Horizontale gehele berging: Een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel dwarsdoorsneden van de huid
August 2nd, 2017
Dit werk presenteert een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel doorsnede analyse die de volledige exploitatie van confocale beeldvormingsmodaliteiten mogelijk maakt. Dit protocol behoudt de antigeniciteit en vertegenwoordigt een robuust systeem om huidhistologie en mogelijk andere weefstypen te analyseren.
Het algemene doel van dit histologische en beeldvormingsprotocol is om een robuust systeem te presenteren dat de epitole antigeniciteit en structurele integriteit van de huid behoudt, wat de volledige benutting van confocale beeldvormingsmodaliteiten mogelijk maakt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen waarbij er een vereiste is om de aard van elk type cel binnen een complexe driedimensionale weefselaarchitectuur te onderzoeken. Het grote voordeel van deze techniek in vergelijking met standaard histologische technieken is dat het robuust en gemakkelijk uit te voeren is.
Bovendien complementeert het protocol perfect de driedimensionale analyse in confocale microscopie. Begin met het trimmen van huid die geoogst is van de dorsale mediale regio van een muis in rechthoekige stukken. Elk stuk moet zo groot zijn dat het past in de bodem van een cryomold.
Een gebied van een vierkante centimeter dorsale huid dat past in een cryomold van 22 millimeter bij 30 millimeter bij 20 millimeter wordt hier gedemonstreerd. Na het fixeren, drukt u de gewassen huid naar de bodem van de met OCT gevulde mal zodat deze vlak ligt tegen de bodem. Markeer de oriëntatie van de haarfollikels op de cryomold, omdat dit de oriëntatie van de cryostaatsnede bepaalt.
Breng de cryoblokken over naar een metalen plaat in een min 80 graden vriezer om zweven en dislocatie van het weefsel te voorkomen. Controleer het bevriezingsproces om de oriëntatie van de huid aan de bodem van de cryomold te behouden, omdat onzichtbare luchtbellen ervoor kunnen zorgen dat de huid naar het oppervlak van de cryomold stijgt. Begin met het fixeren van een bevroren cryoblok op de trap van een cryostaat met de oriëntatie van de haarfollikels, zoals aangegeven op de cryomold langs het snedevlak.
Juiste aanpassing van de exacte oriëntatie van de haarfollikels op de cryostaat is cruciaal, aangezien deze stap het snedevlak bepaalt dat huidsneden genereert met de volledige lengte van haarfollikels intact. Gebruik de cryostaat om een sectie van 100 micron te snijden. Grijp het OCT rond het ingebedde stuk huid met pincetten en breng de sectie over van de cryostaat naar de 100 millimeter cultuur gevuld met PBS.
Bij kamertemperatuur zal de PBS het OCT oplossen, waardoor huidsneden achterblijven die gemakkelijk te hanteren zijn met pincetten. Na het snijden, gebruik pincetten om de zwevende huidsneden over te brengen naar de put van een 12-putsplaat die 2,5 milliliter PBS bevat. Begin met immunofluorescente markering door eerst 500 microliter PB-buffer toe te voegen aan gelabelde 1,5 milliliter microcentrifugebuizen.
Gebruik voorzichtig pincetten om de huidsneden van de 12-putsplaat over te brengen naar de buizen voor blokkering. Zorg ervoor dat alle huidsneden volledig ondergedompeld zijn. Plaats de microcentrifugebuizen op een slingerende wiegelaar bij 10 oscillaties per minuut of minder, gedurende één uur bij kamertemperatuur.
Label aparte 1,5 milliliter microcentrifugebuizen voor elke huidsnede en voeg 500 microliter PB-buffer toe met de juiste hoeveelheid primaire antilichaam. Na één uur blokkeren, breng de huidsneden over naar de vers bereide buizen met de antilichamen. Incubeer de sneden bij vier graden Celsius een nacht lang op een lage snelheid op een wiegelaar.
De volgende dag brengt u de sneden over naar 1,5 milliliter microcentrifugebuizen die 500 microliter PBS bevatten en wast u gedurende één uur bij kamertemperatuur op een wiegelaar. Breng vervolgens de sneden over naar afzonderlijke 1,5 milliliter microcentrifugebuizen die 500 microliter PB-buffer bevatten met de juiste concentratie secundaire antilichamen en DAPI. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende één uur met wiegelen, indien gewenst, kunnen monsters tot vier dagen worden bewaard bij vier graden Celsius tot verdere verwerking.
Voor het beeldvormen brengt u de huidsneden over naar afzonderlijke microcentrifugebuizen die 500 microliter PBS bevatten om de secundaire antilichamen en DAPI te wassen. Plaats vervolgens een 22 milliliter bij 50 milliliter dekglas op een donkere achtergrond onder een dissectiescoop. Gebruik vervolgens een pipet van 1.000 microliter met het uiteinde van de punt afgesneden, om één druppel van 100% glycerol op het dekglas toe te voegen.
Breng de huidsnede vanuit de microcentrifugebuis over op de glyceroldruppel. Gebruik vervolgens, terwijl u door de dissectiescoop kijkt, puntige pincetten om de huidsneden die opgerold zijn voorzichtig uit te winden door ze terug te brengen naar hun natuurlijke vorm terwijl ze zweven in glycerol. Forceer de onnatuurlijke rechttrekking van de snede niet, omdat dit schade aan het weefsel kan veroorzaken.
Zodra de volledige lengte van de sectie goed is georiënteerd en afgeplat op het dekglas. Monteer het weefsel op een gewone microscoopslide, deze stap zal de huidsnede verder rechttrekken. Beeld de in glycerol gemonteerde huidsneden binnen de volgende twee dagen af.
Deze afbeelding toont een 10 micron dikke klassiek verkregen huidcryosnede gelabeld met integrine alfa zes en integrine alfa acht, om het epidermale compartiment en respectievelijk de directoriële pili-spieren te visualiseren. Deze 100 micron dikke 3D-weefseldoorsnede werd op dezelfde manier gelabeld. De getoonde afbeelding is de maximale projecties van een grote z-stack.
Detail uit beide afbeeldingen wordt hier naast elkaar vergeleken, in de klassieke bevroren secties, werden de meeste haarfollikels die met integrine alfa zes werden gevisualiseerd niet langs de volledige lengte gesneden, waardoor er voornamelijk onvolledige haarfollikels per sectie ontstonden, in vergelijking met horizontale gehele montages. Intact haarfollikels en intacte arrector pili-spieren werden gequantificeerd in zowel de klassieke als de horizontale gehele montagesecties. Eén sectie voor biologische replica werd gequantificeerd, zoals hier te zien is, de gehele montagesectie heeft een hoger percentage intacte follikels en arrector pili-spieren.
Eenmaal onder de knie, kan deze cryosectiebereidingstechniek worden uitgevoerd met snel
Overzicht
Dit werk presenteert een nieuwe verwerkings- en beeldvormingsprotocol voor dikke, driedimensionale weefseldoorsnedeanalyse die de volledige benutting van confocale beeldvormingsmodaliteiten mogelijk maakt. Dit protocol behoudt antigeniciteit en vertegenwoordigt een robuust systeem om huidhistologie en mogelijk andere weefselsoorten te analyseren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Histologie
- Beeldvormingstechnieken
- Confocale microscopie
Achtergrond
- Standaard histologische technieken behouden mogelijk niet de structurele integriteit van weefsels.
- Confocale beeldvorming maakt gedetailleerde driedimensionale analyse mogelijk.
- Robuuste protocollen zijn nodig voor effectieve weefselanalyse.
- Deze studie richt zich op huidweefsel als model.
Doel van de studie
- Om een protocol te ontwikkelen dat de antigeniciteit en structurele integriteit van de huid behoudt.
- Om de analyse van complexe driedimensionale weefselarchitectuur te vergemakkelijken.
- Om bestaande histologische technieken te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Trimmen en fixeren van huidmonsters van muizen.
- Gebruik van een cryostaat voor het snijden van weefsel in 100 micron plakjes.
- Immunoflurescente markering met primaire en secundaire antilichamen.
- Beeldvorming van weefselsecties met behulp van confocale microscopie.
Belangrijkste resultaten
- Het nieuwe protocol maakt intacte visualisatie van haarzakjes en arrector pili-spieren mogelijk.
- Hele mount-secties tonen een hoger aandeel van intacte structuren in vergelijking met klassieke secties.
- De techniek kan snel worden uitgevoerd, waarbij meer dan 15 secties per minuut worden bereikt.
- Demonstreert de effectiviteit van driedimensionale analyse in histologie.
Conclusies
- Dit protocol is een belangrijke vooruitgang in weefselverwerking voor confocale beeldvorming.
- Het verbetert de mogelijkheid om complexe weefselstructuren te bestuderen.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitbreiden van huid naar andere weefselsoorten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Robust three-dimensional tissue imaging is critical for accurate target validation and mechanistic de-risking in early-stage dermatological and tissue biology research. The horizontal whole mount protocol enables high-fidelity visualization of intact skin microarchitecture, supporting predictive confidence in phenotypic and cellular analyses. This capability strengthens translational continuity from discovery through preclinical model development in skin and potentially other tissue systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular and structural targets within preserved three-dimensional tissue architecture.
- Supports biological de-risking by maintaining antigenicity and structural integrity for functional target validation.
- Improves predictive confidence in the assessment of mesenchymal and epithelial cell populations.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated thick tissue sections for downstream immunofluorescence and confocal imaging workflows.
- Enhances assay reproducibility and standardization by preserving intact tissue structures across samples.
- Provides quantitative outputs for intact hair follicles and arrector pili muscles, enabling reliable comparative analyses.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant tissue models by preserving complex skin microenvironments for translational biomarker studies.
- Supports continuity from discovery imaging to preclinical validation of tissue-based endpoints.
- Reduces risk of artifactual findings by maintaining native tissue context in thick sections.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, enabling high-content imaging and quantitative analysis of tissue architecture for target validation and phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling visualization of intact cellular structures.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs suitable for comparative studies and assay development.
- Analytics: Provides measurable endpoints such as intact follicle and muscle counts for statistical analysis.
- Translational Research: Maintains disease-relevant tissue context for biomarker alignment and preclinical model validation.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable protocol adaptable to various tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in tissue-based studies.
- Operational Value: Streamlines sample preparation, enhances reproducibility, and supports high-throughput sectioning.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing robust, quantitative imaging data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and models based on high-quality tissue analysis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning and immunofluorescent labeling for optimal results.
- Demands access to confocal microscopy and compatible analytical infrastructure.
- Benefits from cross-team standardization of sectioning and imaging protocols.
- Adaptable to other tissues with similar structural and antigenic preservation needs.
- Section thickness and orientation must be carefully controlled to ensure data consistency.
