Stereological raming van de Dopaminerge Neuron nummer in de muis Substantia Nigra met behulp van de optische Fractionator en standaard microscopie apparatuur
1 september 2017
Dit werk presenteert een stapsgewijze protocol voor de onbevooroordeelde stereological schatting van Dopaminerge neuronale cel nummers in de muis substantia nigra met behulp van standaard microscopie apparatuur (dat wil zeggen, een lichte Microscoop, een tabel van de gemotoriseerde object (x, y, z vliegtuig), en publiek domein-software voor digitale beeldanalyse.
Het algemene doel van dit protocol is om de ontwerpgebaseerde stereologische schatting van het aantal dopaminerge cellen in de muis SN te beschrijven met behulp van standaard microscoopapparatuur. Deze methode is nuttig om het aantal dopaminerge neuronen in de muis substantia nigra te schatten voor preklinisch Parkinson-ziekteonderzoek met behulp van onbevooroordeelde stereologie op basis van ontwerp. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze kan worden uitgevoerd met standaard microscoopapparatuur zonder dat er een commercieel verkrijgbare volledige stereologie-setup nodig is.
Demonstratie van de procedure zal worden gedaan door Louisa Friez, een technicus uit mijn laboratorium. Begin door een met paraformaldehyde gefixeerde muizenhersenen in een hersenmatrix te plaatsen en een snede te maken plus 0,74 millimeter vanaf bregma. Breng het caudale deel van de hersenen inclusief de SN over in 4% PFA in 0,1 molair en fixeer een nacht bij vier graden Celsius.
De volgende dag vervangt u de PFA voor 30% sucrose in 0,1 molair PBS en incubeert u nog twee dagen bij vier graden Celsius om het monster te cryo beschermen. Nadat de hersenen na twee dagen in de sucrose zijn gezonken, plaatst u het weefsel in een Cryomold gevuld met een optimaal snijtemperatuurcompound en bevriest u het weefsel langzaam in vloeibare drooggekoelde isopentaan. Gebruik een cryostat om serieel 30 micron cryo-secties in het coronale vlak te snijden.
Markeer het rechter halfrond door een klein gaatje te prikken in het bovenste gebied van de hersenstam. Verzamel vier reeksen secties beginnend bij min 2,46 millimeter vanaf bregma en eindigend bij 4,04 millimeter vanaf bregma. Breng elke reeks secties over in een buis gevuld met cryoprotectant en bewaar bij min 20 graden Celsius.
Maak digitale afbeeldingen van tyrosinehydroxylase immunohistochemisch gekleurde SN-secties met beeldvormingssoftware gekoppeld aan een microscoop. Begin met het bepalen van de werkelijke montage en dikte van de secties op drie willekeurig geselecteerde telplaatsen per sectie. Klik eerst op view top offset om de bovenkant van de sectie te definiëren.
Klik vervolgens op stop view top. Klik daarna op view bottom offset en vervolgens op stop view bottom. Schrijf de dikte van de sectie op.
Bereken de wachtzone door drie micron van de topoffset af te trekken en typ het resultaat in het top offset vak. Trek vervolgens de 13 micron hoogte van de optische dissector af van het top offset nummer en typ het resultaat in het bottom offset vak. Selecteer de volgende parameters, stappen 14, grootte 1,00.
Selecteer de map om het bestand op te slaan. Klik op sequence om de acquisitie te starten. Nadat de beelden zijn verkregen, klikt u op processing en selecteert u de volgende parameters, alle vlakken van sequence, montage en de fast en stitching vakken met een beeldoverlap van 10% Begin met het samenvoegen van de beelden door op start te klikken.
Dit genereert stackafbeeldingen voor analyse. Om te beginnen, opent u het beeld door op bestand en openen te klikken. Stel de beeldschaal in door de analyse en set scale opdracht te gebruiken.
Verander vanaf dit punt de gedefinieerde grootte van pixels naar microns. Selecteer de plugins dan raster dan rastertype lijnen commando om willekeurig een raster in te voegen. Vink het vakje willekeurig offset aan.
Definieer de grootte van een vierkant binnen het raster als 130 micron door 130 micron om gelijk te zijn aan 16.900 vierkante microns. Verander het beeldtype van 16-bit naar RGB-kleur door op beeld te klikken dan type dan RGB-kleur. Zoek de substantia nigra pars compacta.
Omcirkel het gebied met het penseelgereedschap met een penseelbreedte van 11. Ongedaan maken van de set scale opdracht door op analyse te klikken dan set scale dan op verwijderen schaal om in pixels te berekenen in plaats van microns. Maak een screenshot, sla het beeldbestand op en open het nieuwe bestand met ImageJ.
Selecteer penseel en een penseelbreedte van 25. Markeer elk rastervierkant dat contact maakt met de SN voor plaatsing van een optische dissector. Selecteer een rastervierkant dat delen van de SN omvat. Meet de bovenste linkerhoek van het vierkant met de cursor in ImageJ om de start x en y coördinaten te definiëren.
Selecteer het spreadsheet-sjabloon met de titel optische dissector positie en bereken de optische dissector positie. Schat vervolgens het celgetal in met behulp van de celtellingsspreadsheet zoals beschreven in het schriftelijke deel van het protocol. Deze laagvermogen afbeelding toont een sectie van muizenhersenen na TH-kleuring voor dopaminerge neuronen.
Een hogere vergroting toont TH-positieve dopaminerge neuronen. Het inzetstuk toont het omkaderd gebied met verhoogde vergroting. Deze afbeelding toont een reeks TH-gekleurde SN-secties die de hele muizen SN van rostrale naar caudale bedekken.
Elke sectie is gescheiden van de opeenvolgende sectie door 120 micron. Het aantal TH-positieve neuronen in de rechter en linker muis SN werd geschat met behulp van de methode die in deze video wordt getoond en met behulp van een commercieel verkrijgbaar stereologiesysteem. Zoals hier te zien is, resulteerden beide methoden in vergelijkbare celtellingen en er waren geen significante verschillen tussen de datasets.
Vergeet niet dat het werken met paraformaldehyde uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen zoals beschermende handschoenen altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u onbevooroordeelde stereologische schatting van het aantal dopaminerge neuronen in de muis substantia nigra kunt uitvoeren met behulp van de optische fractiemethode en standaard microscoopapparatuur.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor de onbevooroordeelde stereologische schatting van het aantal dopaminerge neuronen in de substantia nigra van de muis met behulp van standaard microscopie-instrumenten. De methode is bedoeld om preklinisch onderzoek naar de ziekte van Parkinson te faciliteren door een betrouwbare benadering voor celkwantificering te bieden zonder dat er gespecialiseerde stereologische systemen nodig zijn.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Onderzoek naar de ziekte van Parkinson
Achtergrond
- Dopaminerge neuronen zijn cruciaal voor de motorische controle.
- De substantia nigra is een sleutelgebied dat wordt aangetast bij de ziekte van Parkinson.
- Onbevooroordeelde stereologie biedt een robuuste kwantitatieve methode.
- Standaard microscopieapparatuur maakt de techniek toegankelijk.
Doel van de studie
- Het vaststellen van een stapsgewijs protocol voor neuronale kwantificering.
- Het toepassen van design-based unbiased stereologie in levende muismodellen.
- Het mogelijk maken van preklinische studies naar het verlies van dopaminerge neuronen.
Gebruikte methoden
- Standaardmicroscopie, inclusief lichtmicroscopie en software voor digitale beeldanalyse.
- De substantia nigra van de muis als biologisch model.
- Gedetailleerde fixatie, cryoprotectie en coupesnijden van hersenweefsel van de muis.
- Digitale beeldvorming en specifieke immunohistochemische technieken.
- Zorgvuldige metingen en berekeningen om het aantal neuronen te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- Aantoonbare nauwkeurige schatting van dopaminerge neuronen in de SN.
- Zowel standaard- als geavanceerde methoden leverden vergelijkbare neuronenaantallen op.
- Belangrijke nadruk op de betrouwbaarheid van de methode met gebruik van standaardinstrumenten.
Conclusies
- Deze studie presenteert een haalbare benadering voor het kwantificeren van neuronale populaties in onderzoek.
- Het vergroot het begrip van het verlies van neuronen bij de ziekte van Parkinson.
- Maakt gebruik van readily beschikbare instrumenten, wat een bredere toepassing in neurowetenschappelijke studies bevordert.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Nauwkeurige kwantificering van het verlies van dopaminerge neuronen in de substantia nigra is een cruciaal eindpunt in preklinisch onderzoek naar de ziekte van Parkinson, wat direct bijdraagt aan targetvalidatie en het mechanistisch verminderen van risico's bij neuroprotectieve strategieën. Dit protocol maakt betrouwbare, onbevooroordeelde stereologische schatting mogelijk met standaard microscopieapparatuur, waardoor de afhankelijkheid van gespecialiseerde stereologiesystemen wordt verminderd en de toegankelijkheid voor discovery biology-workflows wordt vergroot. Door kwantitatieve, reproduceerbare gegevens van celtellingen te leveren, ondersteunt deze methode het voorspellend vertrouwen bij het testen van target-hypotheses in een vroeg stadium en bij beslissingen over portfolioprioritering.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door een onbevooroordeelde kwantificering van het overleven van dopaminerge neuronen in preklinische modellen van de ziekte van Parkinson te bieden.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie via design-gebaseerde stereologie, waardoor waarnemersbias en technische variabiliteit in target-engagementstudies worden geminimaliseerd.
- Voorspellende waarde: Genereert kwantitatieve gegevens over het aantal neuronen, wat helpt bij het beoordelen van de effectiviteit van targetmodulatie en bij het informeren van go/no-go-beslissingen in de vroege ontdekkingsfase.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve histologische resultaten die geschikt zijn voor het valideren van screening-hits die gericht zijn op het behoud van de integriteit van dopaminerge neuronen.
- Reproduceerbaarheid: Levert consistente celgetalsmetingen over verschillende secties en dieren, wat de standaardisatie van de assay ondersteunt voor de daaropvolgende evaluatie van verbindingen.
- Schaalbaarheid: Compatibel met standaard microscopie en software voor beeldanalyse, waardoor een bredere adoptie op verschillende discovery-platforms mogelijk is zonder gespecialiseerde hardware.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Modelleert direct het verlies van dopaminerge neuronen in de substantia nigra, een kernkenmerk van de pathologie van de ziekte van Parkinson, wat de translationele validiteit verhoogt.
- Preklinische continuïteit: Biedt een kwantitatieve brug van discovery-screening naar preklinische validatie door data te leveren die vergelijkbaar zijn met commerciële stereologiesystemen.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Maakt objectieve, datagestuurde beslissingen over de voortgang van verbindingen mogelijk op basis van statistisch robuuste metrieken voor het overleven van neuronen.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van hypothesetesting van targets via lead-identificatie tot preklinische evaluatie van de werkzaamheid, en biedt een kwantitatieve histologische readout die bijdraagt aan het mechanistische begrip en het vertrouwen in het target.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door dopaminerge neuronpopulaties te kwantificeren als functionele readout van padmodulatie in preklinische modellen.
- Screening: Genereert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten op basis van imaging die een betrouwbare vergelijking mogelijk maken van de effecten van verbindingen op het overleven van neuronen.
- Analytics: Levert numerieke celteldata en statistische vergelijkbaarheid tussen experimentele groepen, wat datagestuurde vergelijkingen van condities faciliteert.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij de pathologie van de ziekte van Parkinson door neuronverlies te meten in een ziekterelevante hersenregio, wat preklinische validatie in lijn met biomarkers ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerde, toegankelijke stereologie-workflow die kan worden toegepast over meerdere neuroscience discovery-programma's zonder dat kapitaalintensieve apparatuur vereist is.
Operationele & Zakelijke Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit te verminderen middels onbevooroordeelde, op ontwerp gebaseerde stereologische kwantificatie.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie tussen laboratoria door gebruik te maken van algemeen beschikbare microscopie- en beeldanalyse-instrumenten.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door de behoefte aan gespecialiseerde stereologiesystemen weg te nemen, terwijl de vergelijkbaarheid van gegevens met commerciële platforms behouden blijft.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van preklinische kandidaten mogelijk op basis van kwantitatieve, histologisch gevalideerde gegevens over het behoud van dopaminerge neuronen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in histologie, immunohistochemie en stereologische principes voor een nauwkeurige weefselpreparatie en regio-identificatie.
- Afhankelijk van gemotoriseerde microscopieapparatuur met z-asbesturing en software voor beeldstitching voor systematische sectieanalyse.
- Vereist cross-team standaardisatie van kleuringsprotocollen, sectiedikte en telregels om reproduceerbaarheid tussen verschillende locaties te waarborgen.
- Aanpassing aan andere hersenregio's of neurontypen kan aanpassingen vereisen van de kleuringsparameters, rastergrootte en de afmetingen van de optische dissector.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van de sectiekwaliteit en de noodzaak van een rigoureuze training om de telnauwkeurigheid te handhaven en samplingbias te voorkomen.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
- Wetenschappelijke waarde: Replicatie in meerdere secties en dieren houdt rekening met biologische en technische variabiliteit, waardoor de zekerheid toeneemt dat de waargenomen neuronenaantallen ware experimentele effecten weerspiegelen in plaats van bemonsteringsartefacten.
- Operationele waarde: Consistente bemonsteringsprotocollen verminderen de variabiliteit tussen operators en ondersteunen standaardisatie tussen laboratoria, wat essentieel is voor ontdekkingsprojecten op meerdere locaties.
