zorgen dat het fibrine-klootmengsel de hele put bedekt. Plaats de plaat in de incubator gedurende één uur.

Wanneer de klootlaag is gepolymeriseerd, bevestig de aanwezigheid van sferoïden in de hangende druppelkweek onder een lichtmicroscoop en breng de 48-welplate en de hangende druppelkweekschotel over in een celkweekkast. Draai voorzichtig het petrischaaldikje om om toegang te krijgen tot de hangende druppelculturen en gebruik een spuit van één milliliter uitgerust met een naald van 21 gauge om één druppel in elke met fibrine beklede put over te brengen. Ik neem extra zorg bij het aspireren en platen van de sferoïden, aangezien de moeilijkste en meest cruciale stap in het proces het overbrengen van de sferoïden is zonder ze te vernietigen.

Bekijk de plaat onder de microscoop om te bevestigen dat de sferoïden goed zijn gezaaid in de juiste putten. Breng voorzichtig 100 microliter vers bereide klootoplossing aan op elke sferoïd-bevattende druppel en bekijk de sferoïden opnieuw onder de microscoop om te bevestigen dat ze nog intact zijn en in het midden van elke put. Breng vervolgens de 48-welplate terug in de incubator om de tweede laag fibrine te laten polymeriseren.

Na een uur, behandel elke put met 500 microliter van het geschikte medium voor de corresponderende experimentele sferoïdgroep en breng de plaat terug in de 37 graden Celsius incubator. Verkrijg beelden van de sferoïden door helderveldmicroscopie elke 24 tot 72 uur, met behulp van een z-stack om opeenvolgende dwarsdoorsneden van de 3D-celkweek te bekijken. Vervolgens, in de juiste beeldanalysesoftware, traceer de celrand van elke sferoïd bij elk opeenvolgend tijdstip en gebruik de meetfunctie om de percentage toename in oppervlakte voor elke sferoïd te bepalen.

Na hun kweek in het pro of anti-migratoire middel van belang, kunnen de initiële gebieden van de sferoïden worden bepaald door helderveldmicroscopische beeldvorming en worden gebruikt als referentie voor het bepalen van de mate van daaropvolgende celuitgroei vanuit de sferoïdlichamen bij elk opeenvolgend tijdstip. In dit representatieve experiment vertoonden de sferoïden die werden blootgesteld aan een pro-migratoire stof een significant verhoogde mate van migratie weg van het oorspronkelijke sferoïdlichaam vergeleken met de sferoïden die werden blootgesteld aan een migratie-remmende of controlestof. Omgekeerd vertoonden de sferoïden die werden blootgesteld aan een anti-migratoire stof een significant verminderde mate van migratie weg van het oorspronkelijke sferoïdlichaam vergeleken met de controlebehandelde sferoïden.

Eenmaal beheerst, kan deze techniek in twee en een half uur worden voltooid, exclusief de celkweektijd, als het op de juiste manier wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u celsferoïden kunt kweken en inbedden voor driedimensionale in vitro celmigratie-assays. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals histologische en immunohistochemie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over hoe de fibrine-netwerkstructuur binnen de kloot of de actine-uitlijning in de sferoïdcellen correspondeert met verhoogde of verminderde celmigratie.

Vergeet niet dat het werken met celculturen en naalden buitengewoon gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van de juiste beschermingsmiddelen en het werken in een steriele kweekkast altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.