Name: C. elegans darm als een Model voor intercellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van eencellige niveau: Labeling door antilichaam kleuring, RNAi verlies-van-functie analyse en beeldvorming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Leer gepolariseerde membraanbiogenese en lumenmorfogenese analyseren in C. elegans darmcellen met behulp van antilichaamkleuring, RNAi en beeldvorming. Deze methode onthult subcellulaire asymmetrieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Mario de Bono (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK), Kenneth J. Kemphues (Cornell University, Ithaca, USA), Michel Labouesse (Institut de Biologie Parijs Seine, Université Pierre et Marie Curie, Parijs, Frankrijk), Grégoire Michaux (Université deRennes 1, Rennes, Frankrijk) en de CGC, gefinancierd door de NIH kantoor van infrastructuur onderzoeksprogramma (P40 OD010440), voor spanningen en antilichamen. Dit werk werd gesteund door subsidies NIH GM078653, MGH IS 224570 en 223809 van de stabilisatie-en associatieovereenkomst te V.G.

<ol><li>Bryant, D. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cells+to+organs%3A+building+polarized+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">From cells to organs: building polarized tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 887-901 (2008).</li>
<li>Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/56101/the-c-elegans-excretory-canal-as-model-for-intracellular-lumen">The C. elegans excretory canal as a model for intracellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis in a single cell.</a> JoVE. , (2017).</li>
<li>Rodriguez-Boulan, E., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+execution+of+the+epithelial+polarity+programme%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organization and execution of the epithelial polarity programme.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (4), 225-242 (2014).</li>
<li>Mellman, I., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+protein+sorting%2C+targeting+and+distribution+in+polarized+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinated protein sorting, targeting and distribution in polarized cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 833-845 (2008).</li>
<li>Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+core+mechanisms+to+generate+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adaptation of core mechanisms to generate cell polarity.</a> Nature. 422, 766-774 (2003).</li>
<li>Goldstein, B., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PAR+Proteins%3A+Fundamental+Players+in+Animal+Cell+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">The PAR Proteins: Fundamental Players in Animal Cell Polarization.</a> Dev. Cell. 13 (5), 609-622 (2007).</li>
<li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+vesicular+trafficking+in+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organization of vesicular trafficking in epithelia.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (3), 233-247 (2005).</li>
<li>Zegers, M. M., O'Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+polarity+and+tubulogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro.</a> Trends Cell Biol. 13 (4), 169-176 (2003).</li>
<li>Tepass, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+apical+polarity+protein+network+in+Drosophila+epithelial+cells%3A+regulation+of+polarity%2C+junctions%2C+morphogenesis%2C+cell+growth%2C+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The apical polarity protein network in Drosophila epithelial cells: regulation of polarity, junctions, morphogenesis, cell growth, and survival.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 655-685 (2012).</li>
<li>Shivas, J. M., Morrison, H. A., Bilder, D., Skop, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+and+endocytosis%3A+reciprocal+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Polarity and endocytosis: reciprocal regulation.</a> Trends Cell Biol. 20 (8), 445-452 (2010).</li>
<li>Bryant, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+network+for+de+novo+generation+of+the+apical+surface+and+lumen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A molecular network for de novo generation of the apical surface and lumen.</a> Nat. Cell Biol. 12 (11), 1035-1045 (2010).</li>
<li>Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apicobasal+domain+identities+of+expanding+tubular+membranes+depend+on+glycosphingolipid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Apicobasal domain identities of expanding tubular membranes depend on glycosphingolipid biosynthesis.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1189-1201 (2011).</li>
<li>Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin+and+AP-1+regulate+apical+polarity+and+lumen+formation+during+C.+elegans+tubulogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Clathrin and AP-1 regulate apical polarity and lumen formation during C. elegans tubulogenesis.</a> Development. 139 (11), 2071-2083 (2012).</li>
<li>Asan, A., Raiders, S. A., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+C.+elegans+Intestine+Involves+Axon+Guidance+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the C. elegans Intestine Involves Axon Guidance Genes.</a> PLoS Genet. 12 (4), e1005950(2016).</li>
<li>Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10588867">Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine.</a> Dev. Biol. 216 (1), 114-134 (1999).</li>
<li>Altun, Z. F., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.wormatlas.org/hermaphrodite/intestine/Intframeset.html">Alimentary system, intestine.</a> WormAtlas. , (2009).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56 (1), 110-156 (1977).</li>
<li>Rasmussen, J. P., English, K., Tenlen, J. R., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+and+morphogenesis+of+single-cell+tubes+in+the+C.+elegans+digestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Notch signaling and morphogenesis of single-cell tubes in the C. elegans digestive tract.</a> Dev. Cell. 14 (4), 559-569 (2008).</li>
<li>Maduro, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+development+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Gut development in C. elegans.</a> Seminars in cell & developmental biology. , (2017).</li>
<li>McGhee, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip.+Rev.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans intestine.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2 (3), 347-367 (2013).</li>
<li>Pásti, G., Labouesse, M. Epithelial junctions, cytoskeleton, and polarity. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2014).</li>
<li>Sato, K., et al. C. elegans as a model for membrane traffic. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2014).</li>
<li>Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumen+morphogenesis+in+C.+elegans+requires+the+membrane-cytoskeleton+linker+erm-1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1.</a> Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).</li>
<li>Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizing+the+cell+cortex%3A+the+role+of+ERM+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4366476">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li>
<li>Shakes, D. C., Miller, D. M. 3rd, Nonet, M. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22226520">Immunofluorescence microscopy.</a> Methods Cell Biol. 107, 35-66 (2012).</li>
<li>JS, D. uerr Immunohistochemistry. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2006).</li>
<li>T, S. tiernagle Maintenance of C. elegans. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2006).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002(2001).</li>
<li>Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2006).</li>
<li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+Putative+RNA-Directed+RNA+Polymerase+RRF-3+Makes+C.+elegans+Hypersensitive+to+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of the Putative RNA-Directed RNA Polymerase RRF-3 Makes C. elegans Hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12 (15), 1317-1319 (2002).</li>
<li>Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+siRNA-degrading+RNase+negatively+regulates+RNA+interference+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans.</a> Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).</li>
<li>Shaham, S. Methods in Cell Biology. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2006).</li>
<li>Maddox, A. S., Maddox, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+cellular+processes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).</li>
<li>Netherlands, S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007%2F978-1-4020-6754-9_11479">Nomarski Differential Interference Contrast Microscopy</a>. , Springer. Netherlands. (2008).</li>
<li>Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%3A+a+method+for+superresolution+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 6, 498-520 (2013).</li>
<li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans.</a> Nat. Rev. Genet. 3, 356-369 (2002).</li>
<li>Lee, Y. U., Son, M., Kim, J., Shim, Y. H., Kawasaki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDC-25.2%2C+a+C.+elegans+ortholog+of+cdc25%2C+is+essential+for+the+progression+of+intestinal+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">CDC-25.2, a C. elegans ortholog of cdc25, is essential for the progression of intestinal divisions.</a> Cell Cycle. 15 (5), 654-666 (2016).</li>
<li>Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+electron+microscopy+methods+for+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Modern electron microscopy methods for C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 93-149 (2012).</li>
<li>Shi, A., Grant, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+recycling+endosomes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of recycling endosomes in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 130, 181-198 (2015).</li>
<li>Caenorhabditis Genetics Center (CGC). , 
 <a target="_blank" href="http://cbs.umn.edu/cgc/home">http://cbs.umn.edu/cgc/home</a> (2017).</li>
<li>Wormbase. , 
 <a target="_blank" href=" http://www.wormbase.org/"> http://www.wormbase.org/</a> (2017).</li>
<li>McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2007).</li>
<li>Transgeneome website. , 
 <a target="_blank" href="https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html">https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html</a> (2017).</li>
<li>C. elegans expression pattern. , 
 <a target="_blank" href="http://gfpworm.org/">http://gfpworm.org/</a> (2017).</li>
<li>National BioResource Project (NBRP)::C. elegans. , 
 <a target="_blank" href="https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/">https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/</a> (2017).</li>
<li>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB). , 
 <a target="_blank" href="http://dshb.biology.uiowa.edu">http://dshb.biology.uiowa.edu</a> (2017).</li>
<li>Kamath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li>
<li>Kamath, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Rual, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14 (10B), 2162-2168 (2004).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dit protocol beschrijft hoe te combineren met standaard verlies-van-functie genetische/RNAi en (labeling en microscopische) benaderingen om te profiteren van het intestinaal epitheel van C. elegans als een model voor de visuele en moleculaire dissectie van in vivo imaging gepolariseerde membraan en lumen biogenese.
Labelen
Dit protocol richt zich op het antilichaam kleuring. In situ labeling door antilichamen is een zeer s...

De generatie van cellulaire en subcellular asymmetrische situaties bestaan, zoals de vorming van gepolariseerde membraan domeinen, is van cruciaal belang voor de voedselproductie en de functie van cellen, weefsels en organen1. Studies over gepolariseerde biogenese van organellen in epithelen blijven een technische uitdaging, omdat wijzigingen in de toewijzing van subcellular componenten in de richting is afhankelijk van meerdere opeenvolgende en samenvallende extracellulaire en intracellulaire signalen die moeilijk te scheiden in de meeste modellen en sterk afhankelijk van het modelsysteem. Het model gepresenteerd hier - de single-gelaagde Caenorhabditis elegans darm - is een weefsel van verfijnde eenvoud. Samen met de eencellige C. elegans uitscheidingsmechanisme canal (zie bijbehorende papier op gepolariseerde biogenese van organellen in het uitscheidingsmechanisme kanaal van C. elegans )2, biedt verschillende unieke voordelen voor de identificatie en kenmerken van moleculen die nodig zijn voor de biogenese van organellen gepolariseerde. De instandhouding van de moleculaire polariteit signalen uit gist aan man maken dit eenvoudige-ongewervelde orgel een uitstekende"in vivo weefsel kamer" om vragen te stellen over de epitheliale polariteit die rechtstreeks verband houden met het menselijke systeem, dat nog steeds veel te is complex dat de visuele dissectie van deze gebeurtenissen op de single cell niveau in vivo.
Hoewel meerdere geconserveerde polariteit signalen van (1) de extracelluar matrix, (2) het plasmamembraan en zijn kruispunten, en (3) de intracellulaire vesiculaire handel geïdentificeerde3, de onderliggende beginselen van hun integratie in het proces van geweest gepolariseerde epitheliale membraan en weefsel biogenese is slecht begrepen4. De klassieke eencellige in vivo modellen (e.g.S. cerevisiae en de zygote C. elegans ) hebben bijgedragen bij de vaststelling van de beginselen van gepolariseerde celdeling en anterior-posterior polariteit en kritische hebben geïdentificeerd membraan-geassocieerde polariteit determinanten (de kleine GTPases/CDC-42, de partitionering-defecte PARs)5,6, maar ze afhankelijk van unieke symmetriebreking signalen (bud litteken, sperma ingang) en gebrek aan junction-beveiligd apicobasal membraan domeinen en, vermoedelijk, de bijbehorende intracellulaire apicobasal sorteren van machines. Onze huidige kennis over de organisatie van de gepolariseerde handel in epitheel, echter berust voornamelijk op zoogdieren 2D monoculturen7, die gebrek aan fysiologische extracellulaire en ontwikkelingsstoornissen signalen die standpunten van membraan kunnen wijzigen domeinen en richtingen van mensenhandel trajecten (een overgang van 2D naar 3D in vitro cultuur systemen alleen volstaat om het omkeren van de membraan polariteit in MDCK (Madin-Darby canine kidney) cellen)8. In vivo developmental studies over epitheliale polariteit in ongewervelde modelorganismen werden aanvankelijk uitgevoerd in platte epitheel, bijvoorbeeld in de Drosophila melanogaster opperhuid, waar ze de kritische bijdrage geïdentificeerd junction dynamiek voor gepolariseerde cel migratie en cel blad verkeer9en endocytotische mensenhandel voor polariteit onderhoud10. De 3D in vitro en in vivo analyse van lumen morfogenese in tubulaire epitheel in MDCK cellen en in de darm van C. elegans , respectievelijk, onlangs gebleken dat de eis van intracellulaire mensenhandel voor de Novo (apicaal) domein en lumen biogenese en positionering van11,12,13. De dikte van buisvormige (versus flat) epitheliale cellen is een voordeel voor de 3D analyse van subcellular asymmetrieën aangezien hierdoor een superieure visuele onderscheid van de apicale-lumenal membraan, apico-laterale kruispunten, het laterale membraan, en de standpunten van intracellulaire organellen. Aan deze visuele voordelen, de C. elegans model voegt de in vivo instelling developmental as, transparantie, eenvoud van lichaam plan, invariant en gedefinieerde cel bloedlijn, analytische (genetische) en extra voordelen die hieronder worden beschreven.
C. elegans zelf is een rondworm van buisstructuur waarvan transparantie en eenvoudige architectuur zijn eveneens buisvormige interne organen direct toegankelijk voor de visuele analyse van buis en lumen morfogenese maken. De twintig cellen van de darm (soms 21 of 22-cellen)14 zijn afgeleid van een enkele progenitor cel (E) en ontwikkelen van een dubbellaagse epitheel door één bekomt stap in een bilateraal symmetrisch buis van negen INT ringen (vier cellen in de eerste ring; Figuur 1 schematische)14,15,16. De darm van afkomst en weefsel analyse, in eerste instantie bepaald door Nomarski optica via nucleaire identiteiten17en later ook door fluorescentie microscopie via gelabelde membranen, heeft kritische inzichten in de voedselproductie, verstrekt in met name de cel-autonome en cel-niet-zelfstandige vereisten voor de directionele celdelingen en bewegingen (bijvoorbeeldbekomt, rechts-links asymmetrieën, anterior en posterior buis rotatie)14,18 . Vroege endodermal cel specificatie en het gene regelgevende netwerk beheersen van de ontwikkeling van dit orgel klonale model zijn goed gekarakteriseerd19,20. De nadruk ligt hier, echter, is op de analyse van gepolariseerde membraan en lumen biogenese in één tubulaire cellen en de intracellulaire asymmetrie van endomembranes, cytoskeletal structuren en organellen die gepaard gaan met dit proces. De analyse wordt vergemakkelijkt door de eenvoud van deze buis, waar alle apicale membranen (op ultrastructureel niveau DN door microvilli) gezicht de lumen en alle basale membranen geconfronteerd met het oppervlak van de buitenste buis, met zijdelingse membranen contact met elkaar, van de apicale membraan gescheiden door kruispunten (Figuur 1 schematische; zie verwijzingen (16,21) voor de C. elegans-specifieke organisatie van strakke en adherens junction componenten). Apicale membraan biogenese is dus samenvallen met lumen morfogenese. Bovendien, de grootte van volwassen intestinale cellen - de grootste cellen van dit kleine dier (met uitzondering van de uitscheidingsmechanisme cel) - onderlinge aanpassing van de grootte van een zoogdieren cel, waardoor het in vivo visuele volgen van subcellular elementen, bijvoorbeeld vesikel trajecten, die typisch geprobeerd in vitro in een cultuur schotel.
Met het oog op deze cellulaire en subcellular analyse is passende etikettering cruciaal. Intestinale endo - of plasma-membraan domeinen, kruispunten, cytoskeletalstructuren, kernen en andere subcellular organellen kunnen worden gevisualiseerd door het labelen van hun specifieke moleculaire componenten. Veel van dergelijke componenten hebben gekenmerkt en blijven om ontdekt te worden (tabel 1 geeft een paar voorbeelden en verwijst naar de middelen). Bijvoorbeeld, zijn verschillende moleculen de buizen en/of vesiculaire compartimenten van de intestinale endomembraansysteem, onderscheiden van het ER naar het Golgi via post-Golgi blaasjes aan het plasma-membraan, geïdentificeerde22. De specifieke eiwitten (evenals lipiden en suikers) kunnen ofwel gelabeld zijn direct of niet indirect via bindende eiwitten. Dit protocol is gericht op het in situ antilichaam kleuring van vaste specimens, één van de twee standaard labeling technieken (Zie het begeleidende document op uitscheidingsmechanisme kanaal tubulogenesis voor een beschrijving van de andere techniek2 - in-vivo labeling via fluorescent proteïne fusies - die rechtstreeks toepasselijk zijn aan de darm; Tabel 2 bevat voorbeelden van darm-specifieke initiatiefnemers die kunnen worden gebruikt om de uitdrukking van deze fusie-eiwitten rijden naar de darm). Double- of meerdere labelen met beide benadering, of met een combinatie van beide plus extra chemische kleuring, kan meer diepgaande visuele resolutie en het onderzoek van de ruimtelijke en temporele veranderingen in co lokalisatie en aanwerving van specifieke moleculen of subcellular onderdelen (Figuur 2). De fixatie en kleuring van de in dit protocol steun behoud van groen fluorescent proteïne (GFP) labeling tijdens immunokleuring procedures beschreven procedures. Voor imaging, belangrijke punten van de detectie en karakterisatie van tubulogenesis fenotypen via microscopische standaardprocedures (fluorescentie ontleden en confocal microscopie) zijn beschreven ()Figuur 3, , 4). Deze kunnen worden uitgebreid tot hogere resolutie imaging benaderingen, voor aanleg super-resolution microscopie en Transmissie Electronenmicroscopie (hier niet beschreven).
Een sleutelsterkte van dit systeem is de mogelijkheid om het analyseren van polariteit in afzonderlijke cellen in verschillende ontwikkelingsstadia, van embryogenese via volwassenheid. Bijvoorbeeld, kan apicale domein en de lumen biogenese worden bijgehouden in de gehele ontwikkeling op het niveau van eencellige via labelen met ERM-1, een zeer geconserveerde membraan-actine linker van de Ezrin-Radixin-Moesin familie23,24 . ERM-1 visualiseert apicale membraan biogenese (1) tijdens de embryonale buis morfogenese, wanneer deze gelijktijdig met gepolariseerde celdeling en migratie (cellen verplaatsen apically rond de lumen tijdens bekomt)15 optreedt; (2) tijdens late embryonale en larvale buis uitbreiding dat de opbrengsten in de afwezigheid van celdeling of migratie; en (3) in de volwassen darm, waar de gepolariseerde membraan domeinen worden onderhouden (Figuur 1). In de groeiende post mitotische larvale epitheel, DOVO gepolariseerde membraan biogenese kan dus worden losgekoppeld van de gepolariseerde weefsel morfogenese, wat niet mogelijk is in de meeste modellen voor in vivo en in vitro epitheliale polariteit, met inbegrip van die met eencellige resolutie (bijvoorbeeld de 3D MDCK cyste model8). Met etikettering voor andere componenten, deze instelling biedt de mogelijkheid (met name bij de L1 larvale stadium wanneer de cellen hebben een hogere cytoplasma/nucleus ratio) te onderscheiden van de intracellulaire wijzigingen die specifiek zijn voor gepolariseerde membraan biogenese () bijvoorbeeld de heroriëntering van mensenhandel trajecten) van die gelijktijdig voor gepolariseerde celdeling en migratie.
De genetische veelzijdigheid van C. elegans is goed-bekende25en maakt het een krachtig modelsysteem voor de moleculaire analyse van biologische vragen. Een studie over voedselproductie, bijvoorbeeld, kunt u beginnen met een wild-type stam, een transgene stam waar de structuur van belang (bijvoorbeeld een membraan) wordt aangeduid met een fluorescerende marker, of met een - of winst-van-verliesfunctie mutant met een defect in dit structuur. Een typische omgekeerde genetische studie kan het genereren van een mutant waar het gen van belang wordt verwijderd in de kiemcellen (bijvoorbeeld door een gerichte verwijdering), gewijzigd door mutagenese (meestal produceren puntmutaties met het daaruit voortvloeiende verlies, vermindering of winst in functie van het gen), of waar haar transcript door RNAi wordt verminderd. Het gemak van RNAi door voeding in C. elegans26 leent zich ook voor het ontwerp van gerichte schermen die onderzoeken van een grotere groep van genen van belang. Een genetisch modelorganisme misschien wel grootste sterkte is het vermogen om uit te voeren in vivo voorwaartse schermen (bijvoorbeeld mutagenese, systematische of genoom-brede schermen van RNAi) waarmee een onbevooroordeeld onderzoek naar de moleculaire oorzaak voor een fenotype van belang. Bijvoorbeeld, een onbevooroordeelde visual C. elegans RNAi tubulogenesis scherm, dat begint met een transgene dieren met ERM-1-geëtiketteerden apicale membraan, ontdekt een intrigerende omkeerbare intestinale polariteit conversie en ectopische lumen fenotype, gebruikt hier als voorbeeld voor dit soort analyse. Dit scherm de uitputting van de glycosphingolipids (GSLs; obligate membraan lipiden, geïdentificeerd met behulp van hun GLS-biosynthetic enzymen) en onderdelen van het vesikel vacht clathrin en de AP-1 adapter geïdentificeerd als de specifieke moleculaire defecten veroorzaakt deze polariteit conversie fenotype, waardoor het karakteriseren van deze handel van moleculen als in vivo cues voor apicale membraan polariteit en positionering van12,13lumen. Bij het starten met een specifieke genetische mutatie/morfogenese fenotype, kunnen dergelijke schermen (of één genetische/RNAi interactie experimenten) functionele interacties tussen twee of meerdere genen van belang (zie bijbehorende papier op het uitscheidingsmechanisme ook onderzoeken kanaal voor een voorbeeld van een dergelijke analyse)2. Dit protocol is gericht op RNAi waarmee, naast de mogelijkheid om direct het identificeren van het gen waarvan verlies het fenotype in voorwaartse schermen veroorzaakt, specifieke voordelen worden ingesteld voor de analyse van de voedselproductie. Aangezien genproducten regisseren van voedselproductie vaak in een dosis-afhankelijke manier werken, is RNAi gewoonlijk succesvol in het genereren van een spectrum van fenotypen. De mogelijkheid voor het genereren van informatieve partiële-verlies-van-functie fenotypen helpt ook om het probleem dat de meerderheid van de genen van de belangrijke tubulogenesis van essentieel belang zijn en dat hun verliezen steriliteit en vroege embryonale letaliteit veroorzaken. Dit protocol omvat voorwaardelijke RNAi strategieën om deze moeilijkheid te overwinnen en stelt manieren voor het optimaliseren van het genereren van een breder spectrum van fenotypen, zoals een allèlique serie, geproduceerd door mutagenese.

<table><tbody><tr><td>Antibody staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-213-612</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Powdered milk</td><td>Sigma</td><td>MT409-1BTL</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MH27 (muis)</td><td></td><td></td><td>Concentration: 1:20 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.</td></tr><tr><td>MH33 (muis)</td><td></td><td></td><td>Concentration: 1:10 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.</td></tr><tr><td>anti-ICB4 (konijn)</td><td></td><td></td><td>Concentration: 1:5 Resources: A gift from Mario de Bono (Medical Research Council, Engeland)</td></tr><tr><td>anti-PAR-3 (konijn)</td><td></td><td></td><td>Concentration: 1:50 Resources: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University)</td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Floor 568 (anti-konijn)</td><td>ABCam</td><td>AB175471</td><td>Concentration: 1:200</td></tr><tr><td>Cy5 (anti-muis)</td><td>Life technologies</td><td>A10524</td><td>Concentration: 1:200</td></tr><tr><td>TRITC (anti-konijn)</td><td>Invitrogen</td><td>T2769</td><td>Concentration: 1:200</td></tr><tr><td>FITC (anti-muis)</td><td>Sigma</td><td>F9006</td><td>Concentration: 1:100</td></tr><tr><td>Labeled chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-Phalloidin</td><td></td><td></td><td>Concentration: 1:100 Resources: Molecular Probes-T7471</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Grease Silicone</td><td>Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>4448</td><td></td></tr><tr><td>Microscope coverslips (22x22-1)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans gerelateerd</td><td></td><td></td><td>zie referentie29 voor standaard C. elegans kweek- en onderhoudsprocedures.</td></tr><tr><td>LB Medium en platen</td><td></td><td></td><td>zie referentie29 voor protocollen.</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Acros Organics</td><td>611845000</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A0116</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912</td><td></td></tr><tr><td>M9 Medium</td><td></td><td></td><td>zie referentie29 voor protocollen.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>NGM platen</td><td></td><td></td><td>zie referentie29 voor protocollen.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Acros Organics</td><td>611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>RNAi platen</td><td></td><td></td><td>zie referentie30 voor protocollen.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Acros Organics</td><td>611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>US Biological</td><td>I8500</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2648</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hypochlorite</td><td>Fisher Scientific</td><td>50371500</td><td></td></tr><tr><td>Bacteria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 bacteria</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT115 bacteria</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50)</td><td>Source BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51)</td><td>Source BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beeldvorming gerelateerd</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9221-500</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dissectiemicroscoop</td><td>Nikon</td><td>SMZ-U</td><td></td></tr><tr><td>dissectiemicroscoop uitgerust met een hoogvermogen stereofluorescentie-aansluiting (Kramer Scientific), CCD-camera met Q capture-software en X-Cite-fluorescentielamp (Photonic Solutions)</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Laser-scanning confocal microscoop</td><td>Leica Microsystem</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>laser-scanning confocal gemonteerd op een ECLIPSE Ti-E omgekeerde microscoop</td><td>Nikon</td><td>C2</td><td>

c. elegans darm als een model voor intercellulaire lumen genuitdrukking en in vivo gepolariseerde biogenese van eencellige niveau: labeling door antilichaam kleuring, rnai verlies-van-functie analyse en beeldvorming

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Meercellige buizen, fundamentele eenheden van alle interne organen, bestaan uit gepolariseerde epitheliale of endotheliale cellen, met een apicale membraan voering van de membranen van het lumen en basolaterale contact met elkaar en/of de extracellulaire matrix. Hoe deze onderscheidende membraan asymmetrie is vastgesteld en gehandhaafd tijdens orgel morfogenese is nog steeds een onopgeloste kwestie van biologie van de cel. Dit protocol beschrijft de darm C. elegans als een model voor de analyse van gepolariseerde biogenese tijdens buis morfogenese, met nadruk op de apicale membraan en lumen biogenese. De C. elegans twintig-cel single-gelaagde intestinaal epitheel is ingericht in een eenvoudige bilateraal symmetrisch buis, analyse op het niveau van een eencellige toelaat. Membraan polarisatie plaatsvindt gelijktijdig met gepolariseerde celdeling en migratie tijdens de vroege embryogenese, maar DOVO gepolariseerde biogenese blijft gedurende larvale groei, wanneer cellen niet meer vermenigvuldigen en verplaatsen. De laatste instelling maakt het mogelijk om te scheiden subcellular wijzigingen die tegelijkertijd deze verschillende polariserende processen, moeilijk bemiddelen te onderscheiden in de meeste modellen van de polariteit. Apicaal, basolaterale membraan-, regulates-, cytoskeletal- en endomembrane onderdelen kunnen worden aangeduid en bijgehouden in de gehele ontwikkeling door GFP fusion eiwitten of beoordeeld door in situ antilichaam kleuring. Samen met de genetische veelzijdigheid van het organisme biedt de C. elegans darm dus een unieke in-vivo model voor het visuele, ontwikkelingsstoornissen, en moleculaire genetische analyse van gepolariseerde membraan en buis biogenese. De specifieke methoden (alle standaard) hier beschreven hoe: label intestinale subcellular onderdelen door antilichaam kleuring; analyseren van genen die betrokken zijn in gepolariseerde biogenese door studies van de verlies-van-functie aangepast aan het meestal essentiële tubulogenesis genen; beoordelen van polariteit gebreken tijdens de verschillende ontwikkelingsstadia; interpreteren van fenotypen door epifluorescence, differentiële interferentie contrast (DIC) en confocale microscopie; visuele gebreken te kwantificeren. Dit protocol kan worden aangepast aan een van de vaak zeer geconserveerde moleculen betrokken in epitheliale polariteit, de biogenese van organellen, buis en lumen genuitdrukking te analyseren.

Dit protocol wordt beschreven hoe moleculair analyseren en visualiseren van gepolariseerde membraan biogenese en lumen morfogenese in de darm van C. elegans , de eencellige als subcellular niveau. De twintig-cel single-gelaagde C. elegans darm wordt gevormd door gestuurde celdeling en migratie tijdens mid embryogenese. In deze tijd, gepolariseerde membraan domeinen worden vastgesteld, nog DOVO gepolariseerde biogenese blijft in de volwassen maar uitbreiden epith...

De transparante C. elegans darm kan dienen als een"in-vivo weefsel kamer" voor de studie van apicobasal membraan en lumen biogenese de eencellige en subcellular niveau tijdens meercellige tubulogenesis. Dit protocol beschrijft hoe te combineren met het standaard labeling, verlies-van-functie genetische/RNAi en microscopische benaderingen te ontleden van deze processen op een moleculair niveau.

C. elegans darm als een Model voor intercellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van eencellige niveau: Labeling door antilichaam kleuring, RNAi verlies-van-functie analyse en beeldvorming

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Het algemene doel van deze combinatie van standaardmethoden is om aan te tonen hoe de darm van C.elegans kan worden gebruikt voor de in vivo analyse van gepolariseerde membraanbiogenese en lumenmorfogenese op enkelcel- en subcellulair niveau. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de velden van polariteit en biogenese, zoals hoe apicale versus basolaterale membraandomeinen en andere subcellulaire asymmetrieën worden vastgesteld en behouden tijdens en na de morfogenese. Het belangrijkste voordeel van dit modelsysteem is dat deze transparante enkelluier van slechts 20 cellen in vivo in een weefselkamer kan overleven om de gepolariseerde membraan- en lumenbiogenese van individuele cellen te ontleden.De technieken kunnen worden uitgebreid naar de analyse van andere morfogenese-fenotypes van C.elegans; de focus ligt hier op de analyse van membraanbiogenese, specifiek op apicale membraan- en lumenbiogenese. De procedures omvatten verfijnde beeldvormingstechnieken in gefixeerde en levende dieren om membraandomeinen en subcellulaire componenten te onderscheiden en om lumenmorfogenese-fenotypes in een C.elegans-darm te identificeren. Deze video over intestinale tubul

the-c-elegans-intestine-as-model-for-intercellular-lumen

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Imaging C. elegans Embryo&#39;s met behulp van een epifluorescerende Microscoop en Open Source Software

Dit artikel beschrijft een techniek voor de visualisatie van de vroege gebeurtenissen van embryogenese in de...

Time-lapse microscopie van de vroege embryogenese in Caenorhabditis elegans

Deze video beschrijft freeze-cracking, een methode om C. elegans weefsels toegankelijk te maken voor antilichaamkleuring door de nagelriem te verstoren.

Freeze-Cracking van nematoden: een methode om inwendige wormweefsels bloot te leggen voor vlekken

Dit protocol beschrijft hoe u het delende cellen binnen een weefsel in Caenorhabditis elegans embryo. Terwijl verschillende protocollen beschrijven hoe afbeelding celdeling in de vroege embryo, dit protocol wordt beschreven hoe u foto celdeling binnen een zich ontwikkelende weefsel tijdens midden late embryogenese.

Visualiseren neuroblast Cytokinese Tijdens<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese

Hier wordt getoond hoe ontwikkelingsprocessen in C. elegans kunnen worden gevolgd en gekwantificeerd. De gepresenteerde methoden zijn gebaseerd op open-source tools die gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd. Het wordt gedemonstreerd hoe 3D-celvormmodellen kunnen worden gereconstrueerd, hoe subcellulaire structuren handmatig kunnen worden gevolgd en hoe corticaal contractiele stroom kan worden geanalyseerd.

Tracking en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Het gebruik van open-source tools

Het uitscheidingsmechanisme kanaal van C. elegans is een uniek eencellige model voor de visuele in vivo analyse van biogenese van DOVO gepolariseerd. Dit protocol beschrijft een combinatie van standaard genetische/RNAi en imaging benaderingen, aanpasbaar voor de identificatie en karakterisering van moleculen eencellige tubulogenesis en apicale membraan en lumen biogenese regisseren.

Het kanaal Excretory C. elegans als een Model voor de intracellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van organellen in één cel: labelen door GFP-fusies, RNAi interactie scherm en beeldvorming

Presenteren wij protocollen voor isolatie van intestinale 3D structuren uit weefsel in vivo en in vitro kelder matrix ingesloten organoids, en detail verschillende fixatie en kleuring van protocollen die zijn geoptimaliseerd voor immuno-labeling van microtubuli, centrosomal en regulates eiwitten zo goed zoals markeringen met inbegrip van de stamcel proteïne Lgr5 cel.

Immuno-belichting fluorescerende etikettering van microtubuli en Centrosomal eiwitten in Ex Vivo intestinale weefsel en 3D In Vitro intestinale Organoids

Hier presenteren we een combinatie benadering met behulp van hoge-resolutie microscopie, computationele tools, en single-cell etikettering in levende C. de embryo's van de neurologische om de enige cel dynamiek te begrijpen.

Isotrope licht-vel microscopie en geautomatiseerde Cell Lineage analyses catalogus Caenorhabditis embryogenese met subcellulaire resolutie

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

Intestinale microben, waaronder extracellulaire bacteriën en intracellulaire pathogenen zoals het Orsay-virus en microsporidia (schimmels), worden vaak geassocieerd met wilde Caenorhabditis-nematoden . Dit artikel presenteert een protocol voor het detecteren en kwantificeren van microben die C. elegans-nematoden koloniseren en / of infecteren, en voor het meten van de pathogenenbelasting na gecontroleerde infecties in het laboratorium.

RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om microbiële kolonisatie en infectie in caenorhabditis elegans darmen te visualiseren

Leer gepolariseerde membraanbiogenese en lumenmorfogenese analyseren in C. elegans darmcellen met behulp van antilichaamkleuring, RNAi en beeldvorming. Deze methode onthult subcellulaire asymmetrieën.

C. elegans darm als een Model voor intercellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van eencellige niveau: Labeling door antilichaam kleuring, RNAi verlies-van-functie analyse en beeldvorming (Video) | JoVE Journal

C. elegans darm als een Model voor intercellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van eencellige niveau: Labeling door antilichaam kleuring, RNAi verlies-van-functie analyse en beeldvorming

Meer video's verkennen