Name: Horizontale gehele berging: Een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel dwarsdoorsneden van de huid (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Leer een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefseldwarsdoorsneden van muizenhuid. Deze methode behoudt antigeniteit en structurele integriteit voor confocale microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs erkennen sponsoring van Thermo-Fisher Scientific en bedanken het Nikon Imaging Center bij Kings College London voor ondersteuning tijdens confocal image acquisition.

Alle dierproeven werden onderworpen aan lokale ethische goedkeuring en uitgevoerd onder de voorwaarden van een Britse regeringskantoor. 1. Skin Harvest en Cryopreservation <ol><li> Voorbereidende werkzaamheden. <ol><li> Bereid één 100 mm kweekschotel met 25 ml 4% PFA en twee 100 mm kweekgerechten met 25 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Vul rechthoekige afscheidende cryomolds met tweederde met optimale snijtemperatuurverbinding (OCT). </li><li> Plaats een metalen plaat waarop de cryoblocks in een latere stap kunnen worden geplaatst in de -80 ° C vriezer. </li></ol></li><li> Huid oogsten, fixatie en cryopreservering. <ol><li> Knip het dorsale gebied van de dierencadaver met een droge elektrische scheerapparaat. OPMERKING: In dit voorbeeld werden postnatale dag 21 wildtype muizen gebruikt. </li><li> Oog de gebieden van belang op de huid op. OPMERKING: Het dorsomediale gebied van de muishuid ( <stronG class = &quot;xfig&quot;&gt; Figuur 1a) bevat het hoogste percentage haarfollikels dat evenwijdig is gespannen en uitgelijnd, waardoor optimale oriëntatie voor snede mogelijk is. Het verwijderen van onderliggende niet-dermale weefsels is niet nodig maar kan indien nodig worden uitgevoerd. </li><li> Trim de geoogste huid in rechthoekige stukken van passende grootte om in de bodem van de cryomold te passen, waarbij rekening wordt gehouden met de richtinggroei van de haarfollikelkoren. OPMERKING: Kleiner huidschijven kunnen makkelijker zijn voor beginners, aangezien ze minder waarschijnlijk zijn tijdens het incubatie- en montageproces. Het hier getoonde voorbeeld is een gebied van 1 cm 2 dorsale huid, die past in een 22 x 30 x 20 mm cryomold ( figuur 2a ). </li><li> Bevestig de huid bij kamertemperatuur in 25 ml 4% PFA gedurende 10-30 minuten, afhankelijk van de dikte van de huidmonsters ( Figuur 1b ). </li><li> Was de huidmonsters twee keer in 25 ml PBSVoor tenminste 5 minuten elk ( figuur 1b ). </li><li> Druppel de huidmonsters op een papieren handdoek om het weefsel van overtollig PBS zorgvuldig af te voeren, wat kan resulteren in kristallisatie tijdens het vriesproces en kan de cryosectie resultaten beïnvloeden. OPMERKING: een standaard sucrose gradiënt is niet nodig. Dit kan echter ook in het protocol worden opgenomen in de discretie van de gebruiker. </li><li> Wees bewust van de oriëntatie van de haarfollikels voor elk huidmonster. Gebruik een dissectiemicroscoop voor visuele bijstand (vooral iemand die het protocol voor het eerst uitvoert). Steek het huidmonster in de OCT-gevulde cryomold en evenwicht alle gebieden van de huid met OCT door luchtbellen aan de bovenkant van het geknipt haar te verwijderen door middel van tang ( figuren 2a en 2b ). </li><li> Duw de huid naar de bodem van het OCT gevulde blok, zodat het in de bodem ligt. OPMERKING: De huid kan in elke richting worden georiënteerd, aS lang als de korrel van de haarfollikel wordt genoteerd voor de juiste snijprocedures. De cryomolds worden opnieuw georiënteerd wanneer de blokken aan de cryostat worden gekoppeld voor cryosectie. Merk de hair follicle oriëntatie op de cryomold, aangezien deze stap de latere oriëntatie van de cryostat snede bepaalt. </li><li> Breng de cryoblocks op de metalen plaat in de -80 ° C vriezer om zwevend en ontwrichting van het weefsel te vermijden. </li><li> Bewaar het vriesproces om de oriëntatie van de huid onder de cryomold te behouden, aangezien onzichtbare luchtbellen de huid tot het oppervlak van de cryomold kunnen opkomen. OPMERKING: Cryomolds met bevroren weefsel kunnen langer dan een jaar bij -80 ° C worden opgeslagen en kunnen worden hergebruikt voor extra afdelingen. </li></ol></li></ol><img alt="Figuur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig1.jpg" /> Figuur 1. Oogst en fixatie van de muishuid. </strong&gt; (A) Huidweefsel werd geoogst uit de dorsomediale gebied van het dier kadaver. Haarfollikels in deze regio zijn evenwijdig geplaatst en uitgelijnd en zorgen dus voor een optimale oriëntatie tijdens het snijden, zoals aangegeven door de pijlen. ( B ) Na het knippen van vierkanten van een passende grootte die in de cryomold past, werd het huidweefsel gedurende 15 minuten in 4% PFA gefixeerd en gedurende 5 minuten twee keer in PBS gewassen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 2. Dikte Weefsel Doorsnede <ol><li> Voorbereiding en weefsel oriëntatie om op de cryostat te monteren. <ol><li> Bereid een 100 mm kweekschotel met 15 ml PBS. Plaats het op een gemakkelijk toegankelijke plaats op de cryostat. Voer daarnaast een 12-putjesplaat op met 2,5 ml PBS per putje; Label volgens de monsters voor de lange termijn opslag van de zeeCtions bij 4 ° C. Gebruik pincet om de secties te behandelen. </li><li> Stel de temperatuur van de cryostat in op -20 ° C. OPMERKING: de temperatuur kan de doorsnede beïnvloeden, maar een goede gids moet beginnen bij -20 ° C. </li><li> Om afdelingen ongeveer twee haarfollikels dik te maken, pas de cryostaat aan om 150 μm dik te snijden. OPMERKING: De dikte van de sectie kan worden gevarieerd, afhankelijk van de behoeften van de gebruiker en de beperkingen van de microscoop die gebruikt wordt voor analyse. OPMERKING: De oriëntatie van het monster is van cruciaal belang voor het verkrijgen van huiddelen met haarfollikels in de juiste oriëntatie. Dit wordt bereikt door goed op het cryostatblok te monteren. Zorg ervoor dat het deelvlak parallel is met de haarfollikelrichting ( Figuur 2c ). Zoals eerder vermeld, is de juiste oriëntatie van het snijvlak in het huidmonster een cruciale stap om de kwaliteit van de afbeeldingen te bepalen die worden verworven inEen latere stap. </li></ol></li></ol><img alt="Figuur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig2.jpg" /> Figuur 2. Inbedding, cryopreservering en sectie. (A) Het markeren van de haarfollikelrichting (HF) op de cryomold, aangegeven door de zwarte pijlen, is belangrijk voor een goede oriëntatie tijdens cryosectie. ( B ) Het deelvlak moet worden afgestemd op de haarfollikeloriëntatie om secties te genereren waarin de volledige lengte van de haarfollikels intact blijft. ( C ) Afdelingen werden gesneden per de hair follicle orientatie die door de zwarte pijlen op de cryomold. ( D ) De dikke weefsel dwarsdoorsneden werden verzameld met metalen tang en ( e ) overgebracht in een 100 mm kweekschotel die 1x PBS bevatte. ( F ) Bij kamertemperatuur lost de PBS de OC weg.T. Verbinding die de dikke weefsel dwarsdoorsneden omringt, zoals aangegeven door de witte pijlen. De secties drijven dan vrij in de PBS. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="2"><li> Cryosectioning. <ol><li> Snijd een sectie met behulp van de cryostat. Gebruik pincet om de OCT te verzamelen die het ingebedde stukje huid bevat ( Figuur 2d ). OPMERKING: gebruik een cryostaat die de onafhankelijke beweging en aanpassing mogelijk maakt langs de axes X, Y en Z voor een optimale positionering van het monster. Dit zorgt voor het genereren van ideaal uitgelijste weefsel dwarsdoorsneden. </li><li> Breng het gedeelte uit de cryostaat over in de 100 mm kweekschaal, gevuld met PBS, en ga verder met de volgende plak. Verzamel de monsters niet op een dia ( Figuur 2e ). OPMERKING: bij kamertemperatuur zal de PBS oplossenDe OCT, waardoor de plakken die makkelijk te hanteren zijn met handvaten ( figuur 2f ) verlaten. OPMERKING: Verse PBS kan nodig zijn in de 100 mm kweekschotel na het oplossen van veel weefselsecties 100 μm dik en kunnen dienovereenkomstig worden gewijzigd. </li><li> Gebruik pincet om de drijvende huidafdelingen over te brengen naar de goed gemarkeerde put in een 12-vel plaat gevuld met 2,5 ml PBS ( Figuur 3a , links). OPMERKING: bij 4 ° C kunnen de monsters gedurende minstens twee dagen worden opgeslagen. Voor de langdurige opslag van OCT-blokken na het snijden van de huid, sluit het snijvlak met een druppel verse OCT. Na het vriezen van de OCT-druppel, draai het gebruikte OCT-blok in parafilm en plaats deze terug in de -80 ° C diepvriezer . </li></ol></li></ol> 3. Immunofluorescente etikettering. <ol><li> Bereid de PB buffer (PBS aangevuld met 0,5% schuimmelkpoeder, 0,25% vishuidgelatine en 0,5% Triton X-100) bij leasT 2 uur van tevoren, zoals eerder beschreven 5 . OPMERKING: Natriumazide kan worden toegevoegd aan PB buffer voor het behoud van antilichamen voor het herhaalde gebruik van de kleurbuffer. </li><li> Meng 1,5 ml microcentrifugebuizen en voeg 500 μL PB buffer per buis toe. Gebruik pincet zorgvuldig om de huidplakken van de PBS in aparte buizen over te brengen die de PB-buffer bevatten om te blokkeren ( Figuur 3a , rechts). Zorg ervoor dat alle huidplakken volledig ondergedompeld zijn. Plaats de microcentrifugebuizen op een zaagzaagrooster bij snelheden van niet meer dan 10 oscillaties per minuut, die de weefselintegriteit niet moeten verstoren gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat de snelheid niet meer dan 10 oscillaties per minuut overschrijdt op de zaagknijper, aangezien het in beweging komt. <ol><li> Terwijl het mogelijk is om meer dan een snij per microcentrifugebuis toe te voegen, om antilichamen op te slaan, plaatst u slechts een snij per buis. Gebruik een volume om het antilichaamgebruik te verminderenVan 250 μl. OPMERKING: vervang eventueel microcentrifugebuizen met bijvoorbeeld 96-putjesplaten. Echter, de plaatsing van de dikke weefsel dwarsdoorsneden in 1,5 ml microcentrifuge buizen zorgt voor de meest effectieve antilichaam penetratie in het weefsel als gevolg van de verhoogde vloeistof verstoring. </li></ol></li><li> Label aparte 1,5 ml microcentrifugebuizen voor elke huidschijf en voeg 500 μl PB buffer en de geschikte hoeveelheid primaire antilichaam toe. Na 1 uur blokkeren, verplaats de huidplakken in de vers bereide buizen die de antilichamen bevatten. Incubeer de plakjes bij 4 ° C overnacht. OPMERKING: In dit voorbeeld werden de volgende primaire antilichamen gebruikt: FITC rat anti-menselijke CD49f bij een concentratie van 1:50 en geit anti-muis / rat integrin alpha 8 bij een concentratie van 1: 100. </li><li> De volgende dag bereiden twee afzonderlijke 1,5 ml microcentrifugebuizen die 500 μl PBS per monster bevatten. Was de snijplakken twee keer gedurende 1 uur bij kamertemperatuure. </li><li> Bereid aparte 1,5 ml microcentrifugebuizen die 500 μl PB buffer bevatten met de juiste concentratie van toepasselijke secundaire antilichamen en 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI). OPMERKING: De secundaire antilichamen die in dit voorbeeld worden gebruikt zijn Alexa Fluor 488 ezel anti-rat IgG en Alexa Fluor 555 ezel anti-geiten IgG in een concentratie van 1: 500. DAPI werd gebruikt bij een concentratie van 1: 100. </li><li> Verzorg de huidmonsters zorgvuldig in de PB buffer, die het secundaire antilichaam en DAPI bevat, en incubeer de huidschijven bij kamertemperatuur gedurende 1 uur bij een lage snelheid op een rotator of shaker. </li><li> Bewaar de plakjes bij 4 ° C in de PB buffer die het secundaire antilichaam en DAPI bevat gedurende maximaal vier dagen, en mogelijk langer als natriumazide aan de PBS wordt toegevoegd. </li></ol><img alt="Figuur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig3.jpg" /> Figuur 3. ImmunofluorescEtikettering en montage. (A) De drijvende weefsel doorsneden kunnen worden opgeslagen in 12-putsplaten gedurende ten minste twee dagen bij 4 ° C. Voordat immunofluorescerende (IF) etikettering de overige delen van het weefsel overbrengen in 1,5 ml microcentrifugebuizen die PB buffer bevatten om te blokkeren, zoals aangegeven door pijl 1. Voor IF-etikettering, houden u aan bij de multi-step procedure die in stap 3 is uitgewerkt. Onderdeel van stap 3 vereist de zorgvuldige overdracht van de weefsel dwarsdoorsneden in vers bereide microcentrifugebuizen die primaire antilichaamoplossing, secundaire antilichaamoplossing of wasbuffer bevatten, die door pijl 2 wordt aangegeven. ( B ) na de IF-etikettering, Secties worden ontrafeld en platgedraaid in een druppel glycerol, met behulp van de hulp van een dissectiemicroscoop. ( C ) Zodra het weefsel dwarsdoorsnede volledig op de bodem van een deklaag is afgemaakt, wordt er een regelmatige microscoopschuif gebruikt om het gedeelte te monteren. <aHref = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien. 4. Montage voor microscopische visualisatie <ol><li> Voorafgaand aan beeldvorming, overdracht van de huidplakken naar aparte microcentrifugebuizen die 500 μl PBS bevatten om de secundaire antilichamen en DAPI weg te wassen. </li><li> Gebruik een 1000 μL pipet, maar snijd de eerste 0,5 cm van de pipettip af om de juiste pipettering van het sterk viskeuze glycerol mogelijk te maken. Plaats een 22 x 50 mm deklaag op een donkere achtergrond onder een dissectiemicroscoop ( Figuur 3b ). </li><li> Voeg één druppel 100% glycerol op de deklaag toe ( Figuur 3b ). Breng de huidschijf van de microcentrifugebuis over op de glyceroldruppel. Gebruik de dissectiemicroscoop en de spitse tang om de huidschijfjes die opgerold zijn, zorgvuldig te ontspannen. OPMERKING: als de schijf in de gly drijftCerol druppel, kan het untangled worden door de natuurlijke geneigdheid van het weefsel te coaxeren om terug te keren naar zijn normale vorm. Doe niet de onnatuurlijke rechthoek van de plak, want dit kan schade aan het weefsel veroorzaken. </li><li> Monteer het weefsel zodra de gehele lengte van het huidgedeelte correct is georiënteerd en plat op de deklaag Gebruik een regelmatige microscoopschuif. Deze stap zal de huidschijf verder uitlijnen. OPMERKING: Vermijd luchtbevestiging ( Figuur 3c ). </li><li> Afbeelding in de glycerol-gemonteerde huid secties binnen de komende twee dagen. OPMERKING: Langdurige opslag heeft een weerslag op de weefsel- en beeldkwaliteit. In dit voorbeeld werden alle beelden verkregen met een oprechte confocale microscoop met een 20x doelstelling. </li></ol>

<ol><li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+dermal+BMP+signalling+regulates+stem+cell+activation+during+hair+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration.</a> Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).</li>
<li>Zhang, Y. V., Cheong, J., Ciapurin, N., McDermitt, D. J., Tumbar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+self-renewal+and+differentiation+phases+in+the+niche+of+infrequently+dividing+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct self-renewal and differentiation phases in the niche of infrequently dividing hair follicle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 267-278 (2009).</li>
<li>Jensen, U. B., Lowell, S., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+relationship+between+stem+cells+and+their+progeny+in+the+basal+layer+of+human+epidermis%3A+a+new+view+based+on+whole-mount+labelling+and+lineage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The spatial relationship between stem cells and their progeny in the basal layer of human epidermis: a new view based on whole-mount labelling and lineage analysis.</a> Development. 126 (11), 2409-2418 (1999).</li>
<li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment%3A+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li>
<li>Driskell, R. R., Giangreco, A., Jensen, K. B., Mulder, K. W., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2-positive+dermal+papilla+cells+specify+hair+follicle+type+in+mammalian+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sox2-positive dermal papilla cells specify hair follicle type in mammalian epidermis.</a> Development. 136 (16), 2815-2823 (2009).</li>
<li>Niculescu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+ablation+of+integrin+alpha-6+in+mouse+epidermis+leads+to+skin+fragility+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional ablation of integrin alpha-6 in mouse epidermis leads to skin fragility and inflammation.</a> Eur J Cell Biol. 90 (2-3), 270-277 (2011).</li>
<li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basement+membrane+of+hair+follicle+stem+cells+is+a+muscle+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche.</a> Cell. 144 (4), 577-589 (2011).</li>
<li>Desciak, E. B., Maloney, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artifacts+in+frozen+section+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatol+Surg%22%5BJournal%5D)">Artifacts in frozen section preparation.</a> Dermatol Surg. 26 (5), 500-504 (2000).</li>
<li>Driskell, R., Jahoda, C. A., Chuong, C. M., Watt, F., Horsley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+dermal+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Defining dermal adipose tissue.</a> Exp Dermatol. 23 (9), 629-631 (2014).</li>
<li>Driskell, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+fibroblast+lineages+determine+dermal+architecture+in+skin+development+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair.</a> Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).</li>
<li>Snippert, H. J., Schepers, A. G., Delconte, G., Siersema, P. D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slide+preparation+for+single-cell-resolution+imaging+of+fluorescent+proteins+in+their+three-dimensional+near-native+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Slide preparation for single-cell-resolution imaging of fluorescent proteins in their three-dimensional near-native environment.</a> Nat Protoc. 6 (8), 1221-1228 (2011).</li>
<li>Sada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+cellular+lineage+hierarchy+in+the+interfollicular+epidermis+of+adult+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Defining the cellular lineage hierarchy in the interfollicular epidermis of adult skin.</a> Nat Cell Biol. 18 (6), 619-631 (2016).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23722210">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
<li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacement+of+Lost+Lgr5-Positive+Stem+Cells+through+Plasticity+of+Their+Enterocyte-Lineage+Daughters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).</li>
</ol>

De auteurs zouden willen onthullen dat de publicatie van dit manuscript werd gefinancierd door Thermo-Fisher Scientific Inc.

Hier presenteren we de "horizontale gehele montage" techniek, die verschillende voordelen heeft ten opzichte van klassieke bevroren secties. Een voordeel van onze techniek is dat deze gemakkelijk kan worden uitgevoerd met standaard histologie-apparatuur en een confocale microscoop. Ten tweede wordt de weefselintegriteit op een superieure manier behouden in vergelijking met standaard cryosecties. Bijvoorbeeld, adipocyten binnen de hypodermale laag (d.w.z. dermale witte adipocyten (DWAT))9 zijn ernstig verstoord in standaard cryosecties, wat het bestuderen van weefsels die vet bevatten onmogelijk maakt. Onze techniek maakt de volledige analyse van de adipocyten in deze laag mogelijk en kan worden aangepast aan andere weefsels met een hoog adipocytengehalte. Bovendien maakt dit een betere detectie van mesenchymale cellen mogelijk in lijn-traceringsstudies 2,10. 
Standaard cryosecties kunnen door hun aard nooit de ware 3D-aspecten van een weefsel onthullen via confocale microscopie. Dit betekent dat dikkere secties voordelig zijn bij de analyse van huid, aangezien haarfollikels, evenals hun substructuren, een diepte kunnen doorkruisen die de standaarddikte van 10 µm overschrijdt die wordt gebruikt in klassieke crysosecties. We zijn geïntrigeerd dat andere weefsels, zoals de darm en de hersenen, bijvoorbeeld vergelijkbare uitdagingen hebben met betrekking tot het bekijken van het weefsel als een 3D-structuur2,7,11,12,13. Opmerkelijk is dat onze techniek al als nuttig is bewezen voor gebruik in bepaalde toepassingen in de darmen14. We geloven dat ons horizontale gehele-montage protocol het potentieel heeft om op elk ander weefsel toegepast te worden dat een 3D-analyse vereist.

De omwenteling van microscopische beeldapparatuur zorgt voor geavanceerde beeldvormingsinstrumenten met hoge resolutie. Bij het verwerven van een microscopische afbeelding van een complete driedimensionale (3D) weefsel dwarsdoorsnede, levert het voorbereiden van een monster aanzienlijke uitdagingen op en kan de beperkende factor zijn bij de bepaling van de beeldkwaliteit. Elke afzonderlijke stap verdient een zorgvuldige overweging om de weefselmorfologie en de antigeniciteit van doelwit proteïnen te behouden, om verwerkingsgeïnduceerde artefacten te minimaliseren en de uiteindelijke beeldkwaliteit te maximaliseren. Bijvoorbeeld, de traditionele analyse van de huid vereist een beeld met het oog op de epidermis en dermis, met haarfollikels die goed zijn georiënteerd, waardoor de anatomische analyse van stamcellencompartimenten aan de homeostase 1 , 2 van de huid mogelijk is . Dit vereist een grondige concentratie op hoe de huid ingebed en gesneden is. Het is belangrijk dat haarfollikels dikker zijnDan 100 μm, die de standaard paraffine of bevroren sectie dikte aanzienlijk overschrijdt, wat resulteert in een lagere standaard van analyse ten opzichte van gehele montages of dikke dwarsdoorsneden 3 , 4 , 5 . Samengevat is elke stap van het voorbereiden van het monster voor microscopische analyse een kritische determinant die beeldanalyse zal beïnvloeden. Hier wordt een nieuw verwerkingsprotocol voor dikke 3D-weefsel-doorsnede-analyse, die we &quot;horizontale gehele berg&quot; noemen, gepresenteerd. Het protocol behoudt de antigeniciteit sterk en maakt het mogelijk om dikke delen van de huid optimaal te gebruiken door gebruik te maken van standaard confocal beeldvormende apparatuur. Dit is een complete gids voor het gebruik van de huid voor het verwerken en imaging van weefsel dwarsdoorsnede, inclusief weefseloogst en paraformaldehyde (PFA) -assistente cryopreservering (stap 1), de generatie van 100 μm dikke weefsel dwarsdoorsneden met een cryostat (stap 2), En immunofluorescente etikettering en montage (stappen 3 en 4). De representatieve resultaten vergelijken confocale beelden van twee verschillende histologische voorbereidingstechnieken-klassieke cryosectie en dikke 3D-weefsel dwarsdoorsneden-de voordelen van &quot;horizontale gehele mounts&quot; voor de potentiële gebruiker van dit protocol te benadrukken.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>zelfgemaakt</td></tr><tr><td>Gelatine, van huid van koude watervissen</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>250ML</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>BDH Laboratory Supplies</td><td>444482V</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. compound</td><td>VWR chemicals</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way inbeddingsvormen</td><td>Sigma</td><td>E6032-1CS</td><td>Vierkante S-22</td></tr><tr><td>Zuivere melkpoeder</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>NB0669</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>500ML</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-fenylindole, dilactaat (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Human CD49f</td><td>BD Pharmingen</td><td>555735</td><td></td></tr><tr><td>Muis/Ratten Integrin alpha 8 Antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF4076</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ezel anti-rat IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 ezel anti-geit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21432</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100mm kweekschalen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wegwerp scalpels</td><td>Swann-Morton</td><td>Ref 0501</td><td></td></tr><tr><td>Gespite metalen pincetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml microcentrifugebuisjes</td><td>VWR</td><td>211-2130</td><td></td></tr><tr><td>12 wel platen</td><td>Sigma</td><td>CLS3513</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ul en 1000 ul Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1000&micro;l XL Gespleten TipOne Filter Tip (Steriele)</td><td>Star Lab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>20&micro;l Bevelled TipOne Filter Tip (Steriele)</td><td>Star Lab</td><td>S1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>Roterende shakerplaat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglazen, menzel Glaeser</td><td>Thermos Scientific</td><td>631-9483</td><td>Superfrost Plus</td></tr><tr><td>Dekglazen, Menzel Glaeser</td><td>Thermos Scientific</td><td>MENZBB024060AB</td><td>24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

horizontale gehele berging: een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel dwarsdoorsneden van de huid

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Het verwerken van een weefsel van belang om een ​​microscopisch beeld te genereren dat een wetenschappelijk argument ondersteunt, kan uitdagend zijn. De aanschaf van microscopische beelden van hoge kwaliteit is niet volledig afhankelijk van de kwaliteit van de microscoop, maar ook op de weefselsverwerking, die vaak meerdere kritische acties of stappen omvat. Bovendien vormen mesenchymale celsoorten in de huid en andere weefsels een nieuwe uitdaging voor weefselbereiding en beeldvorming. Hier presenteren we een compleet proces, van weefsel oogst naar microscopie. Onze techniek, genaamd &quot;horizontale gehele berg&quot;, is een die beginners snel kunnen begrijpen en die het mogelijk maakt om antigeen te behouden en te detecteren in 60-300 μm dikke delen die met een cryostat worden gesneden. Afdelingen van deze dikte zorgen voor een verbeterde visualisatie van weefselmicroarchitectuur in een driedimensionale omgeving. Daarnaast behoudt het protocol mesenchymale cellen op een manier die de beeldkwaliteit verhoogt wanneerVergeleken met standaard cryostat of paraffine secties, waardoor de werkzaamheid en betrouwbaarheid van immunostaining verhoogd worden. Wij geloven dat dit protocol alle laboratoria die de huid visualiseren, en eventueel andere weefsels en organen zullen kunnen profiteren.

Om de voordelen van onze techniek te benadrukken hebben we onze dikke 3D-weefsel doorsnedechniek, &quot;horizontale gehele berg&quot;, vergeleken met klassieke bevroren delen. Klassieke bevroren delen werden gesneden zoals eerder beschreven 5 . Om een ​​visuele structuur voor de epidermis in te microscopische beelden te geven, immunostainen we voor integrin alpha-6 (Itga6), dat een component is die epidermale cellen verankert naar het onderliggende keldermembraan 6 . We hebben ook de arrector pili spier (APM) genoemd, die verantwoordelijk is voor piloerectie (ook bekend als &quot;goosebumps&quot;), met integrin alpha-8 7 . In de klassieke bevroren secties werden de meeste haarfollikels die met Itga6 werden zichtbaar niet doorsneden over de gehele lengte, waardoor overwegend onvolledige haarfollikels per sectie werden genereerd in vergelijking met horizontale gehele mounts ( Figuur 4a -4d </strong&gt;). Dikke weefsel dwarsdoorsneden maken het mogelijk om meer Z-stapel lagen te verwerven in vergelijking met conventionele 10 μm secties, waardoor een vollediger 3D-afbeelding mogelijk is. Dit wordt nog duidelijker bij het bestuderen van de integriteit van APM&#39;s, die geassocieerd zijn met de haarfollikels en het overliggende keldermembraan. In klassieke cryosecties werden het grote gedeelte van APM&#39;s gefractioneerd ( Figuur 4a -4d ). Daarnaast wordt de weefselintegriteit van het hypodermale compartiment bewaard in horizontale gehele mounts, in vergelijking met de vernietiging van adipocyten wanneer cryosecties zijn gehecht aan glazen glijbanen, die een bekend bevriezing ontdooft artefact is ( Figuur 4a- b , vergelijk hypodermale Regio&#39;s) 8 . <img alt="Figuur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig4.jpg" /> Figuur 4. Horizontale gehele mouNt vergeleken met een klassieke cryosectie. (A) Klassiek verkregen huid vriescoupes 10 urn dik en (b) 100 urn dikke 3D weefsel doorsneden werden gemerkt met integrine alfa-6 (Itga6) en integrine alfa-8 (Itga8) te visualiseren de epidermale compartiment en arrector pili spieren , Respectievelijk. De afbeeldingen van de dikke weefsel dwarsdoorsneden worden weergegeven als maximale projecties van een grote Z-stack. De witte frames geven aan op de gebieden die worden vergroot, weergegeven in ( c ) de klassieke en ( d ) horizontale gehele bergafdelingen. ( E ) Intacte haarfollikels en ( f ) intacte arrector-pili-spieren werden gekwantificeerd in zowel de klassieke als de horizontale gehele secties. Schaalstaven geven 100 μm aan. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaardfout van de gemiddelde (SEM). Een sectie per biologisch replicaat ( n = 3) werd gekwantificeerd. Unpaired t-test * P &lt;0,05, *** P &lt;0,0005. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit werk presenteert een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel doorsnede analyse die de volledige exploitatie van confocale beeldvormingsmodaliteiten mogelijk maakt. Dit protocol behoudt de antigeniciteit en vertegenwoordigt een robuust systeem om huidhistologie en mogelijk andere weefstypen te analyseren.

Horizontale gehele berging: Een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel dwarsdoorsneden van de huid

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Het algemene doel van dit histologische en beeldvormingsprotocol is het presenteren van een robuust systeem dat de epitop-antigeniciteit en de structurele integriteit van de huid behoudt, wat volledige benutting van confocale beeldvormingsmodaliteiten mogelijk maakt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen waarbij het noodzakelijk is om de aard van elk type cel binnen een complexe driedimensionale weefselarchitectuur te onderzoeken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van standaard histologische technieken is dat deze robuust en eenvoudig uit te voeren is.Daarnaast vormt het protocol een perfecte aanvulling op driedimensionale analyse via confocale microscopie. Begin met het trimmen van huid, geoogst uit de dorsomediale regio van een muis, tot rechthoekige stukjes. Elk stuk moet een afmeting hebben die past in de bodem van een cryomold.Hier wordt een gebied van één vierkante centimeter dorsale huid gedemonstreerd dat in een cryomold van 22 millimeter bij 30 millimeter bij 20 millimeter past. Duw na fixatie de gewassen huid naar de bodem van de met OCT gevulde mold, zodat deze vlak op de bodem ligt. Markeer de oriëntatie van de haarzakjes op de cryomold, aangezien dit de oriëntatie van de cryostaat-snede bepaalt.Plaats de cryoblokken op een metalen plaat in een vriezer van -80 °C om drijven en verschuiving van het weefsel te voorkomen. Bewaak het vriesproces om de oriëntatie van de huid onderin de cryomall te behouden, aangezien onzichtbare luchtbellen ervoor kunnen zorgen dat de huid naar het oppervlak van de cryomall stijgt. Begin met het bevestigen van een bevroren cryoblok aan de tafel van een cryostaat, waarbij de oriëntatie van de haarfollikels langs het snijvlak wordt aangehouden, zoals aangegeven op de cryomall.Een juiste afstelling van de exacte oriëntatie van de haarzakjes op de cryostaat is cruciaal, aangezien deze stap het snijvlak bepaalt dat huidcoupes genereert waarbij de volledige lengte van de haarzakjes intact blijft. Gebruik de cryostaat om een sectie van 100 micron te snijden. Pak het OCT rondom het ingebedde stuk huid vast met een pincet en breng de sectie vanuit de cryostaat over naar de 100 millimeter kweekschaal gevuld met PBS.Bij kamertemperatuur zal de PBS het OCT oplossen, waardoor de huidcoupes eenvoudig met een pincet te hanteren zijn. Gebruik na het snijden een pincet om de drijvende huidcoupes over te brengen naar de putjes van een 12-wells plaat die 2,5 milliliters PBS bevat. Begin de immunofluorescente labeling door eerst 500 microliters PB-buffer toe te voegen aan gelabelde 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes.Gebruik voorzichtig een pincet om de huidcoupes van de 12-wells plaat over te brengen naar de buisjes voor blokkeren. Zorg ervoor dat alle huidcoupes volledig ondergedompeld zijn. Plaats de microcentrifugebuisjes op een schommelplateau bij 10 oscillaties per minuut of minder, gedurende één uur bij kamertemperatuur.Label aparte microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter voor elke huidsectie en voeg 500 microliters PB-buffer toe met de juiste hoeveelheid primair antilichaam. Na één uur blokkeren worden de huidsecties overgebracht naar de vers bereide buisjes met de antilichamen. Incubeer de secties gedurende de nacht bij vier graden celsius op lage snelheid op een rocker.Breng de volgende dag de coupes over naar 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes met 500 microliters PBS en was deze gedurende één uur bij kamertemperatuur op een schudplatform. Breng de coupes vervolgens over naar afzonderlijke 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes met 500 microliters PB-buffer met de juiste concentratie secundaire antilichamen en DAPI. Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur onder schudding; indien gewenst kunnen de monsters tot vier dagen bij vier graden celsius worden bewaard tot verdere verwerking.Verplaats de huidcoupes vóór de beeldvorming naar afzonderlijke microcentrifugebuisjes met 500 µL PBS om de secundaire antilichamen en DAPI uit te wassen. Plaats vervolgens een dekglas van 22 mm bij 50 mm op een donkere achtergrond onder een dissectiemicroscoop. Gebruik daarna een 1.000 µL pipet waarvan het uiteinde van de tip is afgesneden om één druppel 100% glycerol op het dekglas aan te brengen.Breng de huidsnede over van de microcentrifugebuis naar de glyceroldruppel. Gebruik vervolgens, terwijl u door de dissectiemicroscoop kijkt, een pincet met fijne punten om de opgerolde huidsneden voorzichtig uit te rollen door ze terug te leiden naar hun natuurlijke vorm terwijl ze in glycerol drijven. Forceer het rechtmaken van de snede niet, omdat dit weefselschade kan veroorzaken.Zodra de volledige lengte van de sectie correct is georiënteerd en vlak op het dekglas ligt, wordt het weefsel op een standaard microscoopglaasje gemonteerd; deze stap zal de huidslice verder rechttrekken. Beeld de in glycerol gemonteerde huidsecties binnen de volgende twee dagen af.Deze afbeelding toont een klassiek verkregen huidcryosnit van 10 micron dik, gelabeld met integrine alfa zes en integrine alfa acht, om respectievelijk het epidermale compartiment en de musculi erectores pilorum te visualiseren. Deze 100 micron dikke 3D-weefseldwarsdoorsnede is op dezelfde wijze gelabeld. De getoonde afbeelding is de maximale projectie van een grote z-stapel.Details van beide afbeeldingen worden hier naast elkaar vergeleken; in de klassieke cryosneden waren de meeste haarzakjes die met integrine alfa zes waren gevisualiseerd niet over de gehele lengte gesneden, waardoor er per sectie voornamelijk onvolledige haarzakjes ontstonden, vergeleken met horizontale whole mounts. Intacte haarzakjes en intacte musculi arrector pili werden gekwantificeerd in zowel de klassieke als de horizontale whole mount secties. Er werd één sectie per biologisch replica gekwantificeerd; zoals hier te zien is, heeft de whole mount sectie een hoger aandeel intacte follikels en musculi arrector pili.Zodra deze cryosectie-techniek onder de knie is, kan deze worden uitgevoerd met een snelheid van meer dan 15 secties per minuut, waarbij perfect georiënteerde monsters worden verkregen mits het inbedden correct is uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe dikke weefseldwarsdoorsneden in een driedimensionale omgeving moeten worden verwerkt en geanalyseerd.

horizontal-whole-mount-novel-processing-imaging-protocol-for-thick

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Om de veranderingen van nociceptieve intraepidermal zenuwvezels (IENFs) in pijnlijke neuropathieën (PN) te bestuderen, ontwikkelden we protocollen die direct kon onderzoeken driedimensionale morfologische veranderingen waargenomen in nociceptieve IENFs. Drie-dimensionale analyse van IENFs heeft de potentie om de morfologische veranderingen van IENF in PN evalueren.

Driedimensionale beeldvorming van Nociceptieve Intraepidermal zenuwvezels in Menselijke huid Biopsieën

We presenteren een benadering voor beeldregistratie voor reconstructie van 3-dimensionale (3D) histologievolumes, die het onderzoek naar de veranderingen van een orgaan op het niveau van macrostructuren van cellen vergemakkelijkt. Met behulp van deze aanpak hebben we de 3D-veranderingen tussen wild-type en Igfbp7-null borstklier beoordeeld.

Reconstructie van 3-dimensionale Histologie Volume en de toepassing ervan te studeren Mouse borstklieren

Zoogdierhuid bevat een divers scala aan structuren - zoals haarfollikels en zenuwuiteinden - die onderscheidend patronen van ruimtelijke organisatie vertonen. Het analyseren van de huid als een platte berg maakt gebruik van de 2-dimensionale geometrie van dit weefsel tot volledige dikte van hoge-resolutie afbeeldingen van de huid structuren te produceren.

Flat Mount beeldvorming van de huid van muizen en de toepassing ervan op de Analyse van Haarzakje Patterning en Sensorische Axon morfologie

Dit rapport beschrijft een KUBIEKE protocol om de volledige dikte muis huid biopten te verduidelijken en te visualiseren eiwit expressie patronen, delende cellen, en sebocyten bij de enkele resolutie cel in 3D. Deze methode maakt een nauwkeurige evaluatie van de huid anatomie en pathologie, en abnormale epidermale fenotypes in genetisch gemodificeerde muis lijnen.

CUBIC Protocol Visualiseert Protein Expression op enkel cel resolutie in Whole Mount Skin Voorbereidingen

In dit manuscript presenteren we een hoogdoorvoerige, semi-geautomatiseerde cryohistologieplatform om gealignde composietbeelden te produceren van meerdere responsmaatregelen uit verschillende rondes van fluorescentiebeeldvorming op bevroren secties van gemineraliseerde weefsels.

High-throughput, Multi-Beeld Cryohistology gemineraliseerde weefsels

Dit protocol beschrijft een nieuwe werkwijze voor de vergelijking van 3D gehele hart hartspierweefsel met MRI. Dit is bedoeld voor nauwkeurige vaststelling van intramyocardiale injecties in het infarct grensgebied van een chronische varkensmodel van myocardiaal infarct.

3D Whole-hart myocard Tissue Analyse

Hier beschrijven we een hoge resolutie geheel-mount beeldvorming methode in de hele volwassen muis oor huid, waarmee we kunnen visualiseren vertakkende genuitdrukking en patronen van perifere zenuwen en bloedvaten, evenals immuun cel distributie.

Geheel-mount confocale microscopie voor volwassen oor huid: een modelsysteem om te studeren, Neuro-vasculaire vertakkende genuitdrukking en immuun cel distributie

De focus van de huidige studie is om aan te tonen van de gehele-mount immunokleuring en visualisatie techniek als een ideale methode voor 3D beeldvorming van vetweefsel architectuur en cellulaire component.

Visualisatie van 3D witte adipeus weefsel structuur met behulp van geheel-mount kleuring

Hier beschrijven we een procedure die orgaanbrede detectie van pathogene bacteriën tijdens infectie en kwantificering van fluorescerende reporteractiviteiten mogelijk maakt.

Driedimensionale tomografie van het hele orgaan met hoge resolutie van microbiële infecties

De combinatie van iteratief-bleken-extends-multiplexity (IBEX) en een commerciële nucleotide-labelingtest (Click-iT EdU) maakt de detectie en categorisatie van delende celtypen mogelijk in zeer dynamische processen in gefixeerde ingevroren muizenweefselsecties. Bovendien biedt een nieuwe open-source beeldverwerkingspijplijn beeldacquisitie en -analyse met hoge doorvoer.

High-throughput beeldvormings- en analyseworkflow voor het evalueren van fenotypes en proliferatietoestanden van huidcellen in weefselmonsters

Dit artikel beschrijft een protocol voor multiplex-immunofluorescentie dat is geoptimaliseerd om de driedimensionale architectuur van peritoneale metastasen te karakteriseren.

Driedimensionale beeldvorming van tumordragend weefsel met behulp van de iteratieve bleking breidt de multiplexiteitsbenadering uit

Leer een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefseldwarsdoorsneden van muizenhuid. Deze methode behoudt antigeniteit en structurele integriteit voor confocale microscopie.

Horizontale gehele berging: Een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel dwarsdoorsneden van de huid (Video) | JoVE Journal

Horizontale gehele berging: Een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel dwarsdoorsneden van de huid

Meer video's verkennen