C. elegans darm als een Model voor intercellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van eencellige niveau: Labeling door antilichaam kleuring, RNAi verlies-van-functie analyse en beeldvorming
3 oktober 2017
De transparante C. elegans darm kan dienen als een"in-vivo weefsel kamer" voor de studie van apicobasal membraan en lumen biogenese de eencellige en subcellular niveau tijdens meercellige tubulogenesis. Dit protocol beschrijft hoe te combineren met het standaard labeling, verlies-van-functie genetische/RNAi en microscopische benaderingen te ontleden van deze processen op een moleculair niveau.
Het algemene doel van deze combinatie van standaardmethoden is om aan te tonen hoe het C.elegans-darm kan worden gebruikt voor de in vivo-analyse van gepolariseerde membraanbiogenese en lumenmorfogenese op cel- en subcellulair niveau. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van polariteit en biogenese, zoals hoe apicale versus basolaterale membraandomeinen en andere subcellulaire asymmetrieën worden vastgesteld en onderhouden tijdens en na morfogenese. Het belangrijkste voordeel van dit modelsysteem is dat deze transparante enkele laag van slechts 20 cellen kan overleven in vivo weefselkamer om de gepolariseerde membraan en lumen biogenese van een enkele cel te ontleden.
De technieken kunnen worden uitgebreid tot de analyse van andere C.Elegans-morfogenesefenotypen, maar hier is de focus op de analyse van membraanbiogenese, specifiek op apicale membraan- en lumenbiogenese. De procedures omvatten verfijnde beeldtechnieken bij vaste en levende dieren om membraandomeinen en subcellulaire componenten te onderscheiden en om lumenmorfogenesefenotypen in een C.elegans-darm te identificeren. Deze video over intestinale tubulogene is vergezeld door een video over tubulogene van de uitscheidingskanaal, wederzijds informatieve modellen waarbij de in vivo-analyse van gepolariseerde membraanbiogenese.
Met betrekking tot het labelen van de generatie van transgene dieren met fluorescerend gelabelde fusie-eiwitten voor live-beeldvorming wordt beschreven in de bijbehorende video over de analyse van tubulogene van het uitscheidingskanaal. Dergelijke dieren kunnen direct worden gebruikt in RNAi-experimenten. Derde generatie is typisch de eerste stap in deze combinatie van procedures.
Deze video begint met de alternatieve labelmethode antilichaamkleuring waarvoor dieren moeten worden gefixeerd. De verschillende labelprocedures kunnen worden gecombineerd met immunohistochemie die meestal wordt gebruikt voor de uiteindelijke beeldanalyse. Dit protocol heeft ook voorbeelden van darmspecifieke membraanmarkers, promotoren en andere bronnen die nuttig zijn voor beide labelprocedures.
Na het demonstreren van immunohistochemie gebruikt deze video een transgenische stam die het intestinale apicale membraan labelt met ERM-1 GFP om naar polariteit en lumenmorfogenesefenotypen te zoeken met behulp van RNAi. Bereid eerst een dia voor om de wormen te fixeren. Pipetteer 30 microliter poly-L-lysine op een dia en plaats vervolgens een tweede dia op de andere en laat ze samen vallen om de oplossing gelijkmatig op beide uit te smeren.
Pel nu de twee dia's uit elkaar en laat ze 30 minuten aan de lucht drogen. Plaats vervolgens een vlakke metalen blok in een container gevuld met vloeibare stikstof. Was de platen met M9-oplossing en breng ongeveer 10 microliter M9 met de wormen over.
Alternatief kunt u de wormen plukken en M9 aan de dia toevoegen. Zodra de wormen zijn overgebracht, laat u een dekglas kruislings op ze vallen zodat het dekglas over één rand hangt. Druk vervolgens voorzichtig op het dekglas zonder zijdelingse bewegingen te maken.
Breng nu onmiddellijk de dia over naar de metalen blok in vloeibare stikstof en laat het bevriezen. Na vijf minuten tilt u het dekglas eraf met behulp van de overhangende rand. Doe dit snel om de juiste scheuring van de cuticula te krijgen.
Dompel vervolgens de dia onder in een methanol-gevuld glazen Coplin-pot bij min 20 graden Celsius. Na vijf minuten brengt u de dia over naar een met aceton gevulde glazen Coplin-pot voor nog eens vijf minuten op dezelfde temperatuur. De dia's kunnen direct worden gekleurd of worden bewaard bij min 20 graden Celsius.
Verwijder de dia uit aceton en laat hem op kamertemperatuur aan de lucht drogen. Markeer vervolgens de locatie voor een cirkelvormige wand van petroleumgelei op de onderkant van de dia en bouw vervolgens de geleiwand op. Wrijf de gelei niet af tijdens deze procedure.
Bereid vervolgens een natte kamer in een bak met natte papieren handdoeken en plaats de dia op een rek binnenin. Er mag geen contact zijn tussen de handdoeken en de dia of tussen aangrenzende dia's. Pipetteer nu genoeg PBS in de geleirkring om het gebied te bedekken.
Plaats voorzichtig een pipettenpunt aan de rand van de cirkel en laat de vloeistof soepel over de wormen verspreiden. Sluit vervolgens het deksel en wacht vijf minuten. Na vijf minuten kantelt u de dia en aspireert langzaam het PBS terwijl u ervoor zorgt dat de wormen niet van de dia verdwijnen.
Vul vervolgens de geleirkring voorzichtig met vers bereide blokkeringsoplossing. En laat de dia gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Vervang na 15 minuten de blokkeringsoplossing door een blokkeringsoplossing die het primaire antilichaam bevat.
En incubeer de dia gedurende een nacht bij vier graden Celsius. Verwijder de volgende dag het primaire antilichaam en was de dia door drie keer het blokkeringsmiddel aan te brengen en te verwijderen. Laat elke bloktoepassing 10 minuten incuberen.
Voeg vervolgens het secundaire antilichaam toe, verdund in blokkeringsoplossing, en incubeer de dia een uur bij kamertemperatuur. Was vervolgens de dia twee keer met blokkeringsoplossing en vervolgens eenmaal met PBS. Verwijder vervolgens zoveel mogelijk PBS zonder het specimen te laten uitdrogen en verwijder voorzichtig de gelei rond het specimen.
Breng een druppel montagemedium aan op het specimen, gevolgd door een dekglas en een nagellakverzegelding. Bewaar de dia's vervolgens in het donker bij vier graden Celsius. Breng de RNAi-bibliotheekplaat over van min 80 graden Celsius naar dry ice.
Verwijder de afdichtingstape. En breng de clone van belang over naar selectieve auger. Streek de clone vervolgens uit en laat de bacteriën overnacht groeien.
Voordat u de bibliotheekplaat terugbrengt naar de vriezer van min 80 graden Celsius, brengt u nieuwe afdichtingstape aan. Inoculeer de volgende dag kolonies van de plaat in één milliliter aliquots van vloeibaar medium dat ampicilline bevat. Schud ze vervolgens ongeveer 14 uur bij 37 graden Celsius.
De volgende dag zaait u 20 microliter per clone op aparte RNAi-platen. Laat de platen drogen en induceer de RNAi-productie met een overnachtelijke incubatie
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het gebruik van de transparante darm van C. elegans als in vivo weefselkamer om de biogenese van het apicobasale membraan en het lumen te bestuderen. De beschreven methoden maken analyse van deze processen mogelijk op enkelcel- en subcellulair niveau tijdens multicellulaire tubulogenese.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- De darm van C. elegans bestaat uit een transparante enkelvoudige laag van 20 cellen.
- Dit modelsysteem is voordelig voor het bestuderen van de biogenese van gepolariseerde membranen.
- Inzicht in membraandomeinen en subcellulaire asymmetrieën is cruciaal tijdens de morfogenese.
- De studie richt zich op de biogenese van het apicale membraan en het lumen.
Doel van de studie
- Om de gepolariseerde membraanbiogenese en lumenmorfogenese in vivo te analyseren.
- Om kernvragen te beantwoorden over de vestiging en het behoud van membraandomeinen.
- Om technieken uit te breiden naar andere morfogenese-fenotypes van C. elegans.
Gebruikte methoden
- Standaard labeleringstechnieken.
- Genetische loss-of-function- en RNAi-benaderingen.
- Verfijnde beeldvormingstechnieken voor gefixeerde en levende dieren.
- Identificatie van lumenmorfogenese-fenotypes.
Belangrijkste Resultaten
- De bruikbaarheid van de darm van C. elegans voor in vivo analyse is aangetoond.
- De processen van gepolariseerde membraan- en lumenbiogenese zijn belicht.
- Er is inzicht geboden in de onderscheidende kenmerken van membraandomeinen en subcellulaire componenten.
- De relevantie van het model voor het bestuderen van morfogenese is gepresenteerd.
Conclusies
- De darm van C. elegans is een effectief model voor het bestuderen van membraanbiogenese.
- De methoden kunnen worden toegepast op diverse aspecten van de morfogenese van C. elegans.
- Dit onderzoek draagt bij aan het begrip van cellulaire polariteit en biogenese.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het darmmodel van C. elegans maakt in vivo analyse mogelijk van gepolariseerde membraanbiogenese en lumenmorfogenese met resolutie op enkelcelniveau, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase. Door apicale en basolaterale membraandomeinen en hun dynamiek tijdens de tubulogenese in kaart te brengen, biedt deze aanpak voorspellende zekerheid bij de validatie van targets voor epitheliale polariteitspaden. Dit ziekte-relevante systeem faciliteert de afstemming van translationele biomarkers en de continuïteit van preklinische modellen voor geconserveerde morfogenese-regulatoren.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen over epitheliale polariteit en lumenvormingsroutes mogelijk.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door functionele targetvalidatie met behulp van RNAi loss-of-function in een genetisch hanteerbaar systeem.
- Voorspellende waarde: Kwantificeert subcellulaire fenotypes om target-interactie en routemodulatie in ontwikkelende weefsels te beoordelen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream compound-screening door baseline-metrieken voor membraanpolarisatie vast te stellen.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare kwantitatieve resultaten via confocale beeldvorming van apicale membraanmarkers zoals ERM-1::GFP.
- Schaalbaarheid: Faciliteert hergebruik van het platform over meerdere genetische achtergronden en ontwikkelingsstadia voor consistente assay-prestaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Handhaaft de relevantie voor ziekten door conservering van mechanismen van epitheliale polariteit over verschillende soorten heen.
- Operationele waarde: Garandeert continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door lumenmorfogenese-fenotypes in de tijd te volgen.
- Risicobeperking: Informeert risicogestuurde beslissingen over verdere ontwikkeling door moleculaire perturbaties te koppelen aan structurele defecten in tubulaire netwerken.
Integratie van Pipeline en Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van het testen van doelwit-hypothesen via lead-identificatie tot preklinische validatie, in het bijzonder voor doelwitten die membraanbiogenese en tubulogenese reguleren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door apicale-basolaterale membraanasymmetrie in vivo te visualiseren.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde kleurings- en imagingprotocollen die subcellulaire compartimenten onderscheiden.
- Analytics: Maakt kwantitatieve vergelijking van defecten in de lumenmorfogenese mogelijk over verschillende genetische condities heen, met behulp van fluorescentie-intensiteit en ruimtelijke distributiemetrieken.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan op preklinische continuïteit door geconserveerde tubulogenese-processen te modelleren die relevant zijn voor workflows in organoïde- en weefseltechniek.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbare capaciteit voor het screenen van polariteitsregulatoren in meerdere projecten, dankzij de genetische toegankelijkheid en fenotypische helderheid.
Operationele en Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende zekerheid bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in membranen-biogenespaden te verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid via antilichamenkleuring van vaste monsters en gedefinieerde beeldparameters.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege detectie mogelijk te maken van polariteitsdefecten die correleren met risico's op ontwikkelingstoxiciteit.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritisering door de fenotypische ernst van lumenvorming te kwantificeren voor targetranking.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van C. elegans, RNAi-voerassays en fluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van de infrastructuur voor fixatie, antilichaamvalidatie en confocale- of DIC-beeldvormingssystemen.
- Necessiteert cross-team standaardisatie van kleuringsprotocollen en criteria voor fenotype-scoring.
- Omvat aanpassingen bij uitbreiding naar andere weefsels of mutante achtergronden met variabele penetrantie.
- Beperkt door de behoefte aan transgene stammen of specifieke markers voor bepaalde subcellular compartimenten, zoals vermeld in het protocol.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Introduction to the Accompanying Publication
2:47
Nematode Fixation
4:19
Nematode Antibody Staining
6:33
Applying RNAi to Nematodes Using a Feeding Protocol
7:57
Analyzing Phenotypes Using Fluorescence Dissecting Microscopy
8:41
Analyzing Phenotypes Using Confocal Microscopy
10:14
Results: Immunohistochemistry, RNAi and Microscopic Analysis of Intestinal Apical membrane and Lumen Morphogenesis
11:45
Conclusion
